Name: genetic and biochemical approaches for in vivo and in vitro assessment of protein oligomerization: the ryanodine receptor case study
Uploaded: 2016-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
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저자는 선언 아무 상관이 없습니다.

단백질 호모 올리고머의 형성은 전사 인자, 효소, 이온 채널과 수용체 (25), (26)의 활성을 조절하는 중요한 생물학적 과정이다. 중요한 것은, 단백질 올리고머는 신경 퇴행 및 부정맥 심장 질환 4,27을 포함한 병리학 적 의미를 가지고있다. 이 문서에 설명 된 방법은 단백질 자체 협회 및 올리고머를 매개 도메인 - 도메인 상호 작용을 식별하는 데 사용됩니다. 다음, 우리는 각 프로토콜 내에서 중요한 단계를 가리, 우리는 중요한 고려 사항, 제한 사항 및 문제 해결에 대해 설명합니다. Y2H 시스템은 잠재적 상호 작용 단백질로 인해 상대적으로 높은 처리량 스크리닝 파트너, 사용의 용이성 및 높은 재현성 결과 화면 먼저 채용 될 수있다. Y2H 절차는 표준 (판 또는 통) 인큐베이터 룸 봉쇄 설비와 미생물 실험실에서 수행된다. FR의 사용β-갈 분석에서 최상의 결과를 위해, 갓 (구 오일까지) 효모 식민지를 성장 (단계 1.2.3)를 사용한다 반면 eshly 준비 유능한 세포 (단계 1.1.8), 고효율 효모 변환을위한 중요합니다. GAL4 및 / 또는 추가 / 대체 리포터 유전자 이외의 다른 전사 인자를 기반으로 시스템을 사용할 수 있습니다, 따라서 미끼 먹이 플라스미드은 해당 Y2H의 변형과 일치해야합니다. 몇몇 균주가 HIS3 리포터 유전자 7,8 중 항시 발현을 해소하기 위하여, 3- 아미노 -1,2,4- 트리아 졸 상기 HIS3 단백질의 경쟁적 억제제의 존재 하에서 배양한다. 미끼 및 대상 융합 단백질의 발현은 17 면역 블에 의해 확인해야합니다. 케이스 미끼 / 먹이 융합 단백질이 효모에 독성이 낮은 허용 단백질 수준 미끼 / 먹이식이 다른 프로모터에 의해 구동되는 다른 벡터의 클로닝에 의해 달성 될 수있다. 또한, t를 위해 필수적모자 미끼 / 먹이 융합 단백질은 자율 리포터 유전자 활동을 표시하지 않습니다. 자율 리포터 유전자가 활성화, 또는 이들 단백질에 대한 테스트 GAL4 DNA-BD와 AD 융합체를 바꾸면 담당 영역을 제거하는 구조를 수정하여 구조 될 수있다. 그들은 세포 내 막 구획에서 미스 폴딩 또는 융합 단백질의 mislocalization을 유도 할 수 있기 때문에 또한, 횡단 도메인은 더 나은 미끼 / 먹이 구조에서 생략됩니다. 실제로, Y2H 시스템의 주요 단점은 미끼 및 대상 단백질-위양성 또는 위음성 상호 작용 6-9의 결과, 특정 번역 후 변형이 부족한 거리에 자신의 생리 세포 내 위치에서 잠재적으로 효모 핵에 지역화 된 것입니다 . 이종 포유 동물 발현 시스템은 형태, 번역 후 변형 및 세포 내 편재 용어 포유 동물 세포막 단백질의 연구에 더 적합하다.가장 널리 사용되는 세포의 형질 전환 방법 중 하나는 주로 때문에 최소의 장비, 인산 칼슘 침전하고 시약은 11, 15을 요구했다. 다른 방법, 즉, 전기 천공, 리포좀과 양이온 성 지질 중합체는, 세포주에 따라 높은 형질 전환 효율이 수득되며 사용한 구성 할 수있다. 일반적으로, 형질 감염 효율에 영향을 미치는 주요 요인은 플라스미드 DNA의 품질과 셀 건강 / 생존이다. 높은 순도 (260 나노 미터의 / 280 ㎚ ​​흡광도 비가 1.8)과 적극적으로 분열하는 세포의 플라스미드 DNA를 사용할 때 최상의 결과가 달성된다. 외래 DNA를 수행하는 능력은 매체 (11)에 노출 된 세포의 표면 영역과 관련되어 있기 때문에, 70 % 합류 (단계 2.1.2) - 세포 따라서 더 60보다 형질한다. 또한, 형질 전환 (단계 2.1.3) 동안 배지에서 항생제의 포함은 증가 세포 사멸 (15)로 인해 권장되지 않습니다. 에프인산 칼슘 배속 HBS 용액 (단계 2.1.1)의 특별한주의 제조하고 (정확하게 7.05) pH 조정 석출 및 플라스미드 DNA / 칼슘 / 격렬하게 혼합한다 (단계 2.1.5)에 의하여 인산 착물을 적절히 형성하거나 고효율 형질 전환을위한 중요한 단계. 일반적으로, 24 내에서 일시적인 형질 피크에 의해 단백질 발현 - 72 시간. 세포가 수확되면, 이후의 절차는 단백질 분해 효소 활동을 최소화하기 위해 4 ° C에서 수행되어야하며, 프로테아제 억제제를 첨가하는 것이 좋습니다. 세포 균질화는 염색체 DNA 용액의 점도를 증가시키고, 비특이적 결합을 향상시킬 수 있기 때문에 핵을 제거하기 위해 원심 분리 단계에 이어한다. 따라서, 삼투압 버퍼의 기계적 수단에 의한 균질화는 보통 (0.3 M) 또는 수크로오스 (150 mM)을 염화나트륨으로 바람직하다. 일반적으로, 수 크로즈 계 버퍼 단백질 안정성을 향상시키고 잠재적 비원 단백질 응집을 감소시키기 위해 알려져 있지만, P에 의한단백질 표면에 조 수화 정전 단백질 - 단백질 상호 작용을 선호한다. 반대로 염계 버퍼 따라서 소수성 상호 작용을 기반 (28)을 향해 바이어스를 갖는 단백질의 표면 상에 대전 된 아미노산 사이드 그룹의 순 전하에 영향을 미친다. 공동 IP 특히 천연 조직에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 평가하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 생화학 분석이다. 주요 단점은 IP에서 사용 10,16,18를 면역 블에 대한 검증 매우 특이 항체에 대한 요구 사항입니다. 따라서, 재조합 단백질은 종종 펩티드 에피토프와 태그, 예., 인플루엔자 헤 마글 루티 닌 (YPYDVPDYA) 또는 인간 cMyc (EQKLISEEDL)를하는 높은 친화도 특이 항체가 시판되고있다. 원한다면, 항체 immunoprecipitating 화학적 공침 PR 가릴 수있는 면역 단계에서의 용출 및 검출을 방지하기 위해 단백질-A 수지 상에 접합 될 수있다otein (16); 이를 위해, 우리는 성공적 화학적 가교제 3,3&#39;- 디티 오비스 (sulfosuccinimidylpropionate) (24)를 사용했다. 이는 적절한 세제는 IP 버퍼에 포함 균질화 세포의 불용성 물질은 비 - 특이 적 결합 (단계 3.1.3)를 최소화하기 위해 원심 분리에 의해 제거되는 것이 필수적이다. 실질적으로 결합 비특이적을 줄일 강한 세제​​ 및 / 또는 높은 농도뿐만 아니라 X 폐지 할 수있다 : 선택과 세제의 농도는 중요한 고려 사항이다 약한 상호 작용이 관찰 될 수있다 Y 단백질 상호 작용, 낮은 농도 또는 온화한 세제 반면를 수 있지만, 과도한 비특이적 결합을 초래한다. . 1 % 농도 - 중간 강도 세제는 예를 들면, 트리톤 X-100 0.5이 바람직하다. 또한, 비 - 특이 적 결합 중성 단백질을 줄이기 위해 (예를 들어, 100 μg의 / ㎖의 소 혈청 알부민)은 IP 버퍼를 포함 할 수 있고, 및 / 또는 세포 용 해물은-cleare 미리 수혼자 단백질-A 수지와 사전 배양과 라. 세척의 수는 X에 최적화되어야한다 Y 쌍 테스트, IP 버퍼 (단계 3.1.9)와 일반적으로 3 10 분 세척을. 임의의 경우에, immunoprecipitating 항체 비 - 면역 IgG를 가진 공동 IP 샘플은 항상 음성 대조군 (단계 3.1.6)를 게재 병렬로 처리한다. 화학적 가교의 주된 이점은 단백질 호모 올리고머의 화학 양론 조성에 통지한다는 것이다. 그것은 어떤 특수한 장비를 필요로하지 않으며이 상호 작용 단백질 19, 20 사이의 열적 및 화학적으로 안정하고 가교를 생성하기 때문에 글루 타르 알데히드는 일반적으로 사용되는 가교제이다. 들이 화학 반응을 종결하기 때문에 유리 아미노 그룹을 갖는 화합물을 분석 완충액 (단계 3.2.1)에서 생략되어야한다. 글루 타르 알데히드 농도 및 반응 시간 (단계 3.2.4)가 관심 올리고머 단백질 복합체에 대해 최적화되어야한다. 이 기술, especi의 주요 단점전체 세포 제제에서 수행 아군 때 생물학적 중요성 부족 인공 단백질 응집체를 생성 할 수있는 화학 반응의 비 특이성이다. 생체 내에서 대체 (예., 형광 공명 에너지 전달, 이중 분자 형광 또는 발광 보완) 및 시험 관내 기법 (예., 크기 배제 크로마토 그래피, 분석 초 원심 분리, 등온 적정 열량)은 단백질 자체 협회 평가 특성화 사용할 올리고머 화학 양론 29, 30의. 각 방법은 그 자체의 장점 및 단점을 가지며, 이는 단백질 정제 / 안정성 장비 / 시약의 가용성에 따라, 특정 단백질의 연구에 더 적합 할 수있다. 세부 사항, 즉 Y2H 공동 IP 및 가교 여기에 기술 된 세 개의 상보 적 방법은, RyR2 호모 oligome 대한 강력한 증거를 제공하기 위해 조합하여 사용되어왔다격리 및 살아있는 세포 내에서 R 형성.

골격과 심장 근육의 수축 RyR에 의해 매개 근질 세망 칼슘 2 + 릴리스에 의해 트리거됩니다. 4 개의 동일한 서브 유닛으로 구성 기능 채널 세 포유 동물 RyR 이성체가있다. 각 서브 유닛 RyR 큰 세포질 규제 N 말단 부분 및 고 컨덕턴스 칼슘 기공을 형성하는 막 관통 도메인을 포함하는 작은 C 말단 부위로 구성된다. 이상 인트라 간 서브 유닛 상호 작용은 RyR 채널 기능 장애의 기초 및 신경 근육 및 심장 질환 1 초래한다. RyR 구조에 관련된 특정 도메인의 식별 및 특성 : 함수 관계는 RyR의 병태 생리의 이해 때문에 매우 중요하다. 전통적인 생화학 단백질 - 단백질 상호 작용을 기술들은 박테리아에서 생산 된 정제 된 단백질의 상당한 양을 필요로한다. 이것은 RyR 매우 큰 막 (P)의 경우에는 가능하지그 재조합 파편이 박테리아 발현 및 정제에 쉽게 의무가없는 반면 rotein는 ~ 5000 개의 아미노산으로 구성. 따라서, 진핵 숙주 세포를 포함하는 다른 발현 시스템들은 포유 동물 세포막 단백질이 요구된다. 우리는 이전에 집합 N 말단 테트라은 세 포유 동물 RyR가 2,3 이소 폼에 걸쳐 보존하는 구조적 기능이 있음을 입증하는 Y2H, 공동 IP 및 가교 시험 법을 사용하고있다. 중요한 것은, 우리는 부정맥 심장 질환과 관련된 하나의 점 돌연변이는 N 말단 자체 협회 및 장애 RyR 채널 4의 결과를 방해 것으로 나타났습니다. 우리는 또한 RyR 세포질 C- 말단 꼬리 5뿐만 아니라 동종 세포 내 칼슘 방출 채널의 N 말단, 이노시톨 1,4,5- trisphosphate 수용체 (2)의 올리고머 화 연구에 이러한 기술을 적용하고있다. Y2H 분석에서, interacti사이에 두 개의 단백질 (X 및 Y)는 기능적인 전사 인자 (GAL4) 리포터 유전자 6-9의 계속되는 활성의 재구성에 의해 측정된다. DNA 결합 도메인 (DNA-BD)를 / 단백질 X 융합 (미끼) 및 활성화 도메인 (AD) / 단백질 Y : 두 개의 다른 클로닝 벡터는 GAL4의 두 개의 물리적으로 분리 독립 도메인이 두 시험 단백질 융합체를 생성하기 위해 사용되는 융합 (대상). Y2H은 단백질이 GAL4 DNA-BD와 같은 단백질의 AD 융합체를 생성하여 그 자체와 상호 작용하는지 여부를 테스트 할 수있다. 유전자 Y2H 균주합니다 (GAL80 단백질이 GAL4의 리프레입니다) 결핍 GAL4 및 GAL80을하는 수정뿐만 아니라 TRP1과 결핍는 Leu2로 (각각 미끼 먹이 플라스미드에 대한 영양 선택을 제공하기 위해). 효모 핵 재조합 DNA-BD와 AD 펩티드는 그들의 융합체 &#39;X 통해 하이브리드 GAL4 전사 인자 생산 물리적으로 근접하게된다 : Y의 INTeraction. 이 방법은 리포터 유전자 (β-갈 락토시다 제 (β-갈)에 대한 LacZ를 인코딩) 및 발색 (AN 히스티딘 생합성에 필요한 효소를 HIS3 인코딩) prototrophic의 병렬 전사 활성화를 통해 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하는 신속 유전자 검사를 할 수 있습니다. Y2H의 주요 장점은 심지어 약하거나 과도 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하는 생체 내 분석법이 있다는 것이다. 또한, 검출은 미끼 및 대상 단백질의 정제 또는 특정 항체의 생성을위한 필요없이 간단한 (미디어 부족 히스티딘에서) 성장을 선택의 사용 또는 비색의 (β-갈) 분석을 포함한다. 또한 Y2H 또한 라이브러리 단백질의 cDNA의 직접 액세스를 제공하는 베이트 단백질의 신규 결합 파트너에 대한 임의의 알려지지 클론 (GAL4의 AD에 융합 된 cDNA 라이브러리 클론)의 컬렉션을 스크리닝하는데 사용될 수있다. Y2H 관측을 확장하려면, independENT 생화학 기법이 사용될 수있다. 공동 IP 면역 및 결합 가교 검정 복합 시료 혼합물 단백질 연관을 검출하도록 사용되는 방법, 예를 들면., 전체 세포 용 해물 (10)이다. 그들의 주요 장점은 재조합 단백질의 사용을 필요로하는 다른 방법과 달리, 기본 조직에서 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한보고한다는 것이다. 재조합 단백질은 일반적으로 그들의 정확한 형태 및 번역 후 변형을 가질 가능성이있는 포유 동물 세포주뿐만 아니라, 세포 내 자국어로 표현을 사용할 수있다. CO-IP 및 가교 시험 관내 분석은 균질 세포의 활용에 있기 때문에 그러나, 두 파트너 단백질이 그대로 전지 (11)에서 공동화되어 있는지 여부를 확인할 필요가있다. 우리는 일상적으로 일시적으로 칼슘 포스페이트 침전 법 2를 사용하는 포유 동물 세포막 및 세포질 단백질을 발현하는 포유류 HEK293 세포의 형질 감염을 사용-4,12-14는 여기에 상세하게 설명했다. 이것은 효과적으로 균체 내에 플라스미드 DNA를 전달하는 저렴한 방법이지만 특정 사용한 세포주 및 세포 합류뿐만 아니라 플라스미드 DNA 11, 15의 순도에 의존한다. 공동 IP 분석은 추정 작용 파트너 10,16의 CO 정화를 가능하게 비 - 변성 조건하에 세포 용 해물로부터 관심 천연 또는 재조합 단백질의 분리를 포함한다. 두 개의 상이한 에피토프 다른 두 융합체를 생성함으로써 단백질 자체와 상호 작용하는지 여부를 테스트하는 것이 이용 될 수있는 두 개의 독립 항체의 사용, 단백질 X의 분리를위한 immunoprecipitating 항체 및 단백질 파트너 Y.의 검출을위한 면역 항체를 필요 태그 (예., HA 및 cMyc). immunoprecipitating 항체 단백질-A에서의 Fc 영역을 결합 (단백질 G, 항체가 발생 된 동물의 종에 따라 OR)되는아가로 오스 (또는 세 파로스)를 수지에 접합된다. 단백질 X는 항체에 의해 침전되어 단백질 수지 파쇄 균질화 셀 즉 세제 가용 분획과 인큐베이션 다음. 단백질 면역 복합체는 SDS 완충액을 함유이어서 SDS-PAGE로 분석 한 결과, 단백질의 존재 Y (17)를 검출하기 위해 항체를 사용하여 면역 블 용출된다. 공동 IP 과도한 비 - 특이 적 결합을 방지하기 위해 세제 수용성 단백질로 수행되어야한다. Y 쌍 10,16,18 : 세제 및 농도의 선택뿐만 아니라, 세척 횟수, 각 X에 대해 최적화되어야한다. 가교 올리고머는 단백질 복합체의 화학량 론을 결정하기 위해 사용된다. 이것은 인접한 상호 protomers 간의 공유 결합을 생성하는 화학 반응에 기초하고, 따라서, SDS-PAGE 분리 중에 단백질의 올리고머 상태의 보존을 가능하게한다. 다수의 가교 reage이 있습니다단백질, 일반적으로 주 아민, 카르 복실 또는 티올 그룹에 서로 다른 반응 그룹을 대상으로 다양한 길이 및 화학 국세청. 여기서, 우리는 글루 타르 알데히드의 사용을 설명 (OHC (CH 2) 3 CHO), 리신 잔기 (19, 20)에 존재하는 유리 아미노 그룹과 반응 양단에 두 개의 알데히드기를 가진 호모 이관 능성 가교제. 가교 결합은 부가 형성에 기인하는 농도 - 또는 시간 의존적으로 이어진다. 글루 타르 알데히드의 반응은 히드라진 (H 2 NNH 2) 단백질 시료 후 SDS-PAGE 분석 및 올리고머 화 상태를 평가하기 위해 17로 면역 블되어 정지된다. 우리는 올리고머를 유도하지 않는 가교를 참고하지만 단순히 기존의 단백질 복합체 사이의 안정된 다리를 작성해야합니다. 가교 실험을 수행 중요한 고려 가교제의 농도와 반응 시간 (19, 20)의 선택을 포함한다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;PART 1 yeast two-hybrid&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plate incubator</td><td>Hereaus</td><td>B6120</td><td>Used at 30 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Orbital shaker incubator</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>INNOVA 4300</td><td>Used at 30 &amp;deg;C with shaking at 230 - 250 rpm</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Perkin Elmer</td><td>Lambda Bio+</td><td>To measure OD&lt;sub&gt;600&lt;/sub&gt; of yeast culture; to measure Absorbance at 420 nm in liquid b-Gal assay</td></tr><tr><td>Matchmaker Two-Hybrid System 2 Kit</td><td>Takara Clontech</td><td>K1604-1</td><td>Contains bait vector pGBKT7, prey vector pACT2&amp;nbsp; and yeast strain Y190&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0626</td><td>To prepare minimal SD growh medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dropout supplement lacking leucine and tryptophan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0750</td><td>To prepare minimal SD growh medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dropout supplement lacking leucine, tryptophan, histidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2001</td><td>To prepare minimal SD growh medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Herring testes carrier DNA&amp;nbsp;</td><td>Takara Clontech</td><td>630440</td><td>For yeast transformation</td></tr><tr><td>Whatman filter paper Grade 5&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1005070</td><td>for use in colony-lift filter paper b-Gal assay</td></tr><tr><td>X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&amp;beta;-D-galactopyranoside)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td>for use in colony-lift filter paper b-Gal assay</td></tr><tr><td>ONPG (o-nitrophenyl-&amp;beta;-D-galactopyranoside)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1127</td><td>for use in liquid b-Gal assay</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;PART 2. Protein expression in a mammalian cell line&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293 cell line</td><td>ATCC</td><td>ATCC&amp;reg;&amp;nbsp;CRL-1573&amp;trade;</td><td></td></tr><tr><td>Humidified incubator (5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 37 &amp;deg;C)</td><td>SANYO</td><td>MCO-18AIC</td><td>To culture mammalian cells</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s medium)</td><td>Invitrogen (ThermoFisher)</td><td>41966</td><td>To prepare growth medium for mammalian cells</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Invitrogen (ThermoFisher)</td><td>10500</td><td>To prepare growth medium for mammalian cells</td></tr><tr><td>Glass beads</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td>To homogenise cells</td></tr><tr><td>Needle 23 G (0.6 x 30 mm)</td><td>BD Microlance</td><td>300700</td><td>To homogenise cells</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail (Complete)&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11873508001</td><td>To prevent proteolysis</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;PART 3. In vitro biochemical methods&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell (SDS-PAGE system)</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000EDU&amp;nbsp;</td><td>For polyacrylamide gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Trans-Blot SD (Semi-dry transfer system)</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td>For electrophoretic transfer</td></tr><tr><td>Compact X-ray film processor</td><td>Xograph</td><td>X4</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td>For use in chemical cross-linking</td></tr><tr><td>Protein-A sepharose beads&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5280-01&amp;nbsp;</td><td>For use in co-IP assay</td></tr><tr><td>Anti-HA (Y-11 rabbit polyclonal IgG)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-805</td><td>For use in co-IP assay</td></tr><tr><td>Non-immune rabbit IgG</td><td>Santa Cruz Biotechnology&amp;nbsp;</td><td>sc-2027</td><td>For use in co-IP assay</td></tr><tr><td>Anti-cMyc (9E10 mouse monoclonal IgG)</td><td>Santa Cruz Biotechnology&amp;nbsp;</td><td>sc-40</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>Anti-HA (16B12 mouse monoclonal IgG)</td><td>Covance</td><td>MMS-101P</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG-HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>Hyperfilm ECL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28906836</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Substrate</td><td>Pierce (ThermoFisher)</td><td>32106</td><td>For use in immunoblotting</td></tr></tbody></table>

genetic and biochemical approaches for in vivo and in vitro assessment of protein oligomerization: the ryanodine receptor case study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Y2H 시스템에서, 미끼 : 먹이 상호 작용은 초기에 부족한 배지에서 효모의 성장 선택 (트립토판, 류신 등) 히스티딘에 따라 시험 할 때, 그 후 β-갈 효소 활성 분석 (그림 1)에 의해 평가. 먹이 단백질 상호 작용 : 중간 부족 히스티딘에서 배양 효모는 미끼의 강도에 따라 느린 성장 속도를 가지고있다. β-갈 분석은 효모에서 수행된다 후자의 항복 정량 결과, 중 고체 지지체에 (판 한천) 또는 액체 문화에서 성장 (배지에서 배양는 트립토판과 류신이 부족). 우리는 성공적 RyR2 도메인 내의 도메인의 상호 작용뿐만 아니라 신규 단백질 파트너 2-4,12,21,22를 식별 Y2H을 사용했다. 예를 들어, 우리는 N 말단 단편과의 상호 작용에 대한 RyR2 펩티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 중첩 구조의 일련의 스크린 (AD4L : RyR2 잔기 1-906 GAL4 AD의 융합). (906) GAL4 융합 - AD4L 자체로, 즉 BT4L 1 (RyR2 잔류를 구성하는 상호 작용하는 것을 보여주는, AD4L 쌍 (그림 2A) : 3 식민지 리프트 필터 종이 β-갈 분석은 선명한 블루 컬러 만 BT4L에 대한 효모 식민지를 생산 DNA-BD). 효모 다른 구조와 공동으로이 변환 된 반면, AD4L 쌍의 극단적 인 C 말단 도메인 (BT8)와 보조 약한 연결을 제안 흰색과 미끼 따라서 부정적인 남아​​ : 창백한 푸른 식민지는 BT8 검출 된 먹이 단백질 상호 작용. 액체 β-갈 분석 (그림 2B)에 의해 얻어진 정량 결과, 강력한 BT4L 표시 :는 p53의 단백질 (pVA3)와 SV40 큰 T 항원 (pTD1) 사이의 알려진 협회 강도 AD4L 상호 작용 상당을 BT8 반면 : AD4L 상호 작용 상당히 약한 (&lt;10 % 제어에 비해)했다. 우리는 정기적으로 공동 IP 실험 (그림 3) F를 수행독립적 인 생화학 적 분석 등의 포유 동물 세포 라인 (HEK293)에 일시적 발현을 따르게하는 것은 Y2H 결과 2-4,12-14,21-24을 강화합니다. RyR2 N 말단의 자기 상호 작용을 확인하기 RyR2 잔기 인코딩 두 개의 플라스미드 1-906가 어느 cMyc 또는 HA 펩티드 에피토프 (각각 BT4L 및 AD4L) 태그, 인산 칼슘 침전 법을 이용하여 HEK293 세포로 공동 형질 감염시켰다 3. 균질화 된 세포의 후 핵 분획 세제 CHAPS 가용화시키고, 불용성 물질은 세포 용 해물을 생성하기 위해 원심 분리에 의해 제거 하였다. 환원제 디티 오 트레이 톨로 처리 된 세포 용 해물은 다음 HA-태그 AD4L을 면역 침전 AB를 HA 단백질-A 세파 로즈 비드와 함께 배양 하였다. 버퍼 SDS가 함유 용출 공동 IP 샘플, Ab의 HA와 Ab의 cMyc, 연구와 면역 블에 의해 두 개의 별도의 SDS-PAGE 젤 (1/10 일 9/10 일 분할)에로드 분석 하였다espectively. Ab의 HA에 의해 AD4L의 성공적인 직접 IP (~ 100 kDa의)이 아닌 비 - 면역 토끼 IgG에 (도 4a)를 사용하여 음성 대조군으로, 면역에 의해 확인되었다. 중요한 cMyc 태깅 BT4L (~ 100 kDa의)이 아니라 면역 AD4L (도 4b)의 부재 네거티브 컨트롤 만 구간 HA IP 회수 하였다. Y2H 공동 IP 분석법 RyR2 N 말단 자기 상호 작용 일관된 증거를 제공하지만, 그것은 단지 량체 이상의 복합체를 형성하는, 즉 여부 N- 말단 도메인의 올리고머 화 상태에 알리지 않았다. 이 복합체 해리 것을 주목해야만을 포함 소단위 단백질 - 단백질 상호 작용을 폐지 때문에 SDS-의 SDS-PAGE 및 열 유도 단백질 변성에 의해 검출 될 것이다. 이것을 극복하기 위해, 우리는 화학적으로 안정 기존 PROTEI을 conjoins 가교 (도 5)를 사용하여그 분자량 후 SDS-PAGE 크기 분리 2-5에 의해 검사 될 수 N 올리고머. 예를 들어, 환원제 디티 오 트레이 톨로 처리 cMyc-BT4L를 발현하는 HEK293 세포의 파쇄 액은 글루 타르 알데하이드 및 순이 cMyc (도 6)을 이용하여 SDS-PAGE 및 면역 블 롯팅 분석. RyR2 N 말단 테트라 형성 셋을 나타내는 단량체 (~ 100 kDa의) 시간 의존적으로 검출 하였다 ~ 400 kDa의 높은 분자량의 단백질 밴드 이외에. 특히, 테트라 최소한의 이량 체 관찰 삼량 밴드, 지배적 인 올리고머 종이었다. 15 % 구배 SDS-PAGE 겔 3 - 겉보기 분자 질량을 결정하기 위해, BT4L 올리고머 (4)를 통해 분리 하였다. 우리는 (30)의 범위와 단백질 표준을 사용하여 분자량 / 겔 위상차 표준 곡선 제작 - 460 kDa 이상을, 우리는 358 kDa의 15로 올리고머 계산 (N = 4). 이 겉보기 분자량이 배치 된 BT4L 량체와 일치기본 RyR2 채널 내에서 네 개의 서브 유닛의 배치에서 예상대로 오히려 선형 형태보다 폐쇄 순환 방식. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig1.jpg" /> 그림 1. Y2H 순서도. 효모, 공동 형질 전환 미끼 및 대상 플라스미드와 함께, 매체 부족한 히스티딘의 성장으로 선택 및 / 또는 β-갈 효소 활성에 대해 분석한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig2.jpg" /> 도 2는 Y2H RyR2 N 말단 도메인 자기 상호 작용을 의미한다. (A)에 대한 회로도 Y2H 시스템 시험 인간 RyR2 중첩 단백질의 단편 (미끼) 계열 묘사<html> RyR2 N 말단 AD4L (먹이) 구조와의 상호 작용. 식민지 리프트 필터 종이 β-갈 분석에 의해 얻어진 성적 결과는 &quot;+&quot;배수 또는으로 표시됩니다 &quot;-&quot;부정적인 상호 작용을 양성 대조군에 대해 정규화 (B) 양이 액체 β-갈 분석을 (pVA3은 GAL4 DNA-BD에 대한 인코딩합니다. p53의 단백질과 융합, pTD1)는 SV40 큰 T 항원과 GAL4의 AD 융합을위한 인코딩합니다. 3에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig3.jpg" /> 도 3 공동 IP 순서도. 포유 동물 세포의 공동 형질 플라스미드의 X 및 Y로는 균질 세제 - 가용화 SDS-PAGE 및 면역 하였다 공동 IP 분석에 사용 된 세포 용 해물을 생성한다.F = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig3large.jpg&quot;대상 = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig4.jpg" /> 그림 4. 공동 IP는 포유 동물 세포에서 RyR2 N 말단 도메인 자체의 상호 작용을 나타냅니다. HEK293 세포 (BT4L) cMyc - 태그 및 HA가-태그 (AD4L) RyR2 N 말단 도메인의 과도 공동 식 (대한 공동 형질 감염시켰다 잔류 물 1-906). 음성 대조군으로서, 공동 IP 분석은 비 면역 된 토끼의 IgG로 수행 된 반면 AD4L는, CHAPS 및 디티 오 - 가용화 처리 HEK293 파쇄물 순이 HA로 면역 침전시켰다. 면역 침전 된 단백질을 5 분 동안 85 ° C로 가열 1/10 번째 또는 IP 시료 9/10 번째 로케이션 별도 6 % SDS-PAGE 젤을 통해 3 시간 동안 20mA에서 해결되었다. polyviny 상에 2 시간 동안 80 V에 따라 단백질 전송Ab의 HA (A) 또는 순이 cMyc 고추 냉이 퍼 옥시 다제 - 접합 된 항 - 마우스 IgG이어서 각각 (B), (1 : 10,000 희석) 및 향상된 화학 발광 검출 : lidene 디 플루오 라이드 멤브레인은 면역 블 분석 (1000 희석 1)를 사용하여 행했다 (1 분 노출). 세포 용 해물의 분취 량은 IP 샘플 처리 체적의 1/50 번째는 또한 분자량 표준을 제공하기 위해 포함되었다. 3에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig5.jpg" /> X 플라스미드로 형질도 5 가교 순서도. 포유 동물 세포는 SDS-PA,이어서 균질화 및 가교 결합 분석에서의 글루 타르 알데히드와의 반응을 실시GE와 면역입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig6.jpg" /> 그림 6. 크로스 링크는 RyR2 N 말단 도메인 테트라 머 형성을 나타냅니다 HEK293 세포 cMyc-태그 (BT4L) RyR2 N 말단 도메인의 일시적 발현 (잔류 물 1-906)에 대한 형질 감염시켰다.. 환원제 디티 오 트레이 톨로 처리 세포 파쇄는 표시된 시간 점을 글루 타르 알데히드와 함께 배양 하였다. 샘플을 5 분 동안 85 ℃에서 가열하고 3 시간 동안 20mA에서 SDS-PAGE (6 % 겔)에 의해 해결되었다. 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 - 접합 된 항 - 마우스 IgG (1,이어서 (1000 희석 1) 순이 cMyc을 폴리 비닐 리덴 디 플루오 라이드 막 상에 2 시간, 80 V에서 단백질 이동에 따라, 면역 블 분석을 이용하여 수행 하였다 :10,000 희석) 및 향상된 화학 발광 검출 (1 분 노출). 단량체 (M : ~ 100 kDa의) 및 테트라 (T) 형태가 화살표로 표시됩니다. 3에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

대한 유전 및 생화학 적 접근<em&gt; 생체</em&gt; 및<em&gt; 체외</em&gt; 단백질 올리고머의 평가 다음 Ryanodine 수용체 사례 연구

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

genetic-biochemical-approaches-for-vivo-vitro-assessment-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

11.3K 조회수.  Cardiff University School of Medicine, College of Biomedical and Life Sciences. Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

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Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral effector protein MxA exerts a broad antiviral activity against many viruses. MxA is a dynamin-like GTPase and has the capacity to form oligomeric structures of higher order. However, whether oligomerization of MxA is required for its antiviral activity is an issue of debate. We describe here a simple protocol to assess the oligomeric state of endogenously or ectopically expressed MxA in the cytoplasmic fraction of human cell lines by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in combination with Western blot analysis. A critical step of the protocol is the choice of detergents to prevent aggregation and/or precipitation of proteins particularly associated with cellular membranes such as MxA, without interfering with its enzymatic activity. Another crucial aspect of the protocol is the irreversible protection of the free thiol groups of cysteine residues by iodoacetamide to prevent artificial interactions of the protein. This protocol is suitable for a simple assessment of the oligomeric state of MxA and furthermore allows a direct correlation of the antiviral activity of MxA interface mutants with their respective oligomeric states.

This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.

비 변성 폴리 아크릴 아미드 젤 전기 영동을 사용하여 인간의 MXA의 멀티 서브 유닛 단백질 복합체의 특성

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

연구

생화학

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. However, there is still little information about how insoluble protein aggregates exert their toxic effects in vivo. Simple prokaryotic and eukaryotic model organisms, such as bacteria and yeast, have contributed significantly to our present understanding of the mechanisms behind the intracellular amyloid formation, aggregates propagation, and toxicity. In this protocol, the use of yeast is described as a model to dissect the relationship between the formation of protein aggregates and their impact on cellular oxidative stress. The method combines the detection of the intracellular soluble/aggregated state of an amyloidogenic protein with the quantification of the cellular oxidative damage resulting from its expression using flow cytometry (FC). This approach is simple, fast, and quantitative. The study illustrates the technique by correlating the cellular oxidative stress caused by a large set of amyloid-&#946; peptide variants with their respective intrinsic aggregation propensities.

Protein aggregation elicits cellular oxidative stress. This protocol describes a method for monitoring the intracellular states of amyloidogenic proteins and the oxidative stress associated with them, using flow cytometry. The approach is used to study the behavior of soluble and aggregation-prone variants of the amyloid-&#946; peptide.

효 모 세포 산화 스트레스에 단백질 집단의 영향 평가

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be employed using a conventional confocal microscope equipped with digital detectors. A protocol for the use of the technique in vitro is shown by means of a use case where number and brightness can be seen to accurately quantify the oligomeric state of mVenus-labelled FKBP12F36V before and after the addition of the dimerizing drug AP20187. The importance of using the correct microscope acquisition parameters and the correct data preprocessing and analysis methods are discussed. In particular, the importance of the choice of photobleaching correction is stressed. This inexpensive method can be employed to study protein-protein interactions in many biological contexts.

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

This protocol describes a calibration-free approach for quantifying protein homo-oligomerization in vitro based on fluorescence fluctuation spectroscopy using commercial light scanning microscopy. The correct acquisition settings and analysis methods are shown.

생체 외에서 교정 무료 단백질 호모-oligomerization 상업 계측 및 무료, 오픈 소스 밝기 분석 소프트웨어를 사용 하 여의 정량화

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest control. To date, several diamide insecticides targeting pest RyRs have been commercialized, which generate annual revenue of 2 billion U.S. dollars. But comprehension of the mode of action of RyR-targeting insecticides is limited by the lack of structural information regarding insect RyR. This in turn restricts understanding of the development of insecticide resistance in pests. The diamondback moth (DBM) is a devastating pest destroying cruciferous crops worldwide, which has also been reported to show resistance to diamide insecticides. Therefore, it is of great practical importance to develop novel insecticides targeting the DBM RyR, especially targeting a region different from the traditional diamide binding site. Here, we present a protocol to structurally characterize the N-terminal domain of RyR from DBM. The x-ray crystal structure was solved by molecular replacement at a resolution of 2.84 &#197;, which shows a beta-trefoil folding motif and a flanking alpha helix. This protocol can be adapted for the expression, purification and structural characterization of other domains or proteins in general.

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

In this article, we describe the protocols of protein expression, purification, crystallization and structure determination of the N-terminal domain of&#160;ryanodine receptor from diamondback moth (Plutella xylostella).

N 맨끝 도메인의 Ryanodine 수용 체 이용한 배 xylostella 에서 결정 구조

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. While the outer surface membrane and associated TATS membrane components appear to be continuous, there are substantial differences in lipid and protein content. In ventricular myocytes (VMs), certain TATS components are highly abundant contributing to rectilinear tubule networks and regular branching 3D architectures. It is thought that peripheral TATS components propagate action potentials from the cell surface to thousands of remote intracellular sarcoendoplasmic reticulum (SER) membrane contact domains, thereby activating intracellular Ca2+ release units (CRUs). In contrast to VMs, the organization and functional role of TATS membranes in atrial myocytes (AMs) is significantly different and much less understood. Taken together, quantitative structural characterization of TATS membrane networks in healthy and diseased myocytes is an essential prerequisite towards better understanding of functional plasticity and pathophysiological reorganization. Here, we present a strategic combination of protocols for direct quantitative analysis of TATS membrane networks in living VMs and AMs. For this, we accompany primary cell isolations of mouse VMs and/or AMs with critical quality control steps and direct membrane staining protocols for fluorescence imaging of TATS membranes. Using an optimized workflow for confocal or superresolution TATS image processing, binarized and skeletonized data are generated for quantitative analysis of the TATS network and its components. Unlike previously published indirect regional aggregate image analysis strategies, our protocols enable direct characterization of specific components and derive complex physiological properties of TATS membrane networks in living myocytes with high throughput and open access software tools. In summary, the combined protocol strategy can be readily applied for quantitative TATS network studies during physiological myocyte adaptation or disease changes, comparison of different cardiac or skeletal muscle cell types, phenotyping of transgenic models, and pharmacological or therapeutic interventions.

In cardiac myocytes, tubular membrane structures form intracellular networks. We describe optimized protocols for i) isolation of myocytes from mouse heart including quality control, ii) live cell staining for state-of-the-art fluorescence microscopy, and iii) direct image analysis to quantify the component complexity and the plasticity of intracellular membrane networks.

심방과 심실에서 심장 근육 세포에 관형 막 네트워크 분석

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

생체공학

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial applications as well as increases basic fundamental biological knowledge. F&ouml;rster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) between a donor molecule in an electronically excited state and a nearby acceptor molecule has been frequently utilized for studies of protein-protein interactions in living cells. The proteins of interest are tagged with two different types of fluorescent probes and expressed in biological cells. The fluorescent probes are then excited, typically using laser light, and the spectral properties of the fluorescence emission emanating from the fluorescent probes is collected and analyzed. Information regarding the degree of the protein interactions is embedded in the spectral emission data. Typically, the cell must be scanned a number of times in order to accumulate enough spectral information to accurately quantify the extent of the protein interactions for each region of interest within the cell. However, the molecular composition of these regions may change during the course of the acquisition process, limiting the spatial determination of the quantitative values of the apparent FRET efficiencies to an average over entire cells. By means of a spectrally resolved two-photon microscope, we are able to obtain a full set of spectrally resolved images after only one complete excitation scan of the sample of interest. From this pixel-level spectral data, a map of FRET efficiencies throughout the cell is calculated. By applying a simple theory of FRET in oligomeric complexes to the experimentally obtained distribution of FRET efficiencies throughout the cell, a single spectrally resolved scan reveals stoichiometric and structural information about the oligomer complex under study. Here we describe the procedure of preparing biological cells (the yeast Saccharomyces cerevisiae) expressing membrane receptors (sterile 2 &alpha;-factor receptors) tagged with two different types of fluorescent probes. Furthermore, we illustrate critical factors involved in collecting fluorescence data using the spectrally resolved two-photon microscopy imaging system. The use of this protocol may be extended to study any type of protein which can be expressed in a living cell with a fluorescent marker attached to it.

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

By employing a spectrally resolved two-photon microscopy imaging system, pixel-level maps of F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiencies are obtained for cells expressing membrane receptors hypothesized to form homo-oligomeric complexes. From the FRET efficiency maps, we are able to estimate stoichiometric information about the oligomer complex under study.

Spectrally 해결된 두 광자 현미경을 사용하여 G 단백질 결합 수용체 상호 작용의 생체내 부량에서

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

생물학

Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay

The oversimplified view of protein transmembrane domains as merely anchors in phospholipid bilayers has long since been disproven. In many cases membrane-spanning proteins have evolved highly sophisticated mechanisms of action.1-3 One way in which membrane proteins can modulate their structures and functions is by direct and specific contact of hydrophobic helices, forming structured transmembrane oligomers.4,5 Much recent work has focused on the distribution of amino acids preferentially found in the membrane environment in comparison to aqueous solution and the different intermolecular forces that drive protein association.6,7 Nevertheless, studies of molecular recognition at the transmembrane domain of proteins still lags behind those of water-soluble regions. A major hurdle remains: despite the remarkable specificity and affinity that transmembrane oligomerization can achieve,8 direct measurement of their association is challenging. Traditional methodologies applied to the study of integral membrane protein function can be hampered by the inherent insolubility of the sequences under examination. Biophysical insights gained from studying synthetic peptides representing transmembrane domains can provide useful structural insight. However, the biological relevance of the detergent micellar or liposome systems used in these studies to mimic cellular membranes is often questioned; do peptides adopt a native-like structure under these conditions and does their functional behaviour truly reflect the mode of action within a native membrane? In order to study the interactions of transmembrane sequences in natural phospholipid bilayers, the Langosch lab developed ToxR transcriptional reporter assays.9 The transmembrane domain of interest is expressed as a chimeric protein with maltose binding protein for location to the periplasm and ToxR to provide a report of the level of oligomerization (Figure 1).
In the last decade, several other groups (e.g. Engelman, DeGrado, Shai) further optimized and applied this ToxR reporter assay.10-13 The various ToxR assays have become a gold standard to test protein-protein interactions in cell membranes. We herein demonstrate a typical experimental operation conducted in our laboratory that primarily follows protocols developed by Langosch. This generally applicable method is useful for the analysis of transmembrane domain self-association in E. coli, where &#946;-galactosidase production is used to assess the TMD oligomerization propensity. Upon TMD-induced dimerization, ToxR binds to the ctx promoter causing up-regulation of the LacZ gene for &#946;-galactosidase. A colorimetric readout is obtained by addition of ONPG to lyzed cells. Hydrolytic cleavage of ONPG by &#946;-galactosidase results in the production of the light absorbing species o-nitrophenolate (ONP) (Figure 2).

An efficient procedure to assess the oligomerization propensity of single-pass transmembrane domains (TMDs) is described. Chimeric proteins consisting of the TMD fused to ToxR are expressed in an E. coli reporter strain. TMD-induced oligomerization causes dimerization of ToxR, activation of transcription and production of the reporter protein, -galactosidase.

ToxR 분석에 의해 결정 Transmembrane 도메인 Oligomerization의 성향

The oversimplified view of protein transmembrane domains as merely anchors in phospholipid bilayers has long since been disproven.  In many cases ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

라이브 셀의 단백질 응집체의 4D 영상

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Functional Characterization of Endogenously Expressed Human RYR1 Variants

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia susceptibility, core myopathies and centronuclear myopathy. Because of the diverse phenotypes linked to RYR1 mutations it is fundamental to characterize their functional effects to classify variants carried by patients for future therapeutic interventions and identify non-pathogenic variants. Many laboratories have been interested in developing methods to functionally characterize RYR1 mutations expressed in patients&#39; cells. This approach has numerous advantages, including: mutations are endogenously expressed, RyR1 is not over-expressed, use of heterologous RyR1 expressing cells is avoided. However, since patients may present mutations in different genes aside RYR1, it is important to compare results from biological material from individuals harboring the same mutation, with different genetic backgrounds. The present manuscript describes methods developed to study the functional effects of endogenously expressed RYR1 variants in: (a) Epstein Barr virus immortalized human B-lymphocytes and (b) satellite cells derived from muscle biopsies and differentiated into myotubes. Changes in the intracellular calcium concentration triggered by the addition of a pharmacological RyR1 activators are then monitored. The selected cell type is loaded with a ratiometric fluorescent calcium indicator and intracellular [Ca2+] changes are monitored either at the single cell level by fluorescence microscopy or in cell populations using a spectrofluorometer. The resting [Ca2+], agonist dose response curves are then compared between cells from healthy controls and patients harboring RYR1 variants leading to insight into the functional effect of a given variant.

Here methods used to study the functional effect of RYR1 mutations endogenously expressed in Epstein Barr Virus immortalized human B-lymphocytes and muscle biopsy derived satellite cells differentiated into myotubes are described.

내인성 표현 인간의 RYR1 변종의 기능적 특성화

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia ...

의학

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

총 내부 반사 형광 현미경 검사법에 의해 살아있는 세포에 있는 세포 표면 수용체의 올리고머화 역학 은 수 및 밝기 분석과 결합됩니다

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

대한 유전 및 생화학 적 접근

요약

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