이 연구는 룬드벡 재단, NOVO-Nordisk 재단, 덴마크 독립 연구 위원회의 지원을 받았습니다 | 의료 과학, 그리고 건강한 노화 센터에 NORDEA 재단 보조금.

동물과 관련된 모든 절차는 실험 및 기타 과학적 목적으로 사용되는 척추 동물 보호를 위한 유럽 이사회 협약에 명시된 지침에 따라 덴마크 국가 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 도착 지침을 준수하고 있었습니다. 이것은 마취 회복 전에 마우스가 안락사되는 말단 절차입니다.
1. 수술 전 준비
<ol><li>수술 테이블과 주변 의 모든 부위를 70 % 에탄올로 청소하십시오. 수술 전에 수술 도구를 철저히 청소하고 건조시십시오.</li>
	<li>NG2DsRed 마우스를 마취 (Tg (Cspg4-DsRed.T1)1Akik/J; 두 성별; 4-8 개월) 케타민 + 자일라진의 복막 주입에 의해 (60 mg / kg + 10 mg /kg) 멸균 된 물에 용해, pH 7.4. 케타민의 추가 복용량을 관리 (30 mg/kg) 매 25 수술의 완료까지 분. 꼬리와 발가락 핀치 반사를 정기적으로 확인하여 마취의 깊이를 확인하십시오.</li>
	<li>실험 중 탈수를 방지하기 위해 총 부피 1 mL에 대해 마우스 뒷면의 4개의 다른 위치에서 식염수를 피하적으로 주입합니다. 눈이 건조해지지 않도록 눈윤활유를 바르십시오. 직장 온도 프로브와 난방 담요를 사용하여 체온을 37 °C에서 유지하십시오.</li>
</ol>2. 외과 적 수술
<ol><li>기관 절제술
	<ol>
<li>마우스를 뒷면에 놓습니다. 계획된 절개 하에 0.5 % 리도카인0.5 %의 리도카인을 피하주사하고 2 분 동안 기다립니다. 가슴 뼈 (manubrium) 위에 10mm 길이의 절개를하십시오. 하악선과 갑상선 근육을 분리한 다음 기관을 노출시다.</li>
		<li>가위로 두 개의 기관 고리 사이에 기관 절제술을 합니다. 길이 가 16.2mm, 직경 1mm의 작은 금속 튜브를 기관에 삽입합니다. 튜브를 기계식 인공호흡기 및 캡노그래프에 연결하여 최종 유통망CO2(그림 1A)를 모니터링합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>카테터 삽입
	<ol>
<li>계획된 절개 하에 0.5% 리도카인 (0.04 mL)을 피하로 주입하고 2 분 동안 기다립니다.</li>
		<li>미세 한 팁 집게를 사용하여 동맥을 정맥에서 부드럽게 분리합니다. 미세 혈관 클램프로 상류로 흐르는 혈류를 중지하십시오. 두 혈관을 결찰10-0 나일론 봉합사와 함께 하류로 혈류를 수축.</li>
		<li>미세 해부 가위를 사용하여 동맥과 정맥 모두에서 작은 절개를하십시오. 두 혈관에 플라스틱 카테터를 삽입합니다. 봉합사를 조여 카테터를 고정 (8-0 또는 10-0 나일론 봉합사 용기 크기에 따라 달라지며 카테터 루멘을 손상시키지 않습니다. 미세 혈관 클램프를 제거하고 피부를 닫습니다.</li>
		<li>동맥 카테터를 통해 혈압을 모니터링합니다. 각 실험 전후의 동맥 혈액 샘플(50 μL)에서 혈액 가스 의 수준을 측정합니다(정상 값: pO2,90-120 mmHg; pCO2,35-40 mmHg; pH, 7.25-7.45)를 사용하여 혈액 가스 분석기를 사용한다. 정맥 카테터를 사용하여 플루오레세인과 마취를 주입하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>개두술
	<ol>
<li>귀 사이에 마우스의 머리에서 모피를 면도합니다. 계획된 절개 하에 0.5% 리도카인0.04 mL를 주입하고 2 분 동안 기다립니다.</li>
		<li>10% 염화물 용액을 사용하여 두개골을 닦아 골막을 제거합니다. 식염수로 두개골을 철저히 헹급하십시오. 샤노아크릴레이트 접착제와 활성제 (그림1A)로 두개골에 금속 헤드 바를 붙입니다. 참고: 금속 헤드 바는 길이 75mm, 너비 13.5mm이며, 중앙에는 직경 5mm의 원형 구멍이 있습니다.</li>
		<li>4mm 직경의 개두엽을 드릴, 오른쪽 감각 배럴 피질 위에 bregma의 오른쪽에 0.5 mm 뒤에 와 3mm중심. 미세 팁 용기 확장기로 듀라를 제거합니다.</li>
		<li>노출된 피질을 0.75% 아가로즈 겔로 덮고, 인공 뇌척수액(aCSF; pH = 7.4)에 용해시키고 35°C로 냉각시켰다. 유리 마이크로 파이펫의 삽입 및 배치를 허용하는 금속 헤드 바 (그림1B)에 10-15 °의 각도로 유리 커버 슬립으로 개두량의 80-90 %를 덮습니다.</li>
		<li>뇌 맥동을 최소화하려면 유리 커버슬립의 두 모서리를 시아노아크릴레이트 접착제와 활성제로 금속 헤드 바에 붙입니다. 활성기를 조심스럽게 발라 노출된 뇌에 노출되는 것을 방지하십시오. 접착된 유리 커버슬립을 식염수로 완전히 헹시다.</li>
	</ol></li>
	<li>수염 패드 자극 프로브의 삽입을 수행합니다. 개두엽에 대한 삼차 신경의 라무스 적외선을 자극하기 위해 얼굴의 왼쪽에 맞춤 제작된 양극성 전극 세트(길이 8mm 및 두께 0.25mm)를 삽입합니다. 음극을 틈새 적외선에 가깝게 배치하고 양극을 매스틱 근육에삽입7. 2Hz에서 20s의 열차에서 1 ms에 대해 1.5 mA의 강도로 전기 자극기로 자극을 수행합니다.</li>
	<li>수술이 완료되면 0.05 mL 플루오레세인 이소티오시오네이트-덱센(FITC-dextran, 4% w/v, 분자량 [MW] 50,000)의 볼루스를 대퇴 정맥에 투여하여 혈장 라벨을 붙입니다. 케타민을 중단하고 Α-클로랄로오스의 지속적인 정맥 주입으로 마취를 전환 (17% w / v, 최종 농도) FITC-dextran과 혼합 (2% w / v, 최종 농도) 0.02 mL / 10 g / h에서. 새로운 안정화를 위해 약 반 시간 동안 기다립니다 마취 상태. 참고: FITC-dextran과 α-클로랄로오스는 모두 0.9% 식염수로 용해됩니다.</li>
</ol>3. 첫 번째 2 광자 이미징 세션
<ol><li>마우스를 상업용 2광자 현미경의 단계로 이송한다(재료표). 적색 형광 단백질 (RFP, 도 1C)및 녹색 형광 단백질 (GFP, 도 1C)상피 형광 조명 모드 에서, 5 x 목적으로 노출 된 피질의 사진을 찍습니다. RFP 그림을 다음 세션에서 유리 마이크로 파이펫삽입을 위한 '맵'으로 사용합니다. 참고 : GFP '지도'는 동맥 / 동맥에서 정맥 / 정맥을 구별하는 데 사용됩니다.</li>
	<li>2광자 현미경과 25x 1.0 수치 조리개(NA) 수분 침지 목표를 압폭 모터로 사용하여 2광자 이미징을 수행합니다. 여기 파장을 900 nm로 설정합니다. 피질을 검색하고 각 관통 동맥을 따라 그 수평 가지 (1st 순서 모세 혈관)를 찾을 수 있습니다.</li>
	<li>이미지 관통 동맥 과 그들의 1st 순서 모세 혈관 휴식 및 수염 패드 자극 동안. 섹션 5의 자세한 이미징 매개 변수를 참조하십시오.</li>
	<li>RFP '지도'(그림1C)에서 수염 패드 자극 중에 >5% 혈관 확장을 가진 1st 순서 모세혈관의 위치를 표시합니다. <5% 혈관 확장이 있는 위치는 수염 배럴 피질 영역 외부에 있는 것으로 간주됩니다. 참고: 실험에서 NG2DsRed 마우스 대신 야생 형 마우스를 사용하는 경우 GFP 이미지는 대신 '맵'으로 사용됩니다.</li>
</ol>4. 유리 마이크로 파이펫의 삽입
<ol><li>파이펫 풀러(재료표)를 사용하여 퍼핑을위한 유리 마이크로 파이펫을 준비합니다. 유리 마이크로 파이펫은 3-3.5 MΩ의 저항과 4.5-5 mm의 테이퍼 길이를 가지며, 에피형광램프와 2광자 현미경 하에서 파이펫 팁을 시각화하기 위해 1mM ATP와 10 μM Alexa 594를 혼합하여 파이펫을 적재합니다.</li>
	<li>유리 마이크로 파이펫을 패치 클램프 홀더에 장착하고 에어 펌프에 연결합니다. 펌프 유지 압력을 0 psi로 설정합니다.</li>
	<li>빨간색 에피 형광 조명을 사용하여 5x 목표의 파이펫 팁에 초점을 맞춥니다. 유리 마이크로 파이펫을 아가로즈 위의 aCSF에 넣습니다. 에어 펌프의 유지 압력을 0.2 psi로 조정합니다. aCSF에서 파이펫 팁에서 나오는 작은 빨간색 구름을 관찰할 수 있습니다. 이는 파이펫 삽입 시 막힘을 방지하기 위한 것입니다.</li>
	<li>RFP '지도'에서 표시된 위치 중 하나를 목적지로 선택합니다. 파이펫 팁을 30μm 거리의 커버 유리 가장자리의 수평 평면으로 이동하여 x-y 평면의 대상을 대략으로 가리킵니다.</li>
	<li>커버 글래스 슬립 아래 z축으로 파이펫 팁을 조심스럽게 낮춥습니다. 그런 다음 유리 피펫을 대상쪽으로 이동하여 뇌 표면 에서 ~ 500 μm까지 진행하십시오. 커버 글래스 가장자리, 파이펫 팁 및 뇌 표면 사이에 자주 초점을 전환하여 파이펫을 이동하기에 충분한 여유 공간이 있는지 확인합니다.</li>
	<li>목표를 25배로 전환합니다. 파이펫 팁의 중심을 다시 한번 하고 RFP '지도'에서 피펫 팁을 목적지쪽으로 더 멀리 이동합니다. 아가로즈 레이어에 파이펫 팁을 유지합니다.</li>
	<li>파이펫 팁이 뇌 표면 에서 ~ 100 μm인 경우 이미징 모드를 2 광자 현미경으로 전환하십시오. 퍼프할 대상 위치에 초점을 맞춥니다. x, y 좌표(x0,y 0) 및 곡면 아래 깊이(z 0)를 적어 둡니다. 뇌 표면의 삽입 점의 좌표를 다음과 같이계산합니다. xi = x0 + Z0 / 황갈색 θ yi = y0 여기서 θ는 파이펫 홀더와 수평 평면 사이의 각도입니다.</li>
	<li>피펫 팁을 뇌 표면에 좌표(xi, i)에 배치합니다. 파이펫이 도달할 때까지 부드럽게 천천히삽입합니다(x 0, y0,z 0). 용기가 삽입 경로의 방해가 되는 경우 파이펫을 철회하고 다른 삽입 좌표와 경로를 다시 계산합니다. 또는 스테이지 플레이트를 약간 돌립니다(그림 1A에 표시된 대로).</li>
	<li>펌프 유지 압력을 0 psi 및 배출 압력에서 10-15 psi로 설정합니다. 2 광자 이미징 동안 대상 위치에서 200-400 ms에 대한 퍼프 ATP. 토론 섹션에 설명된 대로 각 파이펫과 시간에 따라 퍼핑의 압력과 기간을 조정합니다.</li>
</ol>5. 하이퍼 스택 2 광자 이미징
<ol><li>2광자 현미경과 25 x 1.0 NA 수분 침지 목표를 압전 모터로 사용하여 실험을 수행합니다. 여기 파장을 900 nm로 설정합니다. 방출된 빛을 필터링하여 DsRed(pericytes)/테트라메틸라호다민 이소티오차네이트-덱스트란(TRITC-dextran)에서 혈액 플라즈마와 녹색 빛을 FITC-dextran(혈장)/GCaMP6(GFP, 성상 세포 칼슘)에서 채취합니다.</li>
	<li>관통 동맥, 1st 순서 모세관, 2차 모세관 및 아마도 인접한 형광 세포 (예를 들어, 회음구, 성상 세포)를 포함하는 관심있는 위치에서 고분해능 z 스택을 생성한다. 가능한 한 혈관의 3D 구조를 포함하여 하이퍼스택 이미징의 x*y*z 부피를 결정합니다. 각 스택의 총 높이는 30-50 μm에서 다를 수 있으며 x-y 평면은 대략 60 μm x 40 μm의 영역을 포함합니다.</li>
	<li>이미징 소프트웨어의 이미지 스택을 평면 간 거리가 4-5 μm인 8-10평면으로 구성하도록 설정합니다. 압전 모터 목표는 z축의 각 레벨에서 중지되어 각 평면의 이미지를 획득합니다. 샘플링 속도는 스택당 1초이고 x-y 평면의 픽셀 해상도는 0.2-0.3 μm(도2A)입니다. 하나의 레코딩에는 일반적으로 퍼프 전 이미지 스택 10개, 퍼프 후 이미지 스택 150개를 포함합니다.</li>
</ol>6. 데이터 처리
<ol><li>맞춤형 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리합니다. 각 이미지 스택을 최대 강도 투영으로 하나의 이미지로 병합합니다(그림2B). 관심 있는 용기를 가로질러 수직으로 3 μm의 폭을 가진 직사각형 영역(ROI)을 그립니다(그림2C).</li>
	<li>적혈구의 그림자와 피질의 사소한 진동으로 인한 간섭을 최소화하려면 한 줄로 투영하여 직사각형 ROI를 평균화한 다음 혈관 세그먼트의 평균 프로필을 나타냅니다. 각 최대 강도 이미지에 대해 이 작업을 수행합니다.</li>
	<li>표단선을 x축을 사용하여 2D 이미지로 플롯하여 시간순으로 최대 강도 이미지를 나타냅니다(그림2D,위쪽 패널). 활성 등고선 알고리즘(Chan-Vese segmentation)을 사용하여 용기8,9의 가장자리를 찾습니다(빨간색 곡선으로 표시; 그림 2 D,위쪽 패널)을 참조하십시오.</li>
	<li>혈관의 가장자리 사이의 차이로 직경 변경 시간 과정을 계산합니다(그림 2D, 하부 패널의 상부 및 하부 빨간색 곡선 사이의 수직 거리). 사전 퍼핑 지름 기준선으로 지름 변경 사항을 정규화하고 시간이 지남에 따라 지름 변화커브를 플롯합니다. 각 ROI에 대해 이 작업을 수행합니다(그림2E).</li>
	<li>용기 응답 진폭은 퍼핑 후 최고/최저 피크 진폭으로 정의됩니다. 응답 대기 시간은 하프 맥스 진폭의 대기 시간으로 정의됩니다(그림2G). 혈관을 따라 노드를 배치하고 각 ROI와 관통동맥 사이의 지리적 거리를 측정하여 골격화된 혈관 구조를 수동으로 추적합니다. 거리를 대기 시간 차이로 나누어 CVR 속도를 계산합니다.</li>
</ol>7. 바이러스 벡터 주입
<ol><li>성상 세포 칼슘 반응을 동시에 연구하기 위해, NG2DsRed 마우스의 체감각 피질에 0.6 μL 바이러스 벡터 (pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f, Addgene)의 부피를 주입, 표준 입체 바이러스 벡터 주입 절차에 따라 10.</li>
	<li>3 주 후, 마우스 체감각 피질의 성상 세포는 유전자 부화 칼슘 지표, GCaMP6f를 표현한다. 마우스를 위한 전술한 외과 적 및 2 광자 화상 진찰을 따르십시오. 성상 세포와 용기 루미나를 구별하기 위해 FITC-dextran 대신 TRITC-dextran은 용기 루미나 레드를 염색하는 데 사용됩니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 할 것이 없다.

혈관 연구의 한 가지 과제는 혈관 직경의 정확한 측정입니다. 여기에서 설명하는 방법은 2 광자 현미경 검사법에 의하여 빠르고 반복적인 hyperstack 화상 진찰을 만들기 위하여 전동된 압전 목표를 이용했습니다. 첫째, 이 방법은 초점의 손실없이 관통 동맥, 1st 순서 및 2차 모세 혈관의 반복 검사를 허용하고 생체 내에서 모세 혈관 반응을 천천히 실시의 발견으로 이어졌다. 둘째, 바...

뇌는 높은 에너지 소비율을 가지고 있습니다. 산소의 약 20%와 인체가 소비하는 포도당의 25%는 뇌 기능에 전념하고 있으며, 뇌는 전체 체질량의 2%만 차지합니다. 정상적인 뇌 기능의 유지 보수 혈관의 복잡 한 네트워크에서 혈액 흐름에 의해 산소와 영양의 충분 하 고 효율적인 공급을 필요 합니다. 국소 뇌 활동 및 대뇌 혈류(CBF)는 뉴런, 성상세포, 회수세포, 평활근 세포(SMC) 및 내피 세포(ECs)의 기능적 특성에 따라 강력하게 결합된다1. 최근에는 관통하는 동맥에서 분지하는 모세혈관의 처음 몇 가지 주문이'핫스팟'2로 등장하여 모세 혈관 의 혈류에 대한 적극적인 조절을 보여주고 있습니다. 느린 전도 혈관 반응 (CVR)은 유리 마이크로 파이펫3와ATP의 수염 자극 및 국소 배출 (퍼핑) 동안 마우스 체감각 피질에서이 '핫스팟'에서 발견되었다.
2 광자 레이저 스캐닝 형광 현미경 검사법에 의한 생체 내 이미징은 대뇌 피질의 신경 혈관 반응을 연구하는 데 널리 사용되어 왔지만, 대부분의 연구는 혈관 직경을 측정하고 그들의 규정을 조사했습니다. 2차원(2D) x-y 평면. 과제는 첫째, 대뇌 혈관과 성상 세포, pericytes 및 SMC를 포용하는 것이 3 차원 (3D)로 분기를 구성합니다. 따라서 3D로 상호 작용을 연구하는 것이 중요합니다. 둘째, 소량의 초점도 혈관 직경과 세포 형광 신호의 정확한 측정에 영향을 미칩니다. 마지막으로, C버는 3차원으로 빠르고 광범위합니다. 3D 볼륨 스캐닝은 CR을 감지하고 메커니즘을 공개하는 데 최적입니다. 우리는 생체 내에서 마우스 체감각 피질을 연구하기 위해 2 광자 현미경으로 압전 모터 목표를 구현하여 얻은 이미지의 최대 강도 투영으로 정확한 직경측정을 가능하게 했습니다.
유리 마이크로 파이펫은 생체 내 뇌 연구에 자주 사용되어 왔다, 예를 들어,대량 로드 유기 염료 4, 기록 EEGs5 및 패치 클램핑6. 그럼에도 불구하고 제한은 남아 있습니다. 일반적으로 유리 마이크로 파이펫의 팁이 부정확하게 배치되거나 마이크로 파이펫이 국소 개입에 사용되지 않습니다. 여기서는 마이크로 파이펫 삽입 및 국소 배출 절차를 최적화했습니다.
또한 3D 2광자 현미경 검사법과 유전자 부호인형 형광 지표의 조합은 3D 범위에서 신경 혈관 커플링을 조사할 수 있는 전례 없는 기회를 제공합니다. 이 연구에서, 우리는 이것을 이용하고 마우스 체감각 피질로 성상 세포 특정 유전자 부호화 한 칼슘 지표를 운반하는 바이러스 벡터를 주입했습니다. 성상 세포뿐만 아니라 혈관 직경은 다른 형광 마커를 결합하여 동시에 이미지화되었다.
전반적으로, 우리는 유리 마이크로 파이펫과 모세관 직경 변화를 정밀하게 측정 할 수있는 빠른 2 광자 하이퍼 스택 이미징에 의한 국소 배출 (퍼핑)의 최적화 된 방법을 제시합니다. 또한, 우리의 방법은 성상 세포 및 혈관 직경 응답에서 Ca2+ 응답의 3D 프로파일을 동시에 연구할 수 있는 새로운 도구를 제공합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1161px;" width="1162">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Agarose</td>
			<td style="width:263px;">Sigma&#8211;Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">A6138</td>
			<td style="width:524px;">Apply upon exposed cortex for protection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa 594</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-10438</td>
			<td>Stain puffing compound to red fluorescent color</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td>Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cyanoacrylate glue and activator</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>Adhesives and SF7452</td>
			<td>Glue for metal piece and coverglass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eye lubricant</td>
			<td style="width:263px;">Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>Keep the mouse eyes moisterized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">FD500S</td>
			<td>Blood serum dye, green fluorescent color</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">NG2DsRed mice</td>
			<td style="width:263px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:152px;">8241</td>
			<td style="width:524px;">These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f</td>
			<td style="width:263px;">Addgene</td>
			<td style="width:152px;">52924-AAV5</td>
			<td>Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRITC-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">52194</td>
			<td>Blood serum dye, red fluorescent color</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">List of Equipments</td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Air pump</td>
			<td>WPI</td>
			<td>PV830</td>
			<td>Give air pressure to pipette puffing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Blood gas analyzer</td>
			<td style="width:263px;">Radiometer</td>
			<td>ABL 700</td>
			<td>Measure levels of blood gases&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Blood pressure monitor</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>BP-1</td>
			<td>Monitor aterial blood pressure</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Body temperature controller</td>
			<td>CWE</td>
			<td>Model TC-1000</td>
			<td>Keep the mouse body temperature in physiological range</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:223px;">Capnograph</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>Type 340</td>
			<td>Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Electrical stimulator</td>
			<td style="width:263px;">A.M.P.I.</td>
			<td>ISO-flex</td>
			<td>Apply whisker pad stimulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Mechanical ventilator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>D-79232</td>
			<td>Mechanically ventilate the mouse in physiological range</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Micropipette puller</td>
			<td style="width:263px;">Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Two-photon microscope</td>
			<td>Femtonics Ltd</td>
			<td>Femto3D-RC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">List of Surgical Instruments</td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anatomical tweezer&#160;</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>09-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Angled and balanced tweezer</td>
			<td>S&#38;T AG</td>
			<td>00595 FRAS-18 RM-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iris scissor</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>05-1450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro vascular clamp</td>
			<td>S&#38;T AG</td>
			<td>462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse vascular catheters</td>
			<td>Verutech</td>
			<td>100828</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo three-dimensional two-photon microscopy to study conducted vascular responses by local atp ejection using a glass micro-pipette

정상적인 뇌 기능의 유지 보수혈관의 복잡한 네트워크에 의해 산소와 영양의 충분하고 효율적인 공급이 필요합니다. 그러나, 대뇌 혈류량의 규칙 (CBF)는 불완전하게 이해됩니다, 특히 모세관 수준에서. 2 광자 현미경 검사법은 CBF와 그것의 규정을 공부하기 위하여 널리 이용된 강력한 공구입니다. 현재, 이 분야는 (1) CBF 반응을 3차원으로 검사하는 생체내 2광자 현미경 연구의 부족, (2) 혈관 반응 및 (3) 혈관 네트워크 내의 국소적 개입에 의해 제한된다. 여기서, 우리는 유리 마이크로 파이펫으로 ATP의 국소 배출에 의해 유도된 실시된 혈관 반응을 연구하기 위해 2광자 현미경을 사용하여 생체 내 3D 방법을 설명합니다. 우리의 방법은 얻어진 심물의 최대 강도 투영에 의하여 정확한 직경 측정을 제공하는 빠르고 반복적인 하이퍼스택 2 광자 화상 진찰을 이용합니다. 또한, 우리는이 방법은 또한 3D 성상 성상 칼슘 응답을 연구하는 데 사용할 수 있음을 보여줍니다. 또한 유리 마이크로 파이펫 삽입 및 2광자 하이퍼스택 이미징의 장점과 한계에 대해서도 논의합니다.

수술이 완료되면, 마우스를 2광자 현미경으로 이송하였다(도1A). 1 mM ATP를 함유하는 유리 마이크로 파이펫을 대상 위치에서 대상 혈관의 근접에 삽입하였다(도1B).
우리는 1 mM ATP의 퍼프를 제공하면서 하이퍼 스택 이미징을 수행 (그림2A, 보충 비디오1). 각 이미...

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In Vivo Three-Dimensional Two-Photon Microscopy to Study Conducted Vascular Responses by Local ATP Ejection Using a Glass Micro-Pipette

우리는 유리 마이크로 파이펫과 빠른 2 광자 하이퍼 스택 이미징 방법을 사용하여 최적화 된 국소 배출 절차를 제시하여 모세관 직경 변화를 정밀하게 측정하고 3 차원으로 조절을 조사 할 수 있습니다.

유리 마이크로 파이펫을 사용하여 국소 ATP 배출에 의한 혈관 반응을 연구하기 위한 Vivo 3차원 2차원 광자 현미경 검사법

Maintenance of normal brain function requires a sufficient and efficient supply of oxygen and nutrition by a complex network of vessels. However, the ...

이 프로토콜은 ATP의 국소 배출에 의해 유도된 뇌모세 혈관에서 느린 수행된 혈관 반응을 연구하도록 설계되었습니다. 이 기술의 장점은 국소 피펫 배출에 의한 로컬 시냅스 활동을 시뮬레이션하고 3D 2광자 현미경 검사법에 의해 빈칸 용기를 집중하는 것입니다. 이 방법은 또한 3 차원에서 휴식과 자극에 대뇌 신경종과 신경교 활동을 공부에 사용할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 마이클 L이 될 것입니다.

in-vivo-three-dimensional-two-photon-microscopy-to-study-conducted

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.4K 조회수.  University of Copenhagen. 이 프로토콜은 ATP의 국소 배출에 의해 유도된 뇌모세 혈관에서 느린 수행된 혈관 반응을 연구하도록 설계되었습니다. 이 기술의 장점은 국소 피펫 배출에 의한 로컬 시냅스 활동을 시뮬레이션하고 3D 2광자 현미경 검사법에 의해 빈칸 용기를 집중하는 것입니다. 이 방법은 또한 3 차원에서 휴식과 자극에 대뇌 신경종과 신경교 활동을 공부에 사용할 수 있습니다. 절차를 시연?...

비디오: In Vivo Three-Dimensional Two-Photon Microscopy to Study Conducted Vascular Responses by Local ATP Ejection Using a Glass Micro-Pipette

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

두 광자 현미경을 사용하여 마우스 척수의 생체내 이미징에

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

연구

신경과학

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

초음파 혈액 - 뇌 장벽 파괴 및 망간 향상된 MRI를 사용하여 기능성 Neuroimaging

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

피부의 단일 신경 종말의 생체 두 광자 현미경에서

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

모델로 후각 시스템은 축삭 성장 패턴 및 형태를 연구하는<em&gt; 생체</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

HIV 유도 된 신경 염증의 마우스 모델에서 이광자 현미경을 사용하여 뇌 혈관 구조의 정량

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Vivo에서 신생아 쥐에 있는 대뇌 피 질의 뉴런의 두 광자 영상

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of homeostasis, undergo rapid morphological changes. For example, a laser lesion induces in a few minutes an oriented growth of microglial processes, also called &#34;directional motility&#34;, toward the site of injury. A similar effect can be obtained by delivering locally ATP or serotonin (5-hydroxytryptamine [5-HT]). In this article, we describe a protocol to induce a directional growth of microglial processes toward a local application of ATP or 5-HT in acute brain slices of young and adult mice and to image this attraction over time by multiphoton microscopy. A simple method of quantification with free and open-source image analysis software is proposed. A challenge that still characterizes acute brain slices is the limited time, decreasing with age, during which the cells remain in a physiological state. This protocol, thus, highlights some technical improvements (medium, air-liquid interface chamber, imaging chamber with a double perfusion) aimed at optimizing the viability of microglial cells over several hours, especially in slices from adult mice.

Two-photon Imaging of Microglial Processes&#039; Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglia, the resident immune cells of the brain, respond quickly with morphological changes to modifications of their environment. This protocol describes how to use two-photon microscopy to study the attraction of microglial processes toward serotonin or ATP in acute brain slices of mice.

Microglial 프로세스 매력 ATP 또는 급성 뇌 조각에 세로토닌의 2 광자 영상

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. Despite their importance, technologies for tracking neuromodulatory events with cellular resolution are just beginning to emerge. Neuromodulators, such as dopamine, norepinephrine, acetylcholine, and serotonin, trigger intracellular signaling events via their respective G protein-coupled receptors to modulate neuronal excitability, synaptic communications, and other neuronal functions, thereby regulating information processing in the neuronal network. The above mentioned neuromodulators converge onto the cAMP/protein kinase A (PKA) pathway. Therefore, in vivo PKA imaging with single-cell resolution was developed as a readout for neuromodulatory events in a manner analogous to calcium imaging for neuronal electrical activities. Herein, a method is presented to visualize PKA activity at the level of individual neurons in the cortex of head-fixed behaving mice. To do so, an improved A-kinase activity reporter (AKAR), called tAKAR&#945;, is used, which is based on F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). This genetically-encoded PKA sensor is introduced into the motor cortex via in utero electroporation (IUE) of DNA plasmids, or stereotaxic injection of adeno-associated virus (AAV). FRET changes are imaged using two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (2pFLIM), which offers advantages over ratiometric FRET measurements for quantifying FRET signal in light-scattering brain tissue. To study PKA activities during enforced locomotion, tAKAR&#945; is imaged through a chronic cranial window above the cortex of awake, head-fixed mice, which run or rest on a speed-controlled motorized treadmill. This imaging approach will be applicable to many other brain regions to study corresponding behavior-induced PKA activities and to other FLIM-based sensors for in vivo imaging.

A procedure is presented to visualize protein kinase A activities in head-fixed, behaving mice. An improved A-kinase activity reporter, tAKAR&#945;, is expressed in cortical neurons and made accessible for imaging through a cranial window. Two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy is used to visualize PKA activities in vivo during enforced locomotion.

생체 내 2 광자 형광 평생 이미징 현미경 을 사용하여 머리 고정 행동 마우스에서 단백질 키나제 활동을 시각화

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

경동공 이광자 마우스 망막의 생체 내 이미징

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...