그리고 찰스 H. 후드 재단 영 인베스티게이터 아동 건강 연구 수상 (보스톤, MA)에 의해 -이 작품은 부분적으로 아동 보건 인간 발달의 국립 연구소 (R21 HD059015 NICHD)의 생식 도서관에 의해 투자되었다.

1. 높은 GC 풍부한 KISS1R 유전자 시퀀스의 사이트 이동 돌연변이 유발 <ol><li> 템플릿 : 자사의 N - 말단에 융합 Myc 태그와 인간 KISS1R의 전체 cDNA 시퀀스. 이 순서는 이후 transfections에 사용되는 포유 동물 세포 라인과 호환되는 pCS2 + 발현 벡터로 복제됩니다. 이 발현 벡터는 pCS2 + Myc KISS1R로 여기라고합니다. </li><li> 뇌관 디자인 : primers이 Quikchange 사이트 감독 돌연변이 유발 키트 (Stratagene)의 지시에 따라, 원하는 돌연변이 들고하도록 설계되었습니다. 요약 : <ul><li> 모두 (순방향 및 역방향) primers 원하는 변이를 포함하여 플라스미드의 반대 가닥에서 동일한 순서로 어닐링해야합니다 (예 : 순방향 및 역방향 primers 서로 보완) <img src="/files/ftp_upload/2897/step1.jpg" alt="1 단계" /></li><li> Primers는 하나 이상의 C 또는 G 기지에서 25-45 기지 긴 주말이 될 <img src="/files/ftp_upload/2897/step2.jpg" alt="2 단계" /> <img src="files/ftp_upload/2897/step3.jpg" alt="3 단계" /></li><li> 도입 돌연변이 (들)은 프라이머의 한가운데에와 양쪽에 올바른 순서 ~ 10-15 기지 둘러싸인해야 </li><li> primers의 용해 온도 (TM)는 같거나 78 ° C.보다 커야한다 TM을 추정하기 위해 다음 수식을 사용하여 <ul><li> 변이를 소개하는 경우 : TM = 81.5 + 0.41 (% GC) - 675 / N - % 불일치 (N은 기지의 뇌관 길이입니다) </li><li> 삽입 또는 삭제를 소개하는 경우 : TM = 81.5 + 0.41 (% GC) - 675 / N (N은 삽입 또는 삭제되는 기지 포함되지 않습니다) </li><li> desalted primers를 (넘어올 purifications 필요)를 사용합니다. <img src="/files/ftp_upload/2897/step4.jpg" alt="4 단계" /></li></ul></li></ul></li><li> 최고의 증폭 조건은 PCRx 향상제 용액 (Invitrogen)와 DMSO를 추가할 수 있습니다. 이러한 4퍼센트 8 %로 DMSO의 최소한 2 농도는, 테스트해야합니다. 그리고 pCS2 + MycKISS1R의 대표적인 PCR 증폭 결과 그림 2에 표시됩니다, PCR 조건은 I 및 그림 1에서이 테이블에 표시됩니다. </li><li> 37 1 시간 30 분 대한 DpnI과 methylated DNA의 소화에 의해 증폭 제품에 대한 부모의 DNA를 제거 ° C : 10X NEBuffer의 2μl 4 DpnI의 0.5μl (10U, 뉴 잉글랜드 Biolabs)로 PCR 제품의 원심 분리기 튜브 17.5μl에 섞는다. </li><li> XL10 - 골드 Ultracompetent E.의 45μl와 DpnI - 치료 DNA의 믹스 2μl : 변환 PCR 제품을 DpnI - 대우 사전 냉장 15 ML의 세포 배양 튜브에 대장균 (Stratagene). β - 메르 캅 토 에탄올의 2μl을 추가하고 Stratagene 지침을 따르십시오. 플레이트 37 100μg/ml 암피실린 및 부화를 포함한 LB - 한천 플레이트의 변형 박테리아 100 - 400μl ° C. </li><li> Miniprep 2-4 각 식민지는 플라스미드 DNA를 분리합니다. 절연 DNA의 시퀀싱과 분석에 의해 원하는 돌연변이의 성공적인 도입을 확인합니다. </li></ol> 2. HEK - 293 세포에 transfection MycKISS1R의 과도 <ol><li> 다음 실험은 37 CO 2 배양기 (5 % CO 2)에서 교양 인간의 배아 신장 세포 (HEK - 293)에서 수행되는 ° DMEM에서 C 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신과 보완. </li><li> 시드 HEK - 293 6 - 잘 접시에 2.5x10 5 셀 / ML에서 세포들을 37 밤새기를 ° transfection 전에 C. 참고 : (I) 각 실험 조건에 대한 세중의의 우물을 사용하고, (ii) transfection 시에 이상적인 셀 합류 30 % -50 %입니다. </li><li> Transfect HEK - 293 제조 업체의 지침에 따라 GenePorter의 Transfection 시약 (Genlantis)를 사용하여 셀과 함께 혈청없는 DMEM의 혼합 절반 0.5μg pCS2 + MycKISS1R 플러스 0.5μg 제어 (빈) DNA / 음의 1μg 정리하다 벡터. transfected DNA의 μg 당 10μl transfection 시약과 나머지 절반을 섞는다. 참고 : 이상적인 플라스미드 DNA 농도는 다를 수 있습니다. </li></ol> 3. 세포 치료 및 용해 <ol><li> transfection 후 24 시간, 1ml DMEM 2.5 % FBS를 (세포 신진 대사를 감소)이있는 세포와 매체를 교체하십시오. 참고 : 혈청에있는이 감소는 촉진 및 / 또는 결과의 검색을 증폭 수도 있습니다. </li><li> 직접 한 전체 6 - 잘 플레이트의 각 우물에 lysosome 억제제 (100μg / 잘 류펩틴의) 추가합니다. ° C 6 H 16 (또는 다른 원하는 시간) 37에 품어 </li><li> 바로이 전체 6 - 잘 접시의 우물에 신선한 proteasome 억제제 (10μM / 물론 MG132의) 추가합니다. ° C 2, 4, 6 또는 16h (또는 원하는 시간)에 37 알을 품다. 네 번째 6 자 플레이트 (0 시간 시점)의 우물에 차량을 추가하고 37 품어 ° 16h에 대한 C </li><li> 배양이 끝난 때, 얼음 접시를 이동하고 단백질 저하를 방지하기 위해 얼음이 전체 용해 절차를 수행 : <ul><li> 단백질 수율을 증가하기 위해, 단일 centr 6 - 잘 접시에 triplicates을 결합ifuge 튜브 </li><li> 얼음처럼 차가운 인산의 1ml로 한 중간 및 세척 세포를 대기음 호수 (PBS)는 버퍼 </li><li> 단백 분해 효소 억제제 (100mM AEBSF - HCL, 80μM aprotinin, 5mM bestatin을 포함 1X 칵테일을 포함하는 얼음처럼 차가운 용해 버퍼의 100μl를 (20mM HEPES, pH를 7.4, 1 % NP - 40, 150mM NaCl, 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.25 %의 나트륨 deoxycholate) 추가 각 잘하는 1.5mM E - 64, 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 2mM 류펩틴 및 1mM pepstatin, 플러스 2mM PMSF) </li><li> 휴대 스크레이퍼 및 전송 세포와 세포가 제거 튜브를 원심 분리기에 lysates </li><li> 20 게이지 바늘을 통해 세포에게 ~ 10 번 패스. 참고 : 막 단백질 서양 얼룩 검출을위한 샘플을 sonicate하지 마십시오. Sonication는 전기 영동하는 동안 제대로 마이 그 레이션되지 않습니다 막 단백질의 집합에 연결 </li><li> 락을 플랫폼 4 ° C에서 1 시간에 대한 세포 lysates을 품어 </li><li> 4 원심 분리기 세포 lysates ° 10,000 X의 RPM과 새로운 튜브로 전송 supernatants 10 분 C. 참고 :이 단계에서 알약을 방해하지 마십시오 </li><li> BCA 방법을 사용 supernatants의 10μl의 단백질 농도 (피어스)을 결정 </li><li> 단백 분해 효소 억제제를 포함하는 용해 버퍼 1mg/ml에 lysates을 희석. </li></ul></li></ol> 4. Immunoprecipitation 및 MycKISS1R 서양 얼룩 검출 <ol><li> 얼음에서 다음 immunoprecipitation 단계 (또는 4 ° C)를 수행 : <ul><li> 얼음처럼 차가운 PBS로 두 번 아가로 오스 - 복합 백신 myc 항체 (2.5μg / 샘플)의 적절한 금액을 씻고 lysate의 단백질 400μg 이것을 추가합니다. </li><li> lysates에 MycKISS1R을 Immunoprecipitate 4 박 ° 부드러운 교반과 락을 플랫폼에서 C. </li><li> 4 펄스 원심 분리에 의해 아가로 오스 비즈를 스핀 ° C (최대 10,000 X RPM) </li><li> supernatants를 (알약을 방해하지 않고) 대기음 및 폐기 </li><li> 얼음처럼 차가운 용해 버퍼와 두 번 얼음처럼 차가운 PBS로 한번 구슬 씻으십시오. 회전하기 전에 부드럽게 튜브를 반전 </li><li> 10% β - 메르 캅 토 에탄올을 포함하는 2X 샘플 로딩 버퍼 항체 - 바운드 MycKISS1R을 포함 Ressuspend 비즈. </li></ul></li><li> MycKISS1R의 immunocomplexes 서양 얼룩 : <ul><li> 37 30 분 ° C. 참고를위한 열 샘플 : 멤브레인 단백질 서양 얼룩 검출을위한 샘플을 끓여하지 마십시오. sonication 마찬가지로, 끓는 또한 이러한 단백질의 집합에 연결 </li><li> 5 분 얼음으로 즉시 튜브로 이동 </li><li> 4-15% 기울기 젤의 SDS - PAGE에 의해 분리 단백질. </li><li> 바이오 - 래드 세미 드라이 전송을 사용하여 전송 버퍼에서 30 분 (48mM 트리스베이스, 39mM 글리신, 1.2mM SDS, 20 % 메탄올, 산도 9.2)에 대한 25V에서 Immobilon - FL PVDF 막 (적외선 감지)로 전송 기구 </li><li> 로 상온에서 5 분 세포막을 씻으 트리스 버퍼 살린 (TBS)과 락을 플랫폼 (또는 TBS에 5 %의 우유가 아닌 특정 바인딩을 차단하는 데 사용할 수있는)에 차단 Licor 오딧세이와 함께 실온에서 1 시간을위한 블록. </li><li> 4 밤새 품어 세포막 ° 0.1 % 트윈 - 20을 포함 차단 솔루션 토끼 안티 - myc 항체 (1:500)와 C </li><li> 기본 항체를 제거하고 각 TBS와 0.1 % 트윈 - 20 (TBST)를 포함하는 5 분 중 세포막에게 3 회 씻어 </li><li> 0.1 % 트윈 - 20 0.01 % SDS를 포함하는 버퍼를 차단에서 염소 인프라 RedDye ® 800CW - 레이블 안티 토끼 IgG (1:10,000)와 실온에서 1 시간을위한 세포막을 품어 </li><li> 이차 항체를 제거합니다 (트윈 - 20 남은 제거) 만 TBS와 TBST 그리고 마지막으로 각 5 분의 세포막에게 3 회 씻어 </li></ul></li><li> 이미징 및 LI - COR 오딧세이 적외선 이미지 전송을 사용하여 MycKISS1R의 부량 : <ul><li> 안정에 MycKISS1R은 LI - COR 오딧세이 적외선 이미지 전송을 사용하여 몇 군데 것입니다. 시작하려면, 격자로 정렬, 오딧세이 스캐너의 왼쪽 하단 모서리에있는 멤브레인를 놓으십시오. 고무 매트와 커버, 롤러와 거품을 부드럽고 뚜껑을 닫습니다 </li><li> 컴퓨터에 새 프로젝트 파일을 만듭니다. 파일 이름을 &quot;완료&quot;를 클릭, 다음 &quot;검색&quot;에 스캐너 로그인을 입력합니다. 크기 스캐너 콘솔 사용자 막에 맞게 상자에 다음은 169μm 해상도와 중간 이미지 품질을 선택 </li><li> 각 신호의 강도에 따라 예상되는 700 (적색) 800 (녹색) 채널에 대한 강도 설정을 선택하십시오. 이것은 신호 시각화 목적으로하고 부량 영향을받지 않습니다. &quot;검사 시작&quot;을 클릭하십시오 </li><li> 스캔의 이름을 지정하고 저장 후, 부량위한 새로운 창을 열어 &quot;확인&quot;을 클릭합니다. MycKISS1R의 단량체는 약 43kD에 표시해야 </li><li> &#39;상자&#39;도구 (왼쪽 사이드바에서)를 사용하여 첫 번째 밴드 주위에 상자를 그립니다. 모든 밴드를 통해 &quot;복사&quot;와 &quot;붙여넣기&quot;상자에 다음 모든 밴드에 적합하도록 주변의 상자를 드래그 </li><li> 사용하여 모든 확인란을 선택하고 &#39;Ctrl + A는 &quot;그리고 중간 배경을 빼야하는 옵션을 선택합니다. 상단 메뉴에서 &quot;보고서&quot;및 부량 가치와 스프레드 시트가 나타납니다를 클릭합니다. 여기에 표시된 대표 결과가 represe 아르(시간 제로) 치료 세포를 통해 접이식 증가로 nted </li></ul></li></ol> 5. 대표 결과 : <ol><li> 높은 GC 풍부한 KISS1R 유전자 시퀀스의 사이트 감독 돌연변이 유발 : 표 1. KISS1R 증폭의 효율을 개선하기 위해 시약의 조합을 보여줍니다. 이 조합은 성공적으로 여러 KISS1R cDNA 시퀀스의 고유 영역에 대한 감독 돌연변이뿐만 아니라이 높은 GC 풍부한 유전자의 증폭에 대한 소개를하는 데 사용되고있다. 그림 1은 KISS1R의 돌연변이 유발을위한 사이클링 및 증폭 조건을 보여줍니다. 이러한 조건은 QuikChange 사이트 감독 돌연변이 유발 키트 (Stratagene)에서 수정되었습니다. 그림 2.이 최적화된 프로토콜을 사용하여 대표적인 결과를 보여줍니다. PCRx 확장기와 함께 4% 또는 8% DMSO의 또한 GC 풍부한 KISS1R cDNA 함유 플라스미드의 증폭의 수율을 크게 향상시킵니다. 이 대표 실험에서는 4 % DMSO는 8 % DMSO에 비해 약간 더 증폭 조건을 제공했습니다. ultracompetent E. 함께 DpnI - 대우 증폭 제품의 변형 대장균은 일반적으로 1000 식민지로 100을 산출하고, DNA 시퀀싱에 의해 결정 원하는대로 돌연변이의 성공적인 도입 율은 80-90%입니다. </li><li> 수용체의 생리를 공부 MycKISS1R 구조의 사용 : 이 대표 실험에서, 야생의 유형 pCS2 + MycKISS1R은 최적화된 프로토콜을 여기에 설명된 transiently MycKISS1R을 표현 관련 세포주에서 생체내 KISS1 수용체 저하 (HEK - 293)에서 공부하는 데 사용됩니다에 따라 증폭. 방법에서 설명하는 프로토콜에 따라 lysosome (류펩틴) 또는 proteasome (MG132) 억제제와 transfected HEK - 293 세포를 치료 후 세포가 lysed하고 서부 얼룩에 대한 처리. 하단 패널 상단 패널에 표시된 밴드의 부량를 보여줍니다 반면에 그림 3의 상단 패널 MycKISS1R의 단량체의 스캔을 보여줍니다. 밴드의 부량는 류펩틴 치료 6h이나 16h도가 MycKISS1R 단백질 수준에 영향을 나타냅니다. 반대로, MG132 MG132과 함께 치료와 부화 16h 후 수용체의 45 배 축적과 culminates 이러한 세포 MycKISS1R 단백질의 시간 의존 증가 결과. 이러한 관찰은 대부분의 G 단백질 결합 수용체 달리 KISS1R는 proteasome (오히려 lysosome 이상)에 의해 타락, 그 나타냅니다. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td> DMSO </td><td></td></tr><tr><td> 시약 </td><td> 0 </td><td> 4퍼센트 </td><td> 8퍼센트 </td></tr><tr><td> 물 </td><td> 35 </td><td> 33 </td><td> 31 </td></tr><tr><td> 10X Pfu DNA 형성 촉매 울트라 버퍼 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> dNTP 혼합 (10mM) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 프리머 감각 (25pmol/μl) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 프리머 안티 센스 (25pmol/μl) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 10X PCRx 향상제 솔루션 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Pfu 울트라 DNA 형성 촉매 효소 (2.5U/μl) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 플라스미드 DNA (20ng/μl) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> 표 1. 성공적으로 GC 풍부한 KISS1R을 변형되기하고 증폭하는 데 사용되는 시약의 조합 <img src="/files/ftp_upload/2897/2897fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. GC 풍부한 KISS1R의 성공적인 돌연변이 유발과 증폭의 사이클 조건 : 2min 뜨거운 시작은 95 30 초 용해의 18주기에 의해 미행했는데 ° C, 55 ° C에서 68과 6 분 연장에서 어닐링 1 분 ° C. 68시 10 분 추가 확장 ° C는 마지막주기의 끝에 추가되었습니다. 이러한 설정은 QuikChange II XL - 사이트 - 감독 돌연변이 유발 키트 (Stratagene)의 원래 돌연변이 유발 프로토콜에서 조정되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/2897/2897fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. GC 풍부한 pCS2 DMSO의 존재 또는 부재의 증폭 + Myc KISS1R의 시각화 : 0의 존재에서 증폭 pCS2의 다섯 μl aliquots + Myc의 KISS1R는 4 8% DMSO는 ethidium 물들일이 대표 1퍼센트 아가로 오스 겔에로드되었습니다 브로마이드와 시각을 사용 UV 라이트. 6Kb의 플라스미드 밴드는 PCR 4 %의 존재에서 증폭 제품과 8 % DMSO와 함께 로드된 두 차선을 볼 수 있습니다,하지만 첫 번째 차선에, 어떤은 PCR이 장전되어 있었어제품은 DMSO의 부재에서 증폭. <img src="/files/ftp_upload/2897/2897fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. HEK - 293 세포에서 Myc KISS1R 단백질의 수준에 류펩틴 또는 MG132의 효과 : Myc KISS1R을 표현 HEK - 293 세포는 37 100μg/ml 류펩틴 또는 10μM MG132 대우했다 ° 지정된 번 C. 세포 lysate의 400μg에 Myc KISS1R는 아가로 오스 - 복합 방지 myc 항체의 2.5μg과 immunoprecipitated과 서양 얼룩에 의해 분석되었다. (B) Myc KISS1R 밴드의 부량는 표시 (A)를 사용하여, IRDye가 800CW - 표시 방지 토끼로 부화 다음 토끼 방지 Myc 태그 항체와 immunoblots의 부화 후 Myc KISS1R의 (A) LI - COR 오딧세이 검출 LI - COR의 오딧세이 부량 소프트웨어. 치료 세포 (시간 0)를 통해 접이식 증가와 같은 결과가 표시됩니다.

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K., McDonald, P. H., Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Receptor+Fate+by+Ubiquitination+of+Activated+Beta+2-Adrenergic+Receptor+and+Beta-Arrestin.">Regulation of Receptor Fate by Ubiquitination of Activated Beta 2-Adrenergic Receptor and Beta-Arrestin.</a> Science. 294, 1307-1313 (2001).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

사이트 이동 돌연변이 유발이 세 수십 년 동안 타겟 유전자의 코딩 순서 염기 변화를 도입하여 단백질 기능을 연구하는 데 사용되었습니다. 원래 기술은 영국 - 캐나다 케미과 노벨상 수상자 마이클 스미스 10 1978 설명했다. 마이클 스미스는 카리 뮬리스, 중합 효소의 연쇄 반응 (PCR) 11를 발명한 미국의 생화학과 화학의 1993 노벨상을 공유했습니다. 마이클 스미스가 설명한 원래 메?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 10X PCRx 향상제 솔루션 </td><td> Invitrogen </td><td> 52,391 </td></tr><tr><td> PfuUltra 높은 충실도의 DNA 중합 효소의 대체 세제 </td><td> Stratagene </td><td> 600385 </td></tr><tr><td> Dpn - I </td><td> 뉴 잉글랜드 Biolabs </td><td> R0176 </td></tr><tr><td> XL10 - 골드 Ultracompetent E. 대장균 세포 </td><td> Stratagene </td><td> 200314 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10-013 - CV </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 애틀랜타 체액 </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Geneporter의 Transfection 시약 </td><td> Genlantis </td><td> T201007 </td></tr><tr><td> 류펩틴 </td><td> Calbiochem </td><td> 108975 </td></tr><tr><td> MG132 </td><td> Calbiochem </td><td> 47,491 </td></tr><tr><td> 10xPBS </td><td> 앰비온 </td><td> AM9625 </td></tr><tr><td> 단백 분해 효소 저해제 칵테일과 PMSF </td><td> 산타크루즈 생명 공학 </td><td> SC - 24948 </td></tr><tr><td> 피어스 BCA 단백질 분석 키트 </td><td> 써모 과학 </td><td> 23,225 </td></tr><tr><td> 안티 Myc 태그 (클론 4A6) 아가로 오스 공액 </td><td> Millipore </td><td> 16-219 </td></tr><tr><td> 2X 로딩 버퍼 </td><td> BioRad </td><td> 161-0737 </td></tr><tr><td> 기준 트리스 - HCL 프리 캐스트 젤, 4-15% 기울기 </td><td> BioRad </td><td> 345-0028 </td></tr><tr><td> Immobilon - FL PVDF 막 </td><td> Millipore </td><td> IPFL00010 </td></tr><tr><td> 오딧세이 차단 버퍼 </td><td> LI - COR Biosciences </td><td> 927-40000 </td></tr><tr><td> 10xTBS </td><td> BioRad </td><td> 170-6435 </td></tr><tr><td> 토끼 안티 - myc 항체 </td><td> 세포 신호 </td><td> 2272 </td></tr><tr><td> 염소 항 토끼 IRDye 800CW </td><td> LI - COR Biosciences </td><td> 926-32211 </td></tr><tr><td> 오딧세이 이미징 적외선 시스템 </td><td> LI - COR Biosciences </td><td></td></tr><tr><td> 할트 프로 테아제 억제제 칵테일 (100x) </td><td> 써모 과학 </td><td> 78,430 </td></tr></tbody></table>

mutagenesis and analysis of genetic mutations in the gc-rich kiss1 receptor sequence identified in humans with reproductive disorders

kisspeptin 수용체 (KISS1R)는 사춘기의 트리거와 성인 1,2,3의 생식 능력의 레귤레이터로 인식 G 단백질 결합 수용체이다. 환자에서 확인된 KISS1R의 운영을 중지시키지 변이는 iodiopathic hypogonadotropic hypogonadism (IHH) 1,2와 조숙한 사춘기 4 연결되어있다. 이러한 돌연변이의 기능 연구는이 수용체에 의해 복제의 규제뿐만 아니라를 기본 메커니즘에 대한 우리의 이해에 대한 중요한 질병 결과를 형성 사람, 비정상적인 KISS1R 신호와 함수에서 어떤 결과를. 그러나, KISS1R 유전자의 높은 GC 풍부한 시퀀스는 다소 어려운 변이를 소개하거나 PCR하여이 수용체를 인코딩 유전자를 증폭 수 있습니다. 여기 우리 연구실에서 십여 KISS1R의 돌연변이를 통해 생성 성공적으로 사용되고 있습니다이 높은 GC 풍부한 순서에 관심이 변이를 도입하는 방법을 설명합니다. 우리는 대체, 삭제 또는 KISS1R 시퀀스의 삽입을 포함 KISS1R의 돌연변이의 범위의 증폭을 촉진하기 위하여 PCR 조건을 최적화합니다. PCR 향상제 솔루션 또한뿐만 DMSO의 작은 비율로 증폭을 개선하기 위해 특히 도움이되었습니다. 이 최적화된 절차뿐만 아니라 다른 GC 풍부한 템플릿을 유용할 수 있습니다. KISS1R 인코딩 발현 벡터는 변이가 KISS1R 기능을 변경하고 관련된 생식 phenotypes가 발생할 수 있습니다 방법을 이해하기 위해서는이 수용체의 신호와 기능을 특성화하는 데 사용되고있다. 따라서, 사이트 감독 돌연변이 유발에 의해 생성된 KISS1R의 돌연변이의 가능성이 응용 프로그램은 많은 연구에 의해 그림 1,4,5,6,7,8 수 있습니다. 예를 들어, 조숙한 사춘기와 관련된 KISS1R (Arg386Pro),에있는 이득의 기능 변이는 KISS1R 9 저하의 속도를 변경하는 리간드 자극 사뿐만 아니라 수용체의 반응을 연장하기 위해 표시되었습니다 . 흥미롭게도, 우리의 연구는 대부분의 G 단백질 결합 수용체 9 설명한 고전 lysosomal 저하에 반대하는, KISS1R은 proteasome에 의해 저하되고있는 것으로 나타났습니다. 여기에 제시된 예제에서 KISS1R의 저하는 transiently Myc - 태그 KISS1R (MycKISS1R)를 표현하는 인간의 배아 신장 세포 (HEK - 293)에서 조사하고 proteasome 억제제 또는 lysosome과 치료. 세포 lysates은 서양 얼룩 분석 뒤에 아가로 오스 - 복합 백신 myc 항체를 사용하여 immunoprecipitated 있습니다. blots에 대한 감지 및 MycKISS1R의 부량는 LI - COR 오딧세이 적외선 시스템을 사용하여 수행됩니다. 이러한 접근 방식뿐만 아니라 관심의 다른 단백질의 저하의 연구에 유용하게 사용될 수 있습니다.

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Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders

kisspeptin 수용체 (KISS1R)에 돌연변이가 환자의 생식 장애와 관련된 있습니다. 여기 immunoprecipitation과 서양 얼룩에 의한 수용체의 저하 경로를 특성화 KISS1R의 GC 풍부한 순서뿐만 아니라 KISS1R 구조의 사용으로 관심 변이를 소개하는 방법을 설명합니다

생식기 장애와 인간에서 확인된 GC 풍부한 KISS1 수용체 유전자 시퀀스에 돌연변이 돌연변이 유발 및 분석

The kisspeptin receptor (KISS1R) is a G protein-coupled receptor recognized as the trigger of puberty and a regulator of reproductive competence in ...

mutagenesis-analysis-genetic-mutations-gc-rich-kiss1-receptor

Research

JoVE Journal

Biology

13.9K 조회수.  University of Miami Miller School of Medicine. kisspeptin 수용체 (KISS1R)에 돌연변이가 환자의 생식 장애와 관련된 있습니다. 여기 immunoprecipitation과 서양 얼룩에 의한 수용체의 저하 경로를 특성화 KISS1R의 GC 풍부한 순서뿐만 아니라 KISS1R 구조의 사용으로 관심 변이를 소개하는 방법을 설명합니다

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Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

칙의 배아에서 신경 유도에 대한 분석

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

연구

생물학

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

차 문화와 Corti의 Murine 오르간의 플라스미드 Electroporation.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Ribosome 바운드 Polypeptides을 파악하는 도구로 SecM 체포 시퀀스를 사용하여

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

헤어 재생시 상피 - 중간 엽 시그널링의 빠른 유전 분석

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

인간 다 능성에 대한 대안 문화는 전지 생산, 유지 보수 및 유전 분석을 줄기

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

고해상도 시간 경과 이미징 및 생활 인간 제대 정맥 내피 세포의 미세 소관 역학의 자동 분석

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

대한 유전 및 생화학 적 접근<em&gt; 생체</em&gt; 및<em&gt; 체외</em&gt; 단백질 올리고머의 평가 다음 Ryanodine 수용체 사례 연구

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

VirusMapper 슈퍼 해상도 현미경을위한 오픈 소스 단일 입자 분석

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust technologies that measure RNA biomarkers in situ in clinical specimens. While grind-and-bind assays like RNAseq and quantitative RT-PCR enable highly sensitive gene expression measurements, they also require RNA extraction and thus prevent valuable expression analysis within the morphological tissue context. The in situ hybridization (ISH) assay described here can detect RNA target sequences as short as 50 nucleotides at single-nucleotide resolution and at the single-cell level. This assay is complementary to the previously developed commercial assay and enables sensitive and specific in situ detection of splice variants, short targets, and point mutations within the tissue. In this protocol, probes were designed to target unique exon junctions for two clinically important splice variants, EGFRvIII and MET&#916;14. The detection of short target sequences was demonstrated by the specific detection of CDR3 sequences of T-cell receptors &#945; and &#946; in the Jurkat T-cell line. Also shown is the utility of this ISH assay for the distinction of RNA target sequences at single-nucleotide resolution (point mutations) through the visualization of EGFR L858R and KRAS G12A single-nucleotide variations in cell lines using automated staining platforms. In summary, the protocol shows a specialized RNA ISH assay that enables the detection of splice variants, short sequences, and mutations in situ for manual performance and on automated stainers.

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Here, we describe an in situ hybridization assay which enables sensitive and specific detection of sequences as short as 50 nucleotides with single-nucleotide resolution at the single-cell level. The assay, which can be performed manually or automatically, can enable visualization of splice variants, short sequences, and mutations within the tissue context.