이 프로토콜은 상피 세포와 첫 번째 라인 선천적 면역 세포, 특히 우리의 관심사 인 선천적 인 T 세포의 누화를 조사하기 위해 고안되었습니다. 인간 근원의 일차 세포는이 기술에 사용되어 인간에서 일어나는 일과 관련된 생리 학적 누화에 대한 개별적인 조사를 가능하게합니다. 선천적 T 세포는 인플루엔자 감염 환자의 생존을 개선하는 데 연루되어 있다.
그들이 어떻게 활성화되는지 알면 항 인플루엔자 및 항 바이러스 요법을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 선천적 인 T 세포를 활성화시킬 수있는 요인을 식별하도록 설계되었으며, 이는 호흡기 바이러스 감염에 대한 예방 조치를 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 제로 데이에 인간 비강 상피 세포 또는 HNEC를 감염시킵니다.
먼저, 150 마이크로리터의 1x 트립신 EDTA를 멤브레인 인서트의 정점 챔버에 첨가하고 350 마이크로리터의 1x 트립신 EDTA를 대표 웰의 기저 챔버에 첨가하여 세포를 계수한다. 세포를 섭씨 37도에서 10분 동안 또는 세포가 막으로부터 분리될 때까지 배양한다. 세포를 위아래로 피펫팅하여 멤브레인 상에 플러시하고 현탁액을 1.5 밀리리터 원심분리 튜브에 수집한다.
트립신 활성을 급냉시키기 위해 200 마이크로리터의 DMEM을 첨가한다. 그런 다음, 트리판 블루 염색을 통해 세포를 계수한다. 웰당 세포 수를 기준으로 바이러스의 필요한 감염 다중도 또는 MOI를 계산합니다.
얼음 위에 완전한 RPMI로 그에 따라 바이러스 스톡을 희석하십시오. 감염 실험을 위한 나머지 웰의 경우, 멤브레인 인서트의 정점 챔버에 1x DPBS 1개를 첨가한다. 섭씨 37도에서 10분 동안 배양하고 1x DPBS를 제거하였다.
멤브레인 인서트의 기본 배지를 완전한 RPMI 배지로 변경하여 인서트를 웰에 완전한 RPMI가 추가된 새로운 플레이트로 옮기면 완전한 RPMI 배지가 된다. 준비된 바이러스 접종물을 막 삽입물의 정점 챔버에 첨가하십시오. 섭씨 35도에서 5% 이산화탄소 분위기에서 한 시간 동안 배양하고 정점 챔버에서 바이러스 접종물을 제거한다.
멤브레인 인서트의 기본 배지를 신선한 RPMI 배지로 변경하고 5% 이산화탄소 분위기에서 섭씨 35도에서 24 내지 72시간 동안 배양한다. 필요한 수의 말초 혈액 단핵 세포 또는 PBMCs를 완전한 RPMI 배지에 시드하고, PBMC 현탁액을 감염된 HNECs의 각 웰의 기저 챔버 내로 직접 첨가함으로써 제로로부터 시드한다. 섭씨 37도에서 24 ~ 48 시간 동안 배양하십시오.
정점 상청액을 수집하려면 각 정점 챔버에 1x DBPS를 추가하고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 DPBS를 1.5 밀리리터 튜브에 수집하십시오. 플라크 분석을 위해 상청액을 새로운 1.5 밀리리터 튜브에 분취시키고 영하 80도에서 주식과 분취량을 즉시 동결시킵니다.
RNA 형태의 HNEC를 수집하려면 멤브레인 삽입물을 깨끗한 웰로 옮깁니다. RNA 용해 완충액을 정점 챔버에 첨가하고 실온에서 다섯 분 동안 인큐베이션한다. 상층액을 1.5밀리리터 원심분리 튜브에 모아 분자 분석을 위해 RNA가 추출될 때까지 섭씨 영하 80도에 보관합니다.
마지막으로, 멸균 피펫 팁의 넓은 베이스로 웰의 표면을 부드럽게 긁어내어 웰 표면에 부착될 수 있는 활성화된 PBMCs를 제거함으로써 PBMCs를 수확한다. PBMCs를 함유하는 기초 배지를 두 밀리리터 원심분리 튜브에 수집한다. 300 마이크로리터의 1x DPBS로 웰을 두 번 플러시하고 동일한 2 밀리리터 튜브에서 세척을 수집하십시오.
두 밀리리터 튜브를 원심분리하고, 세포 펠릿을 방해하지 않고 신선한 두 밀리리터 튜브에서 상청액을 수집한다. 흡기 된 상청액을 사이토 카인 및 케모카인 분석을 위해 영하 80도에 보관하십시오. 나머지 세포 펠릿을 200 마이크로리터의 1x DPBS에 재현탁시킨다.
이 프로토콜은 동일한 기증자로부터의 상피 및 면역 세포를 필요로 하지 않고 인플루엔자 감염 후 선천적 T 세포를 연구하는데 사용될 수 있다. HNESPCs가 3T3 피더 층 상에서 성장할 때 예상되는 진행의 샘플이 여기에 도시되어 있다. 이들은 기능성, 섬모 및 잔 세포를 가진 다층 HNEC를 얻기 위해 공기 / 액체 계면 배양에서 분화에 사용되었습니다.
HNECs를 사용하여, 선천적 T 세포 활성화는 유세포 분석기를 사용하여 조사될 수 있다. 이들 결과는 점막-관련 불변 T, 또는 MAIT 세포, V 델타원, 감마 델타 T 세포, 및 자연 살해 T, 또는 NKT 세포의 검출을 보여준다. 이들 세포는 인플루엔자 바이러스에 감염된 HNECs를 수반하는 공동 배양에서 유의하게 증가하였다.
이 설정은 이어서 다른 인플루엔자 바이러스 균주 또는 선천적 면역 세포 집단에 적용되어 감염된 상피 세포와의 공동 배양 조건 하에서 이들의 각각의 활성화를 관찰할 수 있다. 감염의 올바른 다중성이 사용되도록 하기 위해 인간 비강 상피 세포의 수를 정확하게 계산하는 것은 최적의 수준과 활성화 타이밍에 중요하다. 상피 세포와 선천적 면역 세포 사이의 누화는 점점 더 주목을 받고 있으며, 이는 급성 또는 만성 호흡기 면역학을 포함하는 다른 방법에 추가로 적용될 수 있습니다.
