이 프로토콜은 그들의 장기 적인 감시를 가능하게 하는 zebrafish telencephalon에 있는 개별 ependymoglial 세포의 표시를 허용합니다, 세포 자율적인 방식으로 특정 통로의 조작. 이 기술의 주요 장점은 세포 자율 방식으로 유전자 편집 및 신호 경로 조작뿐만 아니라 빠르고 효율적인 방법으로 단일 세포 라벨링을 허용한다는 것입니다. 이 방법은 기본적인 세포 생물학 질문, 예를 들어 세포 절제, 상피 항상성의 유지 및 세포 분열의 대칭에 관하여 조사를 허용합니다.
먼저 바늘 을 당기는 장치를 사용하여 유리 모세 혈관을 준비하십시오. 마이크로 로더 팁을 사용하여 제조 된 유리 모세관을 플라스미드 용액 10 마이크로 리터로 채웁니다. 그런 다음 메뉴 변경 모세관"주사 장치에 바늘을 바늘 홀더에로드 할 수 있도록.
그런 다음 주입 장치를 변경 모세관에서 주입 모드로 전환합니다. 그런 다음, 4배 배율의 스테레오현미경을 사용하고, 포셉을 찾아모세관의 끝만 자른다. 그런 다음 발 페달에 압력을 가하여 플라스미드 용액이 방해없이 바늘에서 쉽게 실행되는지 확인합니다.
바늘이 준비되면 축산 탱크에서 제브라피시를 마취 용액용기로 옮기습니다. 아가미의 움직임이 가라앉을 때까지 몇 분 간 기다립니다. 스테레오 현미경 아래 미리 젖은 스폰지에 진정 된 물고기 등쪽을 누르고, 조심스럽게 석양 텍소의 경계 옆에, 텔렌스 팔론의 후면 측에서 물고기 두개골에 작은 구멍을 만들 수있는 40 밀리미터 절삭 가장자리와 0.5 밀리미터 두께와 스테인레스 스틸 해부 마이크로 나이프를 사용합니다.
필요에 따라 물고기를 기울이고 유리 모세관의 끝을 올바른 각도로 두개골쪽으로 방향을 지정하여 구멍을 통해 모세관 팁의 침투를 용이하게합니다. 이어서, 매우 신중하게 등대 연골 세포 층을 통해 구멍에 모세관의 끝을 삽입하고, 텔렌세팔리 심실에 도달 할 때까지, 약 10 초 동안 발 페달에 압력을 적용하여 플라스미드 용액의 약 1 마이크로 리터를 전달합니다. 전달의 성공은 심실 전체에 녹색 액체의 확산을 관찰함으로써 확인할 수 있습니다.
소량의 초음파 젤로 생선 텔뇌스팔론을 덮습니다. 플라스미드 주입 동물의 전기 포이팅을 위해 주사 설정에서 스폰지를 제거하고 전자 팁의 내부 면을 초음파 젤에 담급하십시오. 머리의 복부 측에 양극과 등쪽의 음극을 가진 물고기 머리를 전극 사이에 배치합니다.
그런 다음, 여전히 물고기의 몸을 스폰지에 들고있는 동안, 전극을 부드럽고 정확하게 텔렌스팔론에 대고 발 페달로 전류를 관리하여 5 개의 펄스가 모두 끝날 때까지 전극을 제자리에 유지합니다. 전기포이션이 성공하면 플라스미드 표지된 단일 ependymoglial 세포가 비 플라스미드 라벨eemoglial 세포 사이에서 관찰될 수 있다. 전기 포기 과정의 효율에 따라, ependymoglial 세포의 더 높거나 낮은 수는 표지될 수 있습니다.
그럼에도 불구하고, 입증된 프로토콜은 이전에 발표된 프로토콜보다 더 많은 수의 표지된 셀을 산출합니다. 라벨이 붙은 세포의 가장 높은 밀도는 주입된 플라스미드 액체가 반구 사이에 분포하는 방식으로 인해 두 반구의 내부 심실 측에서 주로 나타나는 경향이 있습니다. 이 비디오에서, 제브라피시 텔뇌스팔론의 한 반구는 무선 프로세스를 가진 ependymoglial 세포가 측에서 관찰될 때 마젠타에 있는 3D로 제시됩니다.
핵을 라벨링하는 또 다른 플라스미드와의 공동 전기화를 통해, 에펜디모글리아세포의 세포 분열을 관찰할 수 있다. 실패한 전기기화는 매우 낮은 수 또는 에펜디모글리아질 세포에 표시되지 않습니다. 그러나 등쪽 연피 세포는 표지될 가능성이 가장 높습니다.
그들의 소마는 cuboid에서 더 크고 ependymoglial 세포 층의 측면 보기에서 분명하게 무선 길쭉한 프로세스를 소유하지 않습니다. tdTomato-mem 표지된 세포는 ependymoglia의 층 위에 있는 가장 확률이 높은 ependymal 세포입니다. 대조적으로, 개별 에펜드미오글리올 세포에 플라스미드를 발현하는 tdTomato-mem의 도입은 초기 세포 라벨링 이외에 tdTomato-mem 발현을 초래한다.
기억해야 할 가장 중요한 것은 모세관의 끝만 잘라내고 주입하는 동안 연피 층을 관통하여 액체가 심실 전체에 퍼지도록 하는 것입니다. 이 기술은 생체 내 이미징을 통해 단일 ependymoglial 세포의 장기 모니터링을 가능하게하고, 따라서 뇌 재생뿐만 아니라 생체 내 유전 링크에서 자신의 역할을 확립.
