저자 &#39;실험실에서 연구가 건강 보조금 R37 - HL041026, R01 - HL086483 및 R01 - HL056786 (SSS)과 미국 공공 보건 서비스에서 F32 - HL097463 및 T32 - AR048523 (PB)에 의해 국립 연구소에 의해 지원됩니다.

1. 애니멀 케어 및 사용 검토하고 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 승인에 따라, 적어도 12 주 된 수컷 생쥐를 사용합니다. 마우스 intraperitoneal (IP) 주입을 통해 pentobarbital 나트륨 (60 밀리그램 / kg)와 anesthetized 있습니다. 수술 절차 및 실험 프로토콜을 통해 마취는 필요에 따라 보조 (초기 주입의 10-20%, IP) (; 발가락이나 꼬리 공략 탈퇴 응답에 표시된 모든 30~60분)에 의해 유지됩니다. 실험 절차의 완료 후에 마우스 pentobarbital (IP) 및 경추 전위에 의해 euthanized과 과용이다. 2. Micropipettes 및 Microiontophoresis <ol><li> Microiontophoresis의 micropipettes는 (내부 팁 직경 ~ 1 μm의) 수평 피펫 풀러를 사용하여 borosilicate 유리 모세관 튜브의 준비가되어 있습니다. 우리는 강성을위한 ~ 5mm의 테이퍼를, 더 이상 tapers 더 유연하고 있습니다. </li><li> Micropipettes은 18.2 MΩ 물속에 녹아있는 1M ACH (Figure1A - C)와 backfilled 있습니다. backfilling 들어, microcapillary 튜브가 관심의 작용제 (그림 1)이있는 주사기에 결합 0.2 μm의 필터에 연결됩니다. 이들은 쉽게 조작 (아래) 또는 상용 공급 업체로부터 구입할 수 있습니다. microcapillary 튜브는 micropipette가 채웁니다로 microcapillary 튜브를 철수하면서 micropipette와 ACH 솔루션 루멘으로 전달의 백 엔드에 삽입됩니다. 아래 방향의 팁과 micropipette 개최, 공기 방울이 부드럽게 micropipette를 flicking에 의해 제거됩니다. </li><li> micropipette은 micromanipulator (그림 2)에 장착 홀더에 안전합니다. 홀더가 차례로 microiontophoresis 프로그래머의 긍정적인 단자에 연결된 외부 핀에 micropipette 이내 ACH 솔루션을 연결 은색 철사를하고 있습니다. 조직 준비의 가장자리에 보안 두 번째 은색 와이어는 micropipette의 끝에이 준비를 통해 생리 생리 식염수로 고급이므로 회로를 완료하기 위해 단자에 연결되어 있습니다. </li><li> 유지 전류가 micropipette 팁이 arteriolar 벽에 인접한 위치에있을 때 (또는 형광 응답) vasodilation을 방지하기 위해 적용됩니다. 현재 유지하면 micropipette 팁 (내경 = 1 μm의) 및 작용제 농도의 크기가 다를 수 있지만 정의 매개 변수 (우리가 1M ACH, 1 μm의 팁을 위해 ~ 200 NA를 사용)에 대한 매우 재현할 수 있습니다 것입니다. 유지 전류는 이미지 수집의 시작과 동기화 전자 트리거 (보충 그림 1)을 통해 현재의 배출의 전달과 일치하는 중단됩니다. </li></ol> 3. 미세 조작 <ol><li> XY 현미경 단계에 대한 사용자 지정 플랫폼은 강자성 스테인레스 스틸로 밖으로 가공되었습니다. 플랫폼 크기 (1 / 8 &quot;X 12&quot;X 13 &quot;) 자기 기지 (그림 2B)로 준비에 의해 결정 위치를 사용하도록 보안 (그림 2A) 원하는. Micromanipulators으로 실험 준비 주위에 위치 micromanipulators 충분한 공간을 수 있습니다.이가 관심 사이트 (그림 2C)에 위치 micropipettes 준비 주변 가공 플랫폼에 직접 배치. </li></ol> 4. 대표 결과 <ol><li> micropipette 팁이 arteriole에 인접한 위치로 ACH에 형광 반응 (ACH의 누출을 방지하기 위해 조정보다는 현재 유지)가 있습니다. 임계값 자극 아래 아무런 효과가 없었다. 그러나, 자극 강도가 증가로 내피 세포 칼슘 형광은 arteriole 따라 점차적으로 큰 거리 증가로 자극의 위치 (그림 3)에서 형광의 강도를 않았다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. Microiontophoresis의 Pipettes를 Backfilling위한 방법. A) microcapillary 튜브 (녹색 화살표)가. B) microcapillary 관으로 공급됩니다 다음 1M ACH 가득한 주사기에 연결된 필터 0.2 μm의 (보라색 화살표)에 첨부된 압축 피팅 (파란색 화살표)에 보안이 백 엔드 및 솔루션을 통해 microiontophoresis의 피펫은 피펫이 가득되면 아래 팁을 보유) micropipette. C의 루멘을 채우기 위해 있질 부드럽게 거품을 (검은색 화살표)를 제거하기 위해 테이퍼 위에 끄적입니다. <img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. Micromanipulator 배치에 대한 사용자 지정 플랫폼입니다. .. 실험 준비를 주변에 위치) 강자성 스테인레스 스틸 플랫폼 XY translational 단계를 포함하는 사용자 정의 MVX10 현미경 기지에 배치되었다 B) 원형 마그네틱베이스는 소형 3 축 micromanipulators의 하단에 부착된 C) Micromanipulators (관련 프로토콜을 참조하십시오 : 조브의 ID # 2874)는 관심의 특정 사이트를 연구하기 위해 서요.IR 컴팩트한 크기와 다재 다능한 여러 micropipettes를 동시에 사용할 수 있도록합니다. <img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. Arterioles에서 칼슘 형광가. arteriolar 벽을 라이닝 내피 세포의 칼슘 형광은 자극 강도로 증가했다. 처음 3 패널 A) 250 NA, B에 형광 반응의 이미지)를 표시 500 NA와 C) 현재 1000 NA의 방출 (전체 500 MS 펄스 기간). 내피 세포의 칼슘 형광이 증가하는 이상의 거리를 AC (각각 ~ 130, 270 400 μm의)에서 괄호로 표시됩니다. 각 패널에 arteriole 전체 기준선은 ACH에 형광 반응 (F / 정)이 자극의 사이트에 기록된 위치를 나타냅니다. 증가 ACH의 자극에 대한 F / 정 대 시간의 D) 레코딩. 현재의 배출이 증가로, F / 정은 진폭과 기간이 증가했다. 100 NA의 자극이 임계값 이하이고 전혀 아무런 영향을 미치지 않았다 않습니다. <img src="/files/ftp_upload/2900/2900sup1.jpg" alt="보충 그림 1" /> 보충 그림 1. 전자 트리거에 대한 회로 다이어그램.이 회로는 개인용 컴퓨터의 병렬 포트와 인터페이스입니다. 그것이 5V의 지속적인 TTL 펄스를 제공하면 활성화됩니다. 7805 칩은 9 12V DC 전원 공급 장치 (해당하는 전압의 배터리가 괜찮습니다)에 연결된 5V의 전압 조정기입니다. 7805에서 출력은 쿼드 정무 스위치와 회로의 출력 전원을 제공합니다. 1K 저항에 걸쳐 입력은 컴퓨터에서합니다.

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	<li>Majno, G., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+1.+The+effect+of+histamine+and+serotonin+on+vascular+permeability:+an+electron+microscopic+study.">Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).</li><li>Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+II.+The+site+of+action+of+histamine+and+serotonin+along+the+vascular+tree:+a+topographic+study.">Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).</li><li>Grant, R. 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C., &amp;amp, S. e. g. a. l., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasomotor+control+in+arterioles+of+the+mouse+cremaster+muscle.">Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle.</a> FASEB J. 14, 197-207 (2000).</li><li>Figueroa, X. F., Paul, D. L., Simon, A. M., Goodenough, D. A., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+role+of+connexin40+in+the+propagation+of+electrically+activated+vasodilation+in+mouse+cremasteric+arterioles+in+vivo.">Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo.</a> Circ. Res. 92, 793-800 (2003).</li><li>Wolfle, S. E., Schmidt, V. J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin45+cannot+replace+the+function+of+connexin40+in+conducting+endothelium-dependent+dilations+along+arterioles.">Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles.</a> Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).</li><li>Milkau, M., Kohler, R., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+importance+of+the+endothelial+K++channel+SK3+and+connexin40+in+arteriolar+dilations+during+skeletal+muscle+contraction.">Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction.</a> FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).</li><li>Bagher, P., Duan, D., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+impaired+neurovascular+transmission+in+a+murine+model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).</li><li>Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagated+endothelial+Ca2++waves+and+arteriolar+dilation+in+vivo:+measurements+in+Cx40BAC-GCaMP2+transgenic+mice.">Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice.</a> Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+denervation+on+skeletal+muscle+blood+vessels+(rat+cremaster).">The effects of denervation on skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> J. Anat. 100, 305-316 (1966).</li><li>Proctor, K. G., Busija, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+among+arteriolar,+regional,+and+whole+organ+blood+flow+in+cremaster+muscle.">Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle.</a> Am. J. Physiol. 249, H34-H41 (1985).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+blood+flow+in+the+microcirculation:+Role+of+conducted+vasodilation.">Regulation of blood flow in the microcirculation: Role of conducted vasodilation.</a> Acta Physiol. , (2011).</li><li>Hill, M. A., Simpson, B. E., Meininger, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+cremaster+muscle+hemodynamics+due+to+disruption+of+the+deferential+feed+vessels.">Altered cremaster muscle hemodynamics due to disruption of the deferential feed vessels.</a> Microvasc. Res. 39, 349-363 (1990).</li></ol>

동물과 관련된 모든 절차와 프로토콜은 미주리 대학의 동물 케어 및 사용위원회의 승인과 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 국립 연구소 건강의 가이드와 함께 조화롭게 수행되었습니다.이 문서의 생산은 스탠포드 Photonics 후원했다.

여기에서 설명한 프로토콜 microiontophoresis에 대한 micropipettes 준비하고 구현하는 방법을 보여줍니다. 아세틸콜린의 배송은 anesthetized 마우스 arterioles에서 칼슘 신호 기본 내피 의존 vasodilation을 설명하는 데 사용됩니다. 우리의 결과는 설명되는 ACH가 microiontophoresis의 micropipette (그림 3)에서 전류 방출의 강도와 내피 세포의 칼슘 형광 증가를 증가하는 이상의 거리. 휴식 조건에서 형광 증가의 부족 micropipette에서 ACH 무시할 수 누출을​​ 나타냅니다. 100 NA의 자극 강도 (그림 3, 전설)에 응답의 부족은 자극의 한계 강도가 증가 내피 세포의 칼슘을 필요는 것을 보여줍니다. 이 기술은 쉽게 다른 vasoactive 대리인 및 조직 준비에 적용할 수 있습니다. 실용적인 고려 사항 : arteriolar 반응을 연구하기 위해 microiontophoresis 작업에서 몇 가지를 인식해야합니다. 그것이 전달 작용제의 실제 농도를 결정하기 어려운 입증되었습니다 있지만, 자극 - 반응 곡선은 준비 시간과 사이에 재현할 수 있습니다. 이러한 펄스 기간은 상수 개최 (예, 500 MS)와 (; 그림 3 예, 250, 500 1000 NA) 배출은 현재 변화에 의해 수행할 수 있습니다. 또는 현재의 배출이 지속적으로 개최 수 있습니다 (예, 500 NA) 및 펄스 기간 다양한 (예, 250, 500 1000 MS). 정의된 작용제 농도의 행동에 대한 참조를 위해 준비가 적절한 솔루션 5 superfused 수 있습니다. 용질 방출을위한 원동력은 전기 요금의 움직임이기 때문에, 배달하는 에이전트는 micropipette에서 전이 될 수있는 그물 요금을 휴대해야합니다. 관심 에이전트가 기본 전하 캐리어 있는지 확인하기 위해, 그것은 전기 삼투을 최소화하기 위해 고농도 (예를 들어, ACH 1 M)에서 해산합니다. 이것은 micropipette의 충전 솔루션의 산도를 조작이 필요하면, 차량 컨트롤은 어떤 특이 현상이 효과를 확인할 필요가 있습니다. 적절한 컨트롤도 혼자 전류의 통과를 위해 수행되어야합니다 (예 : isotonic 호수 가득한 micropipettes를 사용하여). 릴리스의 해당 사이트에서 에이전트의 확산에 대한 효과적인 거리는 ascertained되어야하며 micropipette가에 위치이므로 가장 쉽게 생리적 반응 (예, vasodilation 또는 ACH의 배출에 따라 세포 내 칼슘의 증가)의 실종에 의해 경험적으로 결정됩니다 대상 사이트에서 거리를 정의. 연습에 효과적인 확산 거리가 크게 micropipette의 끝에이 조직의 위치에 얼마나 영향이며, 조직과 팁로 아래로 누르면 끝이 occluded 경우 예를 들어, 배출이 장애보다. 과도한 결합 조직, 특히 골칫거리이며, 수술 준비하는 동안 조직 표면에서 제거되어야합니다. 주의는 또한 지정된 에이전트의 팁을 파괴의 가능성을 부여해야합니다. 이것은 상대적으로 짧은 펄스를 (예 : ≤ 1 S)를 사용하여 최소화합니다. 지속 전류 (예 : 몇 초)으로 작용제 그것은 micropipette에서 일괄 작성 솔루션의 확산으로 대체 할 수있는 것보다 더 빠르게 일각에서 퇴학 수 있습니다. 하나는 (예를 들어, + 자극을 depolarizing K를 제공하기 위해) 지역 이온 환경을 변경하려고하는 경우에는 무시할 볼륨, microiontophoresis로 전이되기 때문에, 이것은 효과적으로 microiontophoresis로 달성되지 않을 수 있지만 쉽게 원하는 데 대량 액체의 압력 방출로 이루어진다 작곡. arteriole의 로컬 자극에 대한, 2-3 μm의 내부 직경과 micropipette 팁 분출 압력 4-5 PSI (28-35 kPa) 및 솔레노이드 밸브 10과 제어 펄스 기간 (예, 1 번째)와 함께 잘 작동합니다. microvessel에 micropipette에서 에이전트 지속적인 공급이 필요합니다 어디에, 압력 방출은 적절한 내부 팁 직경 (예 : ~ 10 μm의) 11,12의 micropipettes를 사용하는 것이 좋습니다. 꼭지 밸브로 알려진 높이의 정압 열은 ON / 정압 머리 잘 정의된, 저렴한를 제공합니다. 유량은 피펫 팁 및 운전 압력의 내부 직경에 의해 결정됩니다. 언제나처럼, 차량 제어 압력 방출의 특이 현상이 행동을 제외 필수적입니다.

<table><tbody><tr><td> 사용 재료 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> Borosilicate 유리 모세관 튜브 </td><td> 워너 인 스트 루먼트 </td><td> GC120F - 10 </td><td></td></tr><tr><td> 수평 피펫 풀러 </td><td> 서터 인 스트 루먼트 </td><td> 모델 P - 97 </td><td></td></tr><tr><td> 아세틸콜린의 클로라이드 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> A6625 </td><td></td></tr><tr><td> Luer 허브 어댑터 </td><td> Martech </td><td> AC1343 </td><td> microcapillary 튜빙을 확보 </td></tr><tr><td> 0.2 μm의 나일론 타이탄 필터 </td><td> 일 스리 </td><td> 42204 - NN </td><td> 손실을 최소화하기 위해 낮은 보존 볼륨 </td></tr><tr><td> 5 ML 주사기 </td><td> 백톤 디킨슨 (주) - </td><td> 309603 </td><td></td></tr><tr><td> 피펫 홀더 </td><td> 워너 인 스트 루먼트 </td><td> E45W - M12VH </td><td></td></tr><tr><td> 실버 와이어 </td><td> 워너 인 스트 루먼트 </td><td> AG10W </td><td> 0.25mm 직경 </td></tr><tr><td> 3 축 micromanipulator </td><td> 시스키유 디자인먼트 </td><td> DT3 - 100, MXB, MXC, MGB / 8 </td><td> 속이는 사람 부품은 그림과 같이 </td></tr><tr><td> microiontophoresis 현재 프로그래머 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 모델 260 </td><td></td></tr><tr><td> 트리거 장치 </td><td> 사용자 정의 </td><td> 사용자 정의 </td><td> 회로 Suppl에 제공됩니다. 그림 1 </td></tr><tr><td> 스테인레스 강판 </td><td> 맥매스터 - 카 </td><td> 1 / 8 &quot;X 12&quot;X 12 &quot; </td><td> 디자인에 따르면 </td></tr><tr><td> 강화 디지털 카메라 </td><td> 스탠포드 Photonics 부동산 </td><td> XR/Mega-10 </td><td> 파이퍼 제어 소프트웨어와 통합 </td></tr></tbody></table>

microiontophoresis and micromanipulation for intravital fluorescence imaging of the microcirculation

Microiontophoresis는 실험 준비 이내에 지정된 사이트에서 용질을 제공하는 micropipette 팁 통한 전류의 흐름을 알아볼 수 있습니다. Microiontophoresis는 reproducibly 뉴런이 신경 전달 물질에와 neuropeptides를 제공함으로써 시냅스 전송 1 시뮬레이션할 수 있습니다. 무시할 수 량 (액체)이 변위는 실험 준비에 기계 소동을 방지합니다. 엑기스 3 이러한 기술을 채택하는 것은 vasodilation와 vasoconstriction의 메커니즘은 생체내 4,5에서 가장 미세한 수준에서 공부를 할 수있게되었습니다. 이러한 언어 전달의 주요 이점은이를 microvessels의 본질적인 속성을 공개 혈압 및 조직 혈액 흐름 체계 또는 재귀 변경, evoking 않고 microvascular 네트워크 내에서 정의된 사이트에서 공부하는 vasomotor 응답을 활성화합니다. microiontophoresis의 제한은 관심을 사이트로 전달 에이전트의 정확한 농도가 확인할 6 어렵다는 것입니다. 그럼에도 불구하고, micropipette 팁에서 출시된 현재 방출의 강도와 기간에 비례 2,7, 그러한 것을 재현할 자극 - 반응 관계는 쉽게 정의 실험 조건 (아래에 설명된)에서 확인할 수 있습니다. microiontophoretic 전달에 영향을 미치는 추가적인 요인은 용질 농도와 솔루션에 자사의 이온화를 포함합니다. micropipette 팁의 내경이 유지 전류 counteracted 수 있습니다 diffusional &#39;누출&#39;을, 최소화하기 위해 ~ 1 μm의 이하해야합니다. 따라서 외부 (긍정적인) 전류는 양이온과 micropipette 내에서 그것을 유지하는 데 사용하는 부정적인 전류를 추출하는 데 사용됩니다. micropipettes의 제작은 복잡한 전자 pullers 8 용이합니다. Micropipettes 그 필라멘트를 포함하는 유리 모세관 튜브에서 나온있는 백 엔드 ( &quot;backfilled&quot;)에서 가득 micropipette의 일각에 &#39;빅스&#39;솔루션입니다. 이것은 micropipette의 루멘에 관심과 꺼내기 솔루션의 솔루션을 포함하고있는 주사기에 연결된 microcapillary 튜브를 삽입하여 이루어집니다. Micromanipulators는 실험 준비 시간 micropipettes의 원하는 위치를 설정합니다. 이동식 기지에 장착 Micromanipulators는 microvascular 네트워크 (아래 개발)의 지형에 따라 준비 주위에 위치하실 수 있습니다. 내피 의존 vasodilation 생산 : 마우스 cremaster 근육의 준비 arteriole (목성의 ID # 2874 관련 프로토콜을 참조)에 - 현재의 프로토콜은 아세틸콜린의 microiontophoresis (ACH + Club 호텔)를 보여줍니다. 자극 전달은 전자 트리거를 사용하여 디지털 이미지 수집과 동기화됩니다. Cx40 BAC - GCaMP2 유전자 변형 생쥐 9 사용은 생활 엑기스에 arteriolar 내피 세포에서 vasodilation을 기본 세포내 칼슘 반응의 시각화 수 있습니다.

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Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis은 micropipette의 내부와 외부 사이의 전기 잠재력의 차이에 대한 응답으로 micropipette에서 이온의 움직임을 알아볼 수 있습니다. 생물 학적 활성 분자는이를 통해 전류에 비례하여 전달됩니다. 우리는 엑기스에서 내피 의존 vasodilation 공부를 미세 조작과 함께 아세틸콜린의 microiontophoresis을 설명합니다.

엑기스의 Intravital 형광 이미징을위한 Microiontophoresis 및 미세 조작

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

microiontophoresis-micromanipulation-for-intravital-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

14.4K 조회수.  University of Missouri. Microiontophoresis은 micropipette의 내부와 외부 사이의 전기 잠재력의 차이에 대한 응답으로 micropipette에서 이온의 움직임을 알아볼 수 있습니다. 생물 학적 활성 분자는이를 통해 전류에 비례하여 전달됩니다. 우리는 엑기스에서 내피 의존 vasodilation 공부를 미세 조작과 함께 아세틸콜린의 microiontophoresis을 설명합니다.

비디오: Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental biology and gene expression studies. The technique renders biological sample optically transparent by first dehydrating them and then placing in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution). The technique renders biological samples optically transparent by first dehydrating them in graded ethanol solutions then placing them in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution) to clear. After the clearing process the scattering contribution in the sample can be greatly reduced and made almost negligible while the absorption contribution cannot be eliminated completely. When trying to reconstruct the fluorescence distribution within the sample under investigation, this contribution affects the reconstructions and leads, inevitably, to image artifacts and quantification errors.. While absorption could be reduced further with a permanence of weeks or months in the clearing media, this will lead to progressive loss of fluorescence and to an unrealistically long sample processing time. This is true when reconstructing both exogenous contrast agents (molecular contrast agents) as well as endogenous contrast (e.g. reconstructions of genetically expressed fluorescent proteins).

We suggest a Born normalized approach for Optical Projection Tomography (BnOPT) that accounts for the absorption properties of imaged samples to obtain accurate and quantitative fluorescence tomographic reconstructions. We use the proposed algorithm to reconstruct the fluorescence molecular probe distribution within small animal organs.

전체 심장 이미징에 대한 형광 광 프로젝션 Tomography에 대한 출생 정규화

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

연구

생물학

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

에 대한 Mesoscopic 형광 Tomography 인 - 생체내</em개발> 이미징 Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic by-products. This balance is achieved by the movement of blood through the microcirculation, which encompasses the smallest branches of the vascular supply throughout all tissues and organs. Arterioles branch from arteries to form networks that control the distribution and magnitude of oxygenated blood flowing into the multitude of capillaries intimately associated with parenchymal cells. Capillaries provide a large surface area for diffusional exchange between tissue cells and the blood supply. Venules collect capillary effluent and converge as they return deoxygenated blood towards the heart. To observe these processes in real time requires an experimental approach for visualizing and manipulating the living microcirculation.
The cremaster muscle of rats was first used as a model for studying inflammation using histology and electron microscopy post mortem1,2. 
The first in vivo report of the exposed intact rat cremaster muscle investigated microvascular responses to vasoactive drugs using reflected light3. However 
curvature of the muscle and lack of focused illumination limited the usefulness of this preparation. The major breakthrough entailed opening the muscle, 
detaching it from the testicle and spreading it radially as a flat sheet for transillumination under a compound microscope4. While shown to be a valuable 
preparation to study the physiology of the microcirculation in rats5 and hamsters6, the cremaster muscle in mice7 has proven particularly useful in dissecting 
cellular pathways involved in regulating microvascular function8-11 and real-time imaging of intercellular signaling12. 
The cremaster muscle is derived from the internal oblique and transverse abdominus muscles as the testes descend through the inguinal canal13. 
It serves to support (Greek: cremaster = suspender) and maintain temperature of the testes. As described here, the cremaster muscle is prepared as a thin flat sheet 
for outstanding optical resolution. With the mouse maintained at a stable body temperature and plane of anesthesia, surgical preparation involves freeing the muscle 
from surrounding tissue and the testes, spreading it onto transparent pedestal of silastic rubber and securing the edges with insect pins while irrigating it 
continuously with physiological salt solution. The present protocol utilizes transgenic mice expressing GCaMP2 in arteriolar endothelial cells. GCaMP2 is a 
genetically encoded fluorescent calcium indicator molecule12. Widefield imaging and an intensified charge-coupled device camera enable in vivo study of 
calcium signaling in the arteriolar endothelium.

A tissue preparation is described for visualization and experimental manipulation of the living microcirculation. In anesthetized male mice, the thin, highly vascularized cremaster muscle is prepared for intravital microscopy to study microvascular networks including arterioles, capillaries and venules. This preparation is readily adapted for rats and hamsters.

엑기스의 Intravital 이미징을위한 마우스 Cremaster 근육 준비

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

주변 줄기 세포 이주의 분석을위한 마우스 Cremaster 근육에있는 미세 혈관의의 intravital 현미경

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

형광 단백질을 표현 라이브 마우스의 이미징 세포 이하의 구조물의 intravital 현미경

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

신속한 분석 및 형광 현미경 이미지의 탐사

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

하나 나노 미터의 정확도와 형광 이미징 (피오나)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.

Micromanipulation 기법 전체적 역동성의 분석 및 Cytoskeletal 레 귤 레이 터의

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell motility, or cell signaling. The green algae Chlamydomonas reinhardtii has proven to be an insightful model in the study of centriole architecture, function, and protein composition. Despite great advances toward understanding centriolar architecture, one of the current challenges is to determine the precise localization of centriolar components within structural regions of the centriole in order to better understand their role in centriole biogenesis. A major limitation lies in the resolution of fluorescence microscopy, which complicates the interpretation of protein localization in this organelle with dimensions close to the diffraction limit. To tackle this question, we are providing a method to purify and image a large number of C. reinhardtii centrioles with different orientations using super-resolution microscopy. This technique allows further processing of data through fluorescent single-particle averaging (Fluo-SPA) owing to the large number of centrioles acquired. Fluo-SPA generates averages of stained C. reinhardtii centrioles in different orientations, thus facilitating the localization of distinct proteins in centriolar sub-regions. Importantly, this method can be applied to image centrioles from other species or other large macromolecular assemblies.

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

We have developed a strategy to purify and image a large number of centrioles in different orientations amenable for super-resolution microscopy and single-particle averaging.

절연 및 Chlamydomonas Centrioles의 단일 입자 재건을 위한 형광 이미징

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...