이 작품은 LJMC으로 국립 보건원에서 보조금 R01 - HL87290, R01 - HL87290 - S1과 R01 - AI082610에 의해 지원되었다.

1. Craniotomy 8 대 10 주 된 생쥐의 craniotomy은 티타늄 바에는 동물의 머리에 배치 아니라는 것을 제외하고, 이전에 설명한 1로 사전에 수행되어야합니다. 만성 두개골 창문조차 개월 이식 후에 pial 엑기스의 안정적인 준비 있도록 시험입니다. 보통, 우리는 2-3 주 두개골 창 주입 후 우리의 연구를 수행합니다. 2. Intravital 현미경 <ol><li> 두 - 3 주 craniotomy 후 체온을 선택한 다음 마우스로 가볍게 anesthetized입니다 isoflurane (유도 4 %, 유지 보수 1-2 %). 라이트 마취는 실험 절차를 수행하는 동안 동물의 스트레스와 불편을 방지하는 데 사용됩니다. </li><li> 동물은 다음 stereotaxic 프레임과주의 깊게 귀 막대를 사용하여 보안 머리에 발생하기 쉬운 위치에 배치됩니다. 수준은 오른쪽과 왼쪽 레버를 사용하여 조정됩니다. 핵심 체온은 가열 패드를 사용하여 유지됩니다. 대뇌 말라리아와 쥐가 저체온증을 개발하기 때문에, 온도 설정은 각각의 동물에 따라 조정해야합니다. </li><li> 두개골 창문에 커버 슬립이 부드럽게 면봉은 광유와 창 아래에있는 혈관의 파노라마 사진이 stereomicroscope과 디지털 카메라 (니콘 Coolpix 995, 일본)의 도움으로 가져옵니다과 moistened 목화와 함께 청소합니다. 사진은 인쇄를 식별하고 날짜와 혈관 직경과 적혈구 세포 (RBC) 판매율의 측정을위한지도로 사용하게됩니다. </li><li> 마우스는 다음 intravital 현미경 스테이지 (Leica - 맥베인, 샌디에고, CA 맞춤)로 전송됩니다. 물방울이 잘 치과 아크릴로 만들어 활용 두개골 창에 위치, 초점이 조정됩니다. 측정은 20X (LUMPFL - WIR, 수치 조리개 0.6, 올림푸스) 물 침지 목표를 사용하여 수행됩니다. 같은 혈관들은 기본 레벨로 직접 비교가 작은 샘플 집단에 대한 더 강력한 통계있게 수행될 수 있도록 다음 있습니다. 이미지는 디지털 낮은 광 고속 카메라 (하마 마츠 C9300 - 221, 일본) 또는 VCR 테이프에 연결된 낮은 광 아날로그 카메라 (COHU 4815, 샌디에고, CA) (JVC, 일본), 스탬프 시간 (MicroImage 비디오를 사용하여 캡처되어 시스템, 보여 타운, PA) 및 컬러 모니터 (PELCO, 클로 비스, CA). 테이프가 제대로 기록 시작하기 전에 식별하고 타임 스탬프는 이벤트 recoded되었던 동안 기간을 문서화하여 이벤트의 식별을 허용합니다. </li><li> 혈관의 첫 번째 검사 혈액은 모든 혈관에 흐르는 경우 준비의 품질을 평가하기 위해 만든 것입니다. 그런 다음, 측정하는 혈관의 선택 사항이 있으며, 그것은 서로 다른 직경의 venules과 arterioles을 (우리가 마우스를 pial 준비에서, 대부분의 선박은 20 80μm 사이의 범위) 포함하고 창을에 의해 노출되는 영역 내에서 서로 다른 위치를 커버한다. Arterioles과 venules 쉽게 선박의 파급 효과에 혈액 흐름 (이것은 배포 또는 혈액을 수집 여부)의 방향을 선택하여 구분하실 수 있습니다. 우리의 연구에서 측정 12 혈관에서 만들어집니다. 측정 각 지점의 정확한 위치는 pial vasculature의 그림에 주석이있다. </li><li> 각 지점은 혈관의 직경은 이미지 전단 장치 (이미지 쉬어, 비스타 전자, 샌디에고, CA) 2를 사용하여 측정됩니다. 장소가 선택되면, 선박의 이미지가 수직 위치에 정렬되고 반대 극단이 정렬되고 읽기가 문서화 때까지 이미지가 가지각색입니다. 이 값은 십자선 보정 스테이지 마이크로 미터 (에드먼드 광학 주식 회사, 배링턴, NJ)를 사용하여 각 특정 배율의 이전 교정하여 micrometers로 번역하실 수 있습니다. </li><li> 각 지점은 적혈구 추적 적어도 30 초 동안 기록됩니다. 추적, 혈액 샘플을 수집하고, 적혈구는 찬란로 표시하는 염료 Dil (분자 프로브, 칼스 배드, CA)와 ~ 0.4-0.5 % 3의 생체내 농도를 얻기 위해 꼬리 정맥을 통해 주입을 carbocyanine. , 레이블없이 주입, Plasmodium berghei 앙카 (PBA)는 녹색 형광 단백질 (CJ Janse와 AP 워터스에 의해 입금 PBA - GFP, 말라리아 연구 및 참조 시약 리소스 센터 MR4, 머내서스, VA에서 기부금을) 표현에 감염된 동물 세포가 필요합니다. 영상은 초당 150 프레임에 기록됩니다. 이 요금은 8mm / s의 최대 판매율의 결정에 대해 하나의 비디오 프레임에 셀 1-6 이미지를 얻을로 설정되어 있습니다 비디오 이미지는 어도비 프리미어 4.0 소프트웨어를 사용하여 개인용 컴퓨터와 디지털 있으며, 각 셀에 이미지를위한 XY 좌표 데이터는 SigmaScan 프로 4.0 소프트웨어 (SPSS 시카고, IL) 4를 사용하여 얻을 수 있습니다. 셀 위치는 훈련 관찰자의 눈이되는 세포의 중심의 위치의 좋은 평가를 제공 표시된 것을 감안할 때, 이미지를 분석하여 수동보다는 결정됩니다일반적으로 H는 대부분의 세포 오리 엔테이션에 대한 관찰 최대한의 형광의 위치에 해당합니다. 위치와 속도의 다중 결정은 각 셀에 대해 만든 의미 RBC 속도를 얻기 위해 평균입니다. </li><li> RBC 속도 측정이 오프라인 수행하는 경우, 각각의 마우스에 대한 총 관측 시간은 마취의 cardiodepressive 효과를 최소화 10-15분를 초과하지 않습니다. </li><li> 혈관 직경과 RBC 속도 측정을 사용할 수 있습니다되면, 각 선박의 혈액 흐름의 계산 공식을 사용하여 만들 수 있습니다 : Q = V X π (D / 2) 2, 어디서 Q = 혈액의 흐름, V = RBC 속도와 D = 혈관 직경. </li><li> 이러한 절차는 시간이 지남에 따라 반복 수 있습니다. 예를 들어, 뇌성 말라리아의 마우스 모델에서, 우리는 감염 4 일 시작하는 매일 측정을 수행합니다. 각각의 마우스에 대한 매일 얻은 값은 100 %로 간주됩니다 일 0 관계 (예정 감염)에 정규화합니다. </li><li> 혈관 직경과 혈류 측정 이외에 추가적인 평가는 인스턴스 개선 재관류의 평가 및 pial 혈관에 백혈구 및 / 또는 혈소판 압연 및 준수의 분석을 위해, 수행할 수 있습니다. 이러한 측정은 형광 라벨이 표시된 마커의 도움으로 수행됩니다. 말라리아의 경우, 우리는 또한 GFP를 표현 PBA의 변형을 사용하는 방법으로 순환하거나 자기편 기생충를 검색할 수 있습니다. </li><li> 재관류 평가에 대한 우리의 솔루션을 사용 FITC - 표시된 (시그마, 세인트 루이스, MO 50μg/mouse) 알부민, 그리고 우리가 텍사스 레드 (TxR)로 표시된 팬 백혈구 마커 CD45에 대한 항체를 사용 pial 선박 백혈구 준수를 수치 ( Invitrogen, 칼스 배드, CA 4μg/mouse). 이 경우, 알부민 - FITC (2mg/mL) 및 안티 CD45 - PE 항체의 20μL가 (200μg/mL) 혼합 및 사전 예열 꼬리 정맥에 주사의 25μL. 누설 측정 알부민 - FITC가 15 분 동안 순환을 허용 소요됩니다 경우 마우스 그러면하지만, 바로 몇 군데 있습니다. XF100 - 2 (오메가 광학, 브레 틀 보로, VT), 및 안티 CD45 - TxR 형광이 (615nm) 종료하고 있습니다 : 알부민 - FITC와 GFP (PBA - GFP pRBC)에 의해 방출 그린 형광 (518nm)를 사용 비비드 ALPHA 캡처입니다 XF42 : 비비드 표준 캡처. </li><li> 형광 - 라벨 알부민은 관통 선박을 포함하여 혈관 네트워크의 향상된 시각화를 허용하고, 이러한 비 perfused 이하 - perfused 선박에 대한 확인 뇌성 말라리아와 같은 질병 상태에 특히 유용합니다. 또한 혈관 누출 5 측정하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 형광 라벨이 표시된 안티 CD45 항체는 pial 선박 백혈구 압연과 접착력을 식별하고 계량 쉽게합니다. 부량의 편견을 피하기 위해, 우리는 동일한 반점 혈액 흐름을 측정하기 위해 사전에 정의된 압연과 접착력을 계량. 백혈구 유착의 부량는 100μm - 선박 길이 leukocytes의 수를 계산하여 이루어집니다. 롤링은 30 초 동안 같은 100μm 길이가 혈액 속도보다 훨씬 느린 속도로 움직이고 leukocytes의 수를 계산하여 계량입니다. </li></ol> 3. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 두개골 창을 통해 액세스할 마우스 pial 혈관 네트워크 (단계 2.6) 사진. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 마우스 pial 엑기스의 intravital 현미경을위한 세트 (단계 3.1-3.5) 도식 디스플레이까지. 1 : intravital 현미경, 2 : 20X 물 침지 목표, 3 : 광원, 4A : 디지털 낮은 광 고속 카메라, 4B : 아날로그 카메라, 5 stereotaxic 프레임에 마우스, 6 : 컴퓨터 모니터, 7 : 아날로그 시어러 이미지 전단 (화살표)가 혈관 직경을 측정하기위한 것입니다 방법을 보여주는 모니터. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 고속 형광 영상 레코딩에서 세포 추적하여 (단계 3.6-3.8) Microvascular 적혈구 세포 속도 측정. F에 사진은 카메라에 의해 미세한 구분된 필드를 건너 하나의 움직이는 RBC를 보여주는 한 pial 선박의 시퀀스 이미지입니다. 의 사전 조정 거리와 필드를 건너 15 인 이상 세포의 프레임 위치로 프레임의 수동 결정은 Excel 스프레드 시트의 도움으로 각 선박에 의미 RBC 속도의 계산을 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. Plasmodium berghei 앙카 (PBA) 감염된 생쥐 (n은 = 5) 시간이 지남에와 감염되지 않은 컨트롤 마우스의 pial 혈액 흐름의 변화를 보여주는 대표적인 실험 (단계 3.9) 데이터 (n은 = 5). 컨트롤 마우스의 pial 혈액 흐름이 시간이 지남에 따라 상대적으로 안정 반면, PBA에 감염된 마우스는 혈액의 흐름에 표시된 감소를 보여대뇌 말라리아 개발 (6 일)의 시간에. 데이터는 평균 ± SEM 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5. Plasmodium berghei 앙카에 감염된 마우스의 pial 선박 자기편 leukocytes의 (단계 4.3) 다수의 같은 반 CD45 - 텍사스 레드 형광 항체와 얼룩으로 나타났다.

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	<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J. Vis. Exp. (15), (2008).</li><li>Intaglietta, M., Tompkins, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+measurements+by+video+image+shearing+and+splitting.">Microvascular measurements by video image shearing and splitting.</a> Microvasc. Res. 5, 309-312 (1973).</li><li>Briceno, J. C., Cabrales, P., Tsai, A. G., Intaglietta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+displacement+of+red+blood+cells+during+hemodilution+and+the+effect+on+arteriolar+oxygen+profile.">Radial displacement of red blood cells during hemodilution and the effect on arteriolar oxygen profile.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1223-1228 (2004).</li><li>Bishop, J. J., Nance, P. R., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+erythrocyte+aggregate+size+and+flow+rate+in+skeletal+muscle+venules.">Relationship between erythrocyte aggregate size and flow rate in skeletal muscle venules.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, H113-120 (2004).</li><li>Baldwin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+hemoglobins+produce+venular+interendothelial+gaps+and+albumin+leakage+in+the+rat+mesentery.">Modified hemoglobins produce venular interendothelial gaps and albumin leakage in the rat mesentery.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 277, H650-H659 (1999).</li><li>Cabrales, P., Zanini, G. M., Meays, D., Frangos, J. A., Carvalho, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+cerebral+malaria+is+associated+with+a+vasospasm-like+microcirculatory+dysfunction,+and+survival+upon+rescue+treatment+is+markedly+increased+by+nimodipine.">Murine cerebral malaria is associated with a vasospasm-like microcirculatory dysfunction, and survival upon rescue treatment is markedly increased by nimodipine.</a> Am. J. Pathol. 176 (3), 1306-1315 (2010).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에서 설명한 intravital 현미경 메서드는 마우스의 pial 엑기스에 대한 자세한 관찰을위한 독특하고 강력한 도구를 제공합니다. 그것은 다른 개인 arterioles 및 venules 뽑아 내서와 같은 혈관 직경, RBC의 판매율, 혈액의 흐름, 준수 및 leukocytes, 혈소판 및 기타 혈액 요소, 혈관 누출, 조직 산도와 pO2의 압연과 같은 매개 변수의 개수의 변화를 측정 수 있으며 잠재적으로 여러 응용 프로그램입니다. ?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>FDG9623</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Carbocyanine dye Dil </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes</td>
<td>D306</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Albumin-FITC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A9771</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-CD45-TxR Ab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>MCD4517</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P. berghei ANKA-GFP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MR4</td>
<td>MRA-865</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

intravital microscopy of the mouse brain microcirculation using a closed cranial window

이 실험 모델은 생체내 형광 현미경을 사용하여, 급성과 만성, 생리학 및 pathophysiological hemodynamic, 염증 및 대사 조건 중에 마우스 pial 엑기스를 평가하도록 설계되었습니다. 폐쇄 두개골 창이 생쥐의 왼쪽 parieto - 후두 피질을 통해 배치됩니다. 지역 엑기스는 에피와 형광 조명하고, 혈관의 직경 및 적혈구 세포 (RBC) 판매율이 수행되는 측정을 사용하여 창문을 통해 실시간으로 기록됩니다. RBC 속도는 실시간 상호 상관 및 / 또는 형광 라벨이 표시된 적혈구를 사용하여 측정됩니다. 재관류과 혈관 누출의 pial 선박 및 평가 백혈구와 혈소판 준수는 그러한 알부민 - FITC 및 안티 CD45 - TxR 항체로 형광 라벨이 표시된 마커의 도움으로 만들어집니다. 엑기스 반복 며칠 동안 비디오 녹화하실 수 있습니다. 우리는 처음으로 생쥐에서 Plasmodium berghei 앙카 감염의 과정 동안 역동적인 변화를 따라 CM의 표현이 혈액에 깊은 감소, vasoconstriction의 특징 microcirculatory 기능 장애와 관련된 것을 보여주기 위해 pial 엑기스를 연구하기 위해 창 닫기 두뇌 intravital 현미경에 사용 흐름과 혈관 결국 붕괴.

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Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

pial 엑기스의 시간적 및 공간적 hemodynamic 및 염증성 이벤트를 따라 Intravital 현미경.

휴일 두개골 윈도우를 사용하여 마우스 뇌 엑기스의 Intravital 현미경

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

intravital-microscopy-mouse-brain-microcirculation-using-closed

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.2K 조회수.  University of California, San Diego. pial 엑기스의 시간적 및 공간적 hemodynamic 및 염증성 이벤트를 따라 Intravital 현미경.

비디오: Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

An Experimental Platform to Study the Closed-loop Performance of Brain-machine Interfaces

The non-stationary nature and variability of neuronal signals is a fundamental problem in brain-machine interfacing. We developed a brain-machine interface to assess the robustness of different control-laws applied to a closed-loop image stabilization task. Taking advantage of the well-characterized fly visuomotor pathway we record the electrical activity from an identified, motion-sensitive neuron, H1, to control the yaw rotation of a two-wheeled robot. The robot is equipped with 2 high-speed video cameras providing visual motion input to a fly placed in front of 2 CRT computer monitors. The activity of the H1 neuron indicates the direction and relative speed of the robot's rotation. The neural activity is filtered and fed back into the steering system of the robot by means of proportional and proportional/adaptive control. Our goal is to test and optimize the performance of various control laws under closed-loop conditions for a broader application also in other brain machine interfaces.

We use a closed-loop fly-machine interface to investigate general principles in neuronal control.

뇌 - 기계 인터페이스의 폐쇄 루프 성능을 연구하기 위해 실험 플랫폼

The non-stationary nature and variability of neuronal signals is a fundamental problem in brain-machine interfacing. We developed a brain-machine ...

연구

신경과학

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

마우스 뇌의 장기 이미징을위한 세련된와 철근 Thinned-해골 창

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

YFP를 표현 잡습니다 마우스 뇌의 Multiphoton 현미경

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Extinction Training During the Reconsolidation Window Prevents Recovery of Fear

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents the return of fear. Pavlovian fear-conditioning paradigms are commonly employed to create a controlled, novel fear association in the laboratory. After pairing an innocuous stimulus (conditioned stimulus, CS) with an aversive outcome (unconditioned stimulus, US) we can elicit a fear response (conditioned response, or CR) by presenting just the stimulus alone1,2 . Once fear is acquired, it can be diminished using extinction training, whereby the conditioned stimulus is repeatedly presented without the aversive outcome until fear is no longer expressed3. This inhibitory learning creates a new, safe representation for the CS, which competes for expression with the original fear memory4. Although extinction is effective at inhibiting fear, it is not permanent. Fear can spontaneously recover with the passage of time. Exposure to stress or returning to the context of initial learning can also cause fear to resurface3,4.
Our protocol addresses the transient nature of extinction by targeting the reconsolidation window to modify emotional memory in a more permanent manner. Ample evidence suggests that reactivating a consolidated memory returns it to a labile state, during which the memory is again susceptible to interference5-9. This window of opportunity appears to open shortly after reactivation and close approximately 6hrs later5,11,16, although this may vary depending on the strength and age of the memory15. By allowing new information to incorporate into the original memory trace, this memory may be updated as it reconsolidates10,11. Studies involving non-human animals have successfully blocked the expression of fear memory by introducing pharmacological manipulations within the reconsolidation window, however, most agents used are either toxic to humans or show equivocal effects when used in human studies12-14. Our protocol addresses these challenges by offering an effective, yet non-invasive, behavioral manipulation that is safe for humans.
By prompting fear memory retrieval prior to extinction, we essentially trigger the reconsolidation process, allowing new safety information (i.e., extinction) to be incorporated while the fear memory is still susceptible to interference. A recent study employing this behavioral manipulation in rats has successfully blocked fear memory using these temporal parameters11. Additional studies in humans have demonstrated that introducing new information after the retrieval of previously consolidated motor16, episodic17, or declarative18 memories leads to interference with the original memory trace14. We outline below a novel protocol used to block fear recovery in humans.

Conditioned fear can be diminished through an inhibitory process called extinction, but can resurface under conditions such as the passage of time or exposure to stress. Our protocol presents a novel way of preventing fear recovery by introducing extinction during the reconsolidation window (the re-storage phase of a reactivated memory).

Reconsolidation 창 동안 멸종 교육은 두려움의 복구를 방지

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

소뇌 과립 신경 세포의 유전자 조작<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em&gt; 신경 세포의 형태와 마이그레이션을 연구하는

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

모델로 후각 시스템은 축삭 성장 패턴 및 형태를 연구하는<em&gt; 생체</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies using Drosophila have contributed important breakthroughs in understanding neurological processes. Thus, with the goal of understanding the cellular and molecular basis of TBI pathologies in humans, we developed the High Impact Trauma (HIT) device to inflict closed head TBI in flies. Flies subjected to the HIT device display phenotypes consistent with human TBI such as temporary incapacitation and progressive neurodegeneration. The HIT device uses a spring-based mechanism to propel flies against the wall of a vial, causing mechanical damage to the fly brain. The device is inexpensive and easy to construct, its operation is simple and rapid, and it produces reproducible results. Consequently, the HIT device can be combined with existing experimental tools and techniques for flies to address fundamental questions about TBI that can lead to the development of diagnostics and treatments for TBI. In particular, the HIT device can be used to perform large-scale genetic screens to understand the genetic basis of TBI pathologies.

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Here we describe a method to inflict closed head traumatic brain injury (TBI) in Drosophila. This method provides a gateway to investigate the cellular and molecular mechanisms that underlie TBI pathologies using the vast array of experimental tools and techniques available for flies.

폐쇄 머리 외상성 뇌 손상을 입힐 수있는 방법<em&gt; 초파리</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal (PHASOR): A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated thinning of the skull. Cranial window surgery is typically performed with a high speed rotary drill, and many investigators find it challenging to prevent the drill from damaging the delicate dura and blood vessels. Extensive training and practice is required to remove the bone without damage to underlying tissue and thus cranial window surgery can be difficult, time consuming, and produce tissue damage. Piezoelectric surgery, which is extensively used for maxillofacial and dental surgery, utilizes ultrasonic vibrations to remove bone without damaging soft tissues. We have developed a method applying piezoelectric surgery to improve cranial window surgery in mice in preparation for multiphoton imaging. Comparisons within our lab find that the method requires less surgery time and has a lower average rate of complications due to dural bleeding than cranial window surgery with a rotary drill.

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal PHASOR: A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Piezoelectric surgery has led to improvements in human maxillofacial and dental surgery. We have developed a protocol to optimize piezoelectric surgery for cranial window surgery in mice.

압 전 높은 정확도 Osteal 제거 수술 (위상): 쥐에 향상 된 두개골 창 수술 기법

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

마우스에 있는 Laminectomy 및 척수 창 이식

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a protein, it is vital to also determine its distribution. Here, we describe a protocol employing immunofluorescence, confocal microscopy, and computer-based analysis to determine the distribution of the synaptic protein Mover (also called TPRGL or SVAP30). We compare the distribution of Mover to that of the synaptic vesicle protein synaptophysin, thereby determining the distribution of Mover in a quantitative manner relative to the abundance of synaptic vesicles. Notably, this method could potentially be implemented to allow for comparison of the distribution of proteins using different antibodies or microscopes or across different studies. Our method circumvents the inherent variability of immunofluorescent stainings by yielding a ratio rather than absolute fluorescence levels. Additionally, the method we describe enables the researcher to analyze the distribution of a protein on different levels: from whole brain slices to brain regions to different subregions in one brain area, such as the different layers of the hippocampus or sensory cortices. Mover is a vertebrate-specific protein that is associated with synaptic vesicles. With this method, we show that Mover is heterogeneously distributed across brain areas, with high levels in the ventral pallidum, the septal nuclei, and the amygdala, and also within single brain areas, such as the different layers of the hippocampus.

Here, we describe a quantitative approach to determining the distribution of a synaptic protein relative to a marker protein using immunofluorescence staining, confocal microscopy, and computer-based analysis.

면역 형광 검사를 사용 하 여 마우스 뇌의 시 냅 스 단백질의 다른 유형의 분포를 측정

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...