이 작품은 존 혼 (; R15MH083221 NIMH)에 NIH R15 지역 교부금을 통해 투자되었다.

1. 유전자 변형 배아 <ol><li> 여기 transposon - 중재 향상제 트랩 방식 8 만든 zebrafish의 유전자 변형 라인을 사용하고 있습니다. KalTA4, Gal4 transcriptional 활성제의 zebrafish 최적화된 버전 및 적색 형광 단백질 mCherry : 유전자 변형 삽입은 두 코딩 시퀀스를 포함하고 있습니다. 내생 향상제 시퀀스 제어하에이 유전자 변형 카세트을 표현 형질 zebrafish의 확장기 트랩 방식 수율 라인. 따라서, 특정 향상제 시퀀스의 신원에 따라 KalTA4 및 mCherry 두 표현은 개발 두뇌의 특정 지역에 지역화된 것입니다. 잇 (Gal4TA4, UAS : zic4 mCherry)에 우리가 여기서 사용하는 hzm5 라인 표현이 여기에 특히 중요, hindbrain, forebrain, 여러 사이트에 지역화된 있으며, 후각 망울 8 (또한 그림 1 참조). . 표현의 패턴, 그리고 게놈 내에서 카세트의 지방화 언급 한대로, transgenes는 (참고 zic4 모터 8 지배하에있을 것으로 예측 아르 <a href="http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/neuroimaging/lines_distel/main">http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/ neuroimaging / lines_distel / 주</a> ).. </li><li> 성인 잇 (zic4 : Gal4TA4, UAS : mCherry) 유전자 변형 삽입에 대한 heterozygous hzm5 생선은 일반적으로 약 50 % 자손에게 유전자 변형 선도, WT (AB) 물고기와 성관계를하고 있습니다. (형질 자식의 높은 비율, 두 heterozygotes는 성관계를 할 수 있습니다.) </li><li> 색소 형성을 차단하고 형광 이미징을 촉진, 6-8 HPF 100 μm의 N - phenylthiourea (PTU) 시작과 함께 유전자 변형 배아를 치료하기 위해서는. </li></ol> 2. 장착 배아 <ol><li> 24-28 HPF에서 PTU없이 계란 물을 배아를 전송할 수 있습니다. 형광 현미경을 사용하여 mCherry 표현으로 유전자 변형 배아를 식별합니다. 좋은 집게를 사용하여 유전자 변형 배아에서 chorionic 멤브레인를 제거합니다. 4 : 전송 배아는 electroporation 버퍼 플러스 0.02 % tricaine [180 MM NaCl, 5 KCl MM 1.8 MM CaCl 2, 5 MM HEPES, pH를 7.2 Electroporation 버퍼]에 들어있는 페트리 접시에 자신의 chorion에서 해방. 마취 2 분 장착 단계로 진행하기 전에 적용을 허용합니다. </li><li> 솔루션을 microwaving 후 34-37 ° C 배양기에 솔루션을 배치하여 electroporation 버퍼 플러스 tricaine에서 낮은 용해 포인트 아가로 오스의 0.5 % 용액을 준비합니다. 아가로 오스 솔루션의 온도가 equilibrated되면, 60mm 페트리 접시의 중심에 아가로 오스 솔루션의 큰 방울 (~ 500 μl)을 놓으십시오. 아가로 오스의 드롭 6-8 anesthetized 배아를 추가합니다. </li><li> 좋은 포셉 (또는 컷 microloader의 pipet 팁의 미세 종료)를 사용하여 위치를 그들이 모두 같은 방향으로 향하게하고 수직 연속으로 정렬하는 등 배아. 아가로 오스를 응고하고, 위치에 배아를 트랩하기 위해 얼음로부터 2-3 밀리 큰 페트리 접시에 요리를 놓으십시오. </li><li> 아가로 오스가 확정되면 솔루션이 완전히 경화 아가로 오스 드롭을 커버 있도록, electroporation 버퍼 플러스 tricaine와 함께 요리를 홍수. </li></ol> 3. 플라스미드 DNA 표현의 마이크로 주입 <ol><li> MIDI 또는 맥시 - 준비 플라스미드 격리 키트 (예 : Qiagen)를 사용하여 플라스미드 GFP 표현을 준비합니다. 0.5 μg / 멸균 물 속에 μl 플러스 0.03 % 페놀 레드의 최종 농도에 플라스미드를 일시 중지합니다. 후각 망울 대상으로 실험이 여기에 설명된 위해, 우리는 여러 Gal4 구속력 사이트 (14 탠덤 UAS 시퀀스 및 기초 생선 발기인, E1b)의 통제하에 EGFP의 코딩 순서와 플라스미드 표현을 사용하고 있습니다. transgenically KalTA4 전사 인자를 표현이 플라스미드만이 세포를 사용하면 GFP를 표현하는 수있을 것이다, 그러므로, GFP의 목표 표현을 중재. 참고 : 여기에 우리가 개발하고 두뇌의 다른 지역을 타겟팅에 대해 적용되어야 DNA를 주사의 시각화를위한 페놀 레드를 사용하는만큼이 지역이 심실에서 액세스할 수 있습니다. 형광 가시화를 필요로 다른 세포 유형의 타겟팅에 대해, Bodipy 또는 Quantam 점 염료는 잠재적으로 형광등 조명 아래에 주사를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> Microinjection의 pipettes은 중 수평 및 수직 피펫 풀러를 사용하여 조작하실 수 있습니다. 열 및 풀 강도 설정 풀러, 가열 요소의 유형의 종류에 따라 다릅니다, 유리 모세관 튜브의 종류 것입니다. 서터 P - 30 수직 풀러를 사용하여, 필라멘트와 함께 얇은 벽으로 둘러싸인 borosilicate 모세관 유리 긴 테이퍼, 날카로운 pipettes을 생산하는 980의 열 설정과 960의 풀 무력을 사용 [서터 악기 # BF100 - 78 - 10]. 이러한 설정으로 뽑았 Microinjetion의 pipettes은 봉인하고 주입하기 전에 다시 고장난해야합니다. </li><li> 사출 피펫으로 DNA 플라스미드 솔루션 1-2 μl를 추가하는 microloader의 피펫 팁을 사용합니다. </li><li> 마운트 및압력 분사 시스템 피펫 홀더에 로드된 피펫을 확보. </li><li> 압력 펄스가 빨간색 DNA 솔루션의 부풀 릴리스를 생산까지 미세 집게로 로드된 피펫 다시 휴식. 또는, 팁은 빠르게 변할, 접힌 실험실 Kimwipe를 관통하여 다시 고장 수 있습니다. 참고 : 사출 pipettes가 처음에 봉인되고 수동으로 다시 깨진해야하기 때문에, 끝 크기 및 사출 량이 변수입니다. 이상적인 사출 pipettes 완전히 24 HPF의 배아 (40 PSI 100 MS 분사 펄스)의 개발 forebrain의 뇌실을 채우기 위해 3-5 분사 펄스를 필요로한다. </li><li> 이러한 것을 DNA가 인접 강제하고, 후각 망울을 형성 운명 두뇌의 지역에 intercalated있는 개발 두뇌의 심실에 플라스미드 DNA 솔루션을 주사. 후각 망울은 forebrain의 뇌실의 가장 앞쪽에 벽에 세포에서 파생됩니다. 따라서, 피펫은 개​​발 두뇌의 앞쪽에 끝 방향으로 가리 키는지 등 심실에 주입 피펫을 삽입하여, 압력 분사는 DNA에와 미래의 후각 망울에 인접한를 강요합니다. 빨간색 염료가 forebrain의 뇌실의 앞쪽에 끝에 명확하게 볼 수 있습니다까지 DNA를 주사. DNA는 DNA를 diluting 즉시 보급하기 시작하기 때문에, 그것은 주사 후 가능한 빨리 electroporation 단계 (예를 들어, 10 초 이내)으로 진행하는 것이 중요합니다. </li></ol> 4. Electroporation <ol><li> Electroporation은 그라스 플래티넘 subdermal 전극 (그라스 기술 # E2)로 만든 자기 만들어진 전극을 사용하여 수행됩니다. 전극은 휴대용 프로브에 연결된, 그리고 백금 전극 사이의 최종 거리는 1mm (건설에 대한 자세한 내용은 9 참조)해야합니다. 스퀘어 - 웨이브 electroporation 펄스는 그라스 SD - 9 자극기 (그라스 기술, 모델은 SD - 9)에 전극을 연결하여 생성됩니다. </li><li> 70 볼트에서 단일, 5 MS의 electroporation 펄스를 생성하기 위해 SD - 9 자극기를 설정합니다. 부정적인 전극은 배아 머리에 후부있는 동안 긍정적인 전극은, 배 (胚)의 앞쪽에 엔드에 인접한 위치는 그러한 전극을 위치. 수동으로 ~ 1 초 각 펄스를 분리, SD - 9 자극기의 단일 모드 스위치를 사용하여 ~ 7-8 electroporation의 펄스를 시작합니다. 적절한 전압은 태아의 나이 및 사용 전압 소스에 따라 다릅니다. 이전 배아가 electroporation 7 시작 높은 전압을 필요로하는 반면 젊은 배아는 낮은 전압 배아 손상을 방지해야합니다. </li><li> 배아는 아가로 오스로부터 우리를 자유롭게하기 전에 electroporation 후 적어도 10 분 복구할 수 있습니다. </li><li> 좋은 집게를 사용하여 자신 배아와 실제 접촉을 피하면서 부드럽게 태아의 개요를 추적하여 아가로 오스의 배아 무료입니다. </li><li> 일단 해방된 (PTU와 함께 필요한 경우) 계란 물을 배아를 반환합니다. 28에서 그들을 유지 ° C들은 GFP 발현을 위해 몇 군데 될 때까지. </li></ol> 5. 이미징 장착 배아 <ol><li> 계란 물 플러스 PTU에서 계란 물을 더한 0.02 % tricaine에 배아를 전송합니다. 마취에 대한 몇 분은 설치 단계를 계속하기 전에 적용을 허용합니다. </li><li> 솔루션을 microwaving 후 34-37 ° C 배양기에 솔루션을 배치하여 계란 물을 플러스 tricaine에서 낮은 용해 포인트 아가로 오스의 0.5 % 용액을 준비합니다. 아가로 오스 솔루션의 온도가 equilibrated되면, 35mm 페트리 접시의 중심에 아가로 오스 솔루션의 큰 방울 (~ 300 μl)을 놓으십시오. 아가로 오스의 드롭 한 anesthetized 배아를 추가합니다. </li><li> 좋은 포셉 (또는 컷 microloader의 pipet 팁의 미세 종료)를 사용하여 위치를 그들이 가능 직립 현미경 (거꾸로 스코프가 다른 배아 지오메 트리를 필요와 개발 두뇌의 지느러미보기를 시각화 수 있도록, 직립하는 등 배아 아래에서 시각화을 허용하는 다른 요리,)는 12을 참조하십시오. 얼음로부터 2-3 밀리 큰 페트리 접시에 접시를 배치하여 아가로 오스를 응고. 고급 집게로 다시 오리 엔테이션 가능성이 배아는쪽으로 넘어하지 않도록하기 위해 응고하는 동안 필요합니다. </li><li> 아가로 오스가 확정되면, 홍수 계란 물 플러스 tricaine 함께 그릇이 솔루션은 완전히 경화 아가로 오스 드롭을 커버 있도록. </li></ol> 6. 대표 결과 : GFP 발현이 electroporation 후 6시간 빠르면 관찰 될 수 있지만, 여기는 4 일 대상 세포의 neurite 구조가 충분히 개발 이러한 electroporation 후 배아의 이미지를 보여주는있다. 잇은 (zic4 : Gal4TA4, UAS : mCherry) hzm5 유전자 변형 향상제 트랩 라인 hindbrain에 mCherry의 제정 표현 (및 KalTA4)를 표시 소뇌, forebrain, 그리고 오일 이후의 수정 (에서 태아의 후각 망울 그림 1A와 1C). 타겟 electroporation (위에서 설명한 것처럼), 개발 후각 망울의 세포 (그림의 1B, 1D, 그리고 1E)에 제한 표시 GFP 발현 플라스미드에 의해 통합 UAS - GFP 발현 있었 배아. 전용 전지 transgenically - 표현 KalTA4 전사 인자하면이 UAS - GFP 플라스미드의 표현을 활성화 할 수 있습니다. 비 - 유전자 변형 배아에 플라스미드이 정관은 감지 GFP 발현을 초래할하지 않습니다. 그러므로, 그것은 UAS - GFP 및 개발 후각 망울의 세포에서 GFP의 독점적인 표현에 이르게 KalTA4 드라이버화된 유전자 변형 표현의 대상 electroporation의 결합 동작입니다. GFP - 표현 세포가 후각 망울 승모판 세포 (그림 1B와 1D) 10 전형적인 axonal 전망을 보여줍니다. 축삭의 계획을 시각화하기 위해 그림 1B와 1D의 이미지는 세포 기관의 지방이 잘 과다 노출된 것과 같은 높은 수준의 노출했다. 노출의 낮은 수준 (그림 1E)는 GFP를 표현하는 세포 기관은 실제로 후각 망울 (.; 회색 라인은 후각 망울의 경계를 표시 그림 1C와 1E을 비교)에 지역화된 것을 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2964/2964fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 5 DPF의 zebrafish 배아의 후각 망울에서 GFP 발현을 타겟. 잇 (zic4 : Gal4TA4, UAS : mCherry) hzm5 유전자 변형 향상제 트랩 라인, hindbrain, 소뇌, forebrain 및 후각 망울 (A와 C, mCherry 형광은 빨간색으로 표시)에 mCherry의 제정 표현을 표시합니다. mCherry의이 표현은 유전자 변형 Gal4 표현에 의해 중재됩니다. 28 HPF에서 UAS - GFP 발현 벡터와 함께 electroporated되었습니다 배아는에서와 같이 녹색으로 표시된 대상 GFP의 오일 후 수정에서 후각 망울 (B, D로 표현하고, E, GFP 형광. 동일한 배아를 표시하고 C). 하단에있는 낮은 노출 이미지 (E)는 GFP 표현은 후각 망울의 세포 기관으로 제한됩니다 보여줍니다. 회색 라인은 후각 망울의 경계를 나타냅니다. 명시야 (그레이 스케일), 녹색 형광 (녹색), 그리고 적색 형광 (적색) 이미​​지는 모든 올림푸스 BX60 형광 현미경으로 데리고 있었다.

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	<li>Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G., Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparking+new+frontiers:+using+in+vivo+electroporation+for+genetic+manipulations.">Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations.</a> Dev Biol. 233, 13-21 (2001).</li><li>Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP-induced+repair+of+zebrafish+spinal+circuits.">Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits.</a> Science. 305, 254-258 (2004).</li><li>Teh, C., Parinov, S., Korzh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+ways+to+admire+zebrafish:+progress+in+functional+genomics+research+methodology.">New ways to admire zebrafish: progress in functional genomics research methodology.</a> Biotechniques. 38, 897-906 (2005).</li><li>Cerda, G. A., Thomas, J. E., Allende, M. L., Karlstrom, R. O., Palma, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+DNA,+RNA,+and+morpholinos+into+zebrafish+embryos.">Electroporation of DNA, RNA, and morpholinos into zebrafish embryos.</a> Methods. 39, 207-211 (2006).</li><li>Hendricks, M., Jesuthasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation-based+methods+for+in+vivo,+whole+mount+and+primary+culture+analysis+of+zebrafish+brain+development.">Electroporation-based methods for in vivo, whole mount and primary culture analysis of zebrafish brain development.</a> Neural Development. 15, 2-6 (2007).</li><li>Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+electroporation+in+zebrafish+embryos+and+larvae.">Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae.</a> Methods Mol Biol. 546, 145-151 (2009).</li><li>Kera, S. A., Agerwala, S. M., Horne, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+temporal+resolution+of+in+vivo+electroporation+in+zebrafish:+a+method+for+time-resolved+loss-of-function.">The temporal resolution of in vivo electroporation in zebrafish: a method for time-resolved loss-of-function.</a> Zebrafish. 7, 97-108 (2010).</li><li>Distel, M., Wullimann, M. F., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Gal4+genetics+for+permanent+gene+expression+mapping+in+zebrafish.">Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 13365-13370 (2009).</li><li>Hoegler, K. J., Horne, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+zebrafish+optic+tectum+using+in+vivo+electroporation.">Targeting the zebrafish optic tectum using in vivo electroporation.</a> Cold Spring Harb. Protoc. , (2010).</li><li>Nobuhiko, M., Kozo, M., Tatsuya, T., Shin-ichi, H., Hitoshi, O., Yoshihiro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+olfactory+bulb+to+higher+brain+centers:+genetic+visualization+of+secondary+olfactory+pathways+in+zebrafish.">From the olfactory bulb to higher brain centers: genetic visualization of secondary olfactory pathways in zebrafish.</a> J. Neurosci. 29, 4756-4766 (2009).</li><li>Davison, J. M., Akitake, C. M., Goll, M. G., Rhee, J. M., Gosse, N., Baier, H., Halpern, M. E., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+from+Gal4-VP16+transgenic+insertions+for+tissue-specific+cell+labeling+and+ablation+in+zebrafish.">Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish.</a> Developmental Biology. , 304-811 (2007).</li><li>Distel, M., Kö, s. t. e. r., W, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+time-lapse+imaging+of+zebrafish+embryonic+development.">in vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development.</a> CSH Protocols. , (2007).</li><li>Emelyanov, A., Parinov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mifepristone-inducible+LexPR+system+to+drive+and+control+gene+expression+transgenic+zebrafish.">Mifepristone-inducible LexPR system to drive and control gene expression transgenic zebrafish.</a> Developmental Biology. 320, 113-121 (2008).</li><li>Knopf, F., Schnabel, K., Haase, C., Pfeifer, K., Anastassiasdis, K., Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dually+inducible+TetON+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish.">Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> PNAS. , 107-10 (1993).</li><li>Zhu, P., Narita, Y., Bundschuh, S. T., Fajardo, O., Sch&#228;rer, Y. P., Chattopadhyaya, B., Bouldoires, E. A., Stepien, A. E., Deisseroth, K., Arber, S., Sprengel, R., Rijli, F. M., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Dissection+of+Neuronal+Circuits+in+Zebrafish+using+Viral+Gene+Transfer+and+the+Tet+System.">Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System.</a> Front Neural Circuits. 3, 21-21 (2009).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기서 우리는 개발 후각 망울에서 세포의 특정 인구에 electroporated transgene 표현을 대상으로 확장기 트랩 Gal4 유전자 변형 라인을 활용하여 zebrafish의 생체내의 electroporation 방법에 설명합니다. 이러한 접근 방식은 확장기 트랩 유전자 변형 라인 8 시까지 중재 세포 유형 특정 표현과 생체내의 electroporation 7의 탁월한 시간적 해상도를 결합한 제품입니다. 여기에 비록 우리는 생체내의 electroporation에 후각 망울의 목표를 ​​설명해야 개발 신경계 2-7의 다른 지역을 대상으로 사용할 수 있으며, 확장기 트랩 라인은 다양한 특정 세포 유형이나 조직에 Gal4 타겟팅 표현 사용할 수 있습니다 8, 11. 물론,이 electroporation 기술 또한 LexA 또는 Tet 시스템을 13, 14, 15와 같은 다른 combinatioral 유전 접근법에 적합해야합니다. electroporation의 가장 큰 장점은 적당한 Gal4 라인을 사용할 수있는 점을 감안할 때 추가적인 유전자 변형 라인을 만들 필요가 없다는 것입니다. 이것은 6 개월을 절약할 수 있습니다. 생체내의 electroporation에 신경 시스템 개발의 특정 단계에 관심 7 뭐든지에서 뉴런과 엽 성의 전구 물질로 oligonucleotides의 설립을 허용합니다. 그것이 이전의 발달 단계에서 필수적인 기능을 대상으로 유전자 문제를 회피 할 수 있기 때문에 시간적 해상도 손실의 기능 분석에 특히 유리합니다. 우리가 여기서 설명하는 방법도 RNAi의 oligonucleotides 또는 구성 및 morpholino 안티 - 감각 oligonucleotides 4, 7 포함한 손실 기능 시약을 통합하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 지배 - 부정적인 단백질 발현 plasmids 또는 짧은 헤어핀 RNAi의 plasmids과 같은 플라스미드 기반의 시약은 또한 정확한 세포 유형 특정 표현을 우리는 GFP 표현 보시려면 여기를 보여준 수있게 Gal4 UAS의 통제하에 둘 수 있습니다.

시약 : <ul><li> 아가로 오스, 낮은 용융 점 (시그마, A9414) </li><li> 플라스미드 MIDI 또는 맥시 - 준비 키트 (예 : Qiagen # 12643] </li><li> 페놀 레드 (시그마, P3532) </li></ul> 장비 : <ul><li> 필라멘트와 모세관 유리, ID = 0.78 mm, OD = 1.0 mm (셔터 인 스트 루먼트, # BF100 - 78 - 10) </li><li> 그라스 SD - 9 자극기 (그라스 기술, 모델 SD - 9) </li><li> 그라스 플래티넘 subdermal 전극, 바로 바늘 (그라스 기술, # E2) </li><li> 마이크로 피펫 팁 로더 (Eppendorf, # X22703R) </li><li> 피펫 풀러 (예 : 셔터, 모델 P - 30) </li><li> 피펫 풀러 (예 : 셔터, 모델 P - 30) </li></ul>

targeting olfactory bulb neurons using combined in vivo electroporation and gal4-based enhancer trap zebrafish lines

생체내의 electroporation에 C. 분들을 포함하여, 개발 배아의 특정 지역에 유전자 표현 plasmids, RNAi 시약 및 morpholino 안티 센스의 oligonucleotides를 전달하기위한 강력한 방법입니다 엘레간스, 병아리, Xenopus, zebrafish, 및 마우스 1. zebrafish에서 생체내의 electroporation 이러한 시약 2-7의 전달을 위해 우수한 공간과 시간적 해상도를 가질 표시되었습니다. 그것이 개발의 특정 단계에서 다음과 시약의 설립을 허용하기 때문에이 방법의 시간적 해상도가 중요합니다. electroporated 벡터의 표현 6 시간 7 시간 때문에 발생합니다 또한,이 방법은 유전자 변형 접근법보다 시의 적절합니다. 단일 셀 2, 6을 대상으로했을 때 공간 해상도가 매우 정확하게 할 수 있지만, 그것은 조직이나 구조 내에서 특정 세포 인구에 시약을 통합하는 것이 바람직합니다. 여러 개의 세포를 대상으로하면, 생체내의 electroporation에있는 배 (胚)의 특정 지역에 배달을위한 효율적입니다 있지만, 특히 개발 신경계 내에서 그것은 전적으로 공간 이산 electroporation을 통해 특정 세포 유형을 대상으로 어렵습니다. 또는 확장기 트랩 형질 전환 라인 transgenes 8 우수한 세포 유형의 특정 표현을 제공합니다. 여기 우리는 특별히 zebrafish 후각 망울의 뉴런을 개발 대상으로 생체내 electroporation 7, 9 공간 분리와 유전자 변형 Gal4 기반 향상제 트랩 라인 8 결합한 방법을 설명합니다. 잇 (zic4 : Gal4TA4, UAS : mCherry) hzm5 (이전 GA80_9)는 확장기 트랩 라인 이전에 hindbrain 포함한 개발 두뇌의 여러 지역에서 zebrafish에 의해 mCherry의 중재의 대상으로 유전자 변형 표현을 표시 최적화 Gal4 (KalTA4) transcriptional 활성제를 8 설명 소뇌, forebrain 및 후각 망울. 후각 망울, 여러 Gal4 구속력 사이트 (UAS)의 통제하에 GFP의 코딩 순서와 플라스미드에 구체적으로 GFP 발현을 대상으로하는 것은 24~28시간 후 수정 (HPF)에서 forebrain의 앞쪽에 끝에 electroporated되었습니다. 이 방법은 forebrain의 여러 지역에 플라스미드 DNA을 포함하지만, GFP 발현은 transgenically KalTA4 전사 인자를 표현 세포 유도합니다. 따라서 GA080_9 유전자 변형 라인을 사용하여,이 방법은 개발 후각 망울에서 독점적으로 GFP 발현되었다. 이전 후각 망울 10 승모판 세포에 대해 설명한이 방법을 통해 대상 GFP 표현 세포는 전형적인 axonal 전망을 보여주었다. 이 방법은 공간과 temporally 이산 손실의 기능을 분석하는 방법을 제공하는 짧은 헤어핀 RNA 간섭의 표현 plasmids 등 다른 시약의 타겟 배달을 위해 사용될 수 있습니다.

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Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

유전자 조작의 시간적 및 공간적 해상도는 그들이 교란 수있는 생물 학적 현상의 스펙트럼을 결정합니다. 여기 temporally과 공간 개별 사용<em&gt; 생체내에</em개발 후각 망울의 뉴런에 특별히 GFP transgene의 표현을 유도하기 위해 zebrafish의 유전자 변형 라인과 함께&gt; electroporation,.

결합을 사용하여 타겟팅 후각 망울의 뉴런 VIVO에서 Electroporation 및 Gal4 기반 향상제 트랩 Zebrafish 라인

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

12.0K 조회수.  Pace University. 유전자 조작의 시간적 및 공간적 해상도는 그들이 교란 수있는 생물 학적 현상의 스펙트럼을 결정합니다. 여기 temporally과 공간 개별 사용 생체내에 electroporation,.

비디오: Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 expression is rarely tissue-specific enough to allow for precise correlation of the circuit with behavioral readouts. To overcome this major hurdle, we recently developed the FINGR method to achieve a more restrictive Gal4 expression in the tissue of interest. The FINGR method has three components: 1) the traditional Gal4/UAS system; 2) a set of FLP/FRT-mediated Gal80 converting tools; and 3) enhancer-trap FLP (ET-FLP). Gal4 is used to define the primary neural circuitry of interest. Paring the Gal4 with a UAS-effector, such as UAS-MJD78Q or UAS-Shits, regulates the neuronal activity, which is in turn manifested by alterations in the fly behavior. With an additional UAS-reporter such as UAS-GFP, the neural circuit involved in the specific behavior can be simultaneously mapped for morphological analysis. For Gal4 lines with broad expression, Gal4 expression can be restricted by using two complementary Gal80-converting tools: tubP&gt;Gal80&gt; ('flip out') and tubP&gt;stop&gt;Gal80 ('flip in'). Finally, investigators can turn Gal80 on or off, respectively, with the help of tissue-specific ET-FLP. In the flip-in mode, Gal80 will repress Gal4 expression wherever Gal4 and ET-FLP intersect. In the flip-out mode, Gal80 will relieve Gal4 repression in cells in which Gal4 and FLP overlap. Both approaches enable the restriction of the number of cells in the Gal4-defined circuitry, but in an inverse pattern. The FINGR method is compatible with the vast collection of Gal4 lines in the fly community and highly versatile for traditional clonal analysis and for neural circuit mapping. In this protocol, we demonstrate the mapping of FLP expression patterns in select ET-FLPx2 lines and the effectiveness of the FINGR method in photoreceptor cells. The principle of the FINGR method should also be applicable to other genetic model organisms in which Gal4/UAS, Gal80, and FLP/FRT are used.

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

We describe a Flippase-induced intersectional Gal80/Gal4 repression (FINGR) method, allowing tissue-specific FLP to determine Gal80 expression patterns. Wherever Gal4 and FLP overlap, Gal4 expression is turned on (Gal80 flipped out) or off (Gal80 flipped in). The FINGR method is versatile for clonal analysis and neural circuit mapping.

매핑 및 애벌레와 성인의 확장기 - 트랩 Flippase의 표현의 응용 Drosophila CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

연구

신경과학

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

강한 감각 뉴런의 Lentivirus - 중재 유전자 조작 및 시각화 생체내에</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. Functional optical imaging techniques are advantageous to visualize the activation of these modules in sensory cortices with high spatial resolution. In this context, endogenous optical signals that arise from molecular mechanisms linked to neuroenergetics are valuable sources of contrast to record spatial maps of sensory stimuli over wide fields in the rodent brain.
Here, we present two techniques based on changes of endogenous optical properties of the brain tissue during activation. First the intrinsic optical signals (IOS) are produced by a local alteration in red light reflectance due to: (i) absorption by changes in blood oxygenation level and blood volume (ii) photon scattering. The use of in vivo IOS to record spatial maps started in the mid 1980's with the observation of optical maps of whisker barrels in the rat and the orientation columns in the cat visual cortex1. IOS imaging of the surface of the rodent main olfactory bulb (OB) in response to odorants was later demonstrated by Larry Katz's group2. The second approach relies on flavoprotein autofluorescence signals (FAS) due to changes in the redox state of these mitochondrial metabolic intermediates. More precisely, the technique is based on the green fluorescence due to oxidized state of flavoproteins when the tissue is excited with blue light. Although such signals were probably among the first fluorescent molecules recorded for the study of brain activity by the pioneer studies of Britton Chances and colleagues3, it was not until recently that they have been used for mapping of brain activation in vivo. FAS imaging was first applied to the somatosensory cortex in rodents in response to hindpaw stimulation by Katsuei Shibuki's group4.
The olfactory system is of central importance for the survival of the vast majority of living species because it allows efficient detection and identification of chemical substances in the environment (food, predators). The OB is the first relay of olfactory information processing in the brain. It receives afferent projections from the olfactory primary sensory neurons that detect volatile odorant molecules. Each sensory neuron expresses only one type of odorant receptor and neurons carrying the same type of receptor send their nerve processes to the same well-defined microregions of &tilde;100&mu;m3 constituted of discrete neuropil, the olfactory glomerulus (Fig. 1). In the last decade, IOS imaging has fostered the functional exploration of the OB5, 6, 7 which has become one of the most studied sensory structures. The mapping of OB activity with FAS imaging has not been performed yet.
Here, we show the successive steps of an efficient protocol for IOS and FAS imaging to map odor-evoked activities in the mouse OB.

This article presents the protocols of intrinsic optical signals and flavoproteins autofluorescence signals imaging to map odor-evoked activities at the surface of the olfactory bulb in mice.

광 반사율과 Autofluorescence 신호를 사용하여 마우스 후각 망울에서 이미징 냄새 Evoked 활동

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

만성에 대한 성인 태어나 강한 뉴런의 선택 바이러스성 전달 생체내에 Optogenetic의 자극

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

초음파 혈액 - 뇌 장벽 파괴 및 망간 향상된 MRI를 사용하여 기능성 Neuroimaging

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

본래 Vomeronasal 기관 및 액세서리 후각 망울의 생체 준비

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

레이저 캡처 이외에 Microdissection과 코 생검 결합을 통해 획득 후각 뉴런 : 정신 장애의 치료 반응을 연구하기 위해 잠재적 인 접근

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

의 후각 망울에서 칼슘의 변경 사항을 모니터링을 통해 온도에 의한 신경 세포의 활동을 기록<em&gt; Xenopus의의 laevis의</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

후각 감각 축색 돌연변이 분자 식별 코드의 시각화를위한 뒷 전구의 4 배 면역 면역 측정법

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...