, F30 DC011673 (GFH : NINDS, NIH)과 유타 남서부 시작 기금 (JPM) :이 연구는 R00 DC011780 (NINDS, NIH JPM)에 의해 지원되었다.

모든 실험은 UT 요리 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행하였으며, 실험 동물에 의해 경험 한 스트레스, 불편과 고통을 최소화하도록 선택되었다. 1. 해부 상공 회의소 사용자 지정 해부 실 및 작은, 얇은 플라스틱 판자는 최상의 결과를 (그림 1)이 필요합니다. 이 프로토콜을 시도하기에 앞서 이러한 챔버를 구축 또는 구하십시오. 2. 해부 솔루션 <ol><li> 단계 3.22-5.4에 사용하기 위해 표준 인공 뇌척수 (ACSF)의 1 L를 준비합니다. 염화나트륨 125 밀리미터,의 KCl 2.5 밀리미터, 염화칼슘 2 ㎜, MgCl2를 1 ㎜, 탄산 수소 나트륨 25 밀리미터,의 NaH 2 PO 4 1.25 밀리미터, 미오 이노시톨 3 mm의 나트륨 피루 베이트 2 ㎜, 아스 코르 빈산 나트륨 0.4 ㎜를 추가하고 25 포도당 mM의 발열 물질이없는 물 1 L에. </li><li> 에 대한 초기 해부 ACSF (200 ㎖) 준비단계 3.3-3.22에 사용합니다. 표준 ACSF 200 ㎖를 타고 MgCl2를 수화물 0.366 g을 추가하여 9 개 mm로 MgCl2를 농도를 높입니다. </li><li> 염화나트륨 115 밀리미터, KCl을 5 밀리미터, 염화칼슘, 2 ㎜, MgCl2를 2 ㎜, 탄산 수소 나트륨 25 밀리미터, HEPES 10 mM의를 포함하는 단계 4.11-5.4에 사용되는 정맥을 통해 VNO에 자극을 수행하는 표준 링어의 솔루션을 준비, 10 mM의 포도당. </li><li> 버블 사용할 때까지 15 분의 최소 37 ° C의 물을 욕조에 95 % O 2, 5 % CO 2 가스 표준 ACSF 및 링거의 0.5 L의 0.8 L. </li><li> 거품 95 % O 2 초기 해부 ACSF의 200 ㎖, 그것은 4 ° C를 15 ~ 20 분 동안 얼음에 5 % CO 2 가스에 도달 할 때까지 </li></ol> 3. 기본 해부 <ol><li> 해부 영역을 준비합니다. 세 35mm 페트리 접시를 놓고 산소 ACSF, 바로 가위, Adson 집게, # 11 두피를 해부 가위를 해부 곡선 잘린 가위,,엘 칼날과 손잡이와 얼음에 면도날. </li><li> 산소 ACSF 4 ° C로 냉각 한 후, 깊이 2 ~ 5 ㎖의 Isothesia (99.9 % 이소 플루오 란)를 사용하여 건조 챔버에서 동물을 마취. 동물이 깊은 마취를 보장하기 위해 꼬리와 발 핀치 테스트를 수행합니다. </li><li> 깊은 마취가 확인되면, 동물의 목을 벨 즉시 냉장 해부 ACSF 가득 페트리 접시에 머리를 놓습니다. 참고 : 사용하지 않을 때의 절차를 통해 시원한 곳에 보관하는 냉장 해부 ACSF의 조직을 담근다. </li><li> 곡선 가위로 낮은 측면 (복부 인두, 아래 턱, 혀)를 제거합니다. </li><li> Adson의 포셉 deglove (껍질) 표피와 두개골의 근육 첨부 파일을 사용하여. 껍질 주동이에 꼬리에서 두피 첨부 파일의 전용 사이트까지 앞니 이상이다. 곡선 가위를 사용하여 접속 지점에서 조직을 잘라. 집게로 잡고 눈을 제거하고 준비에서 떠나십시오. N귀 degloving 절차의 끝, 위턱 뼈없는 근육 첨부 파일 Adson의 집게를 사용하여 섬세한 코의 연골에 여분의 힘을 피하십시오. 참고 : 바로 가위로 두개골의 꼬리 부분에서 두피를 분리합니다. </li><li> 가위 팁 (직전 rhinal 동을) 정면 뼈에 몇 mm가 될 때까지 똑바로 가위, 주동이에 꼬리에서 두개골의 중간 선을 삭감. </li><li> Adson의 집게를 사용하여 두개골의 정수리와 정면 뼈를 제거합니다. 참고 : 정면 뼈의 조각은 종종 rhinal 동에 꼬리 코 뼈에 부착 된 상태로 유지됩니다. 후각 전구와 접촉하지 않도록주의하여이 조각을 제거합니다. </li><li> 부비동에 전두엽 2mm의 꼬리를 통해 관상 컷을 한 다음 컷으로 뇌의 꼬리를 제거하기 위해 메스를 사용합니다. 완전히 후방 조직을 절단하는 메스 연락처 복부 두개골의 뼈 윤곽의 끝을 확인합니다. 참고 :이 수측면 후각 책자 또는 후각 전구에 기계적 스트레스를주지 않고 뇌의 대부분을 제거. </li><li> 바로 가위로 복부 두개골의 노출 꼬리 부분을 제거합니다. 부비동과 남아있는 신경 조직을 남겨주세요. </li><li> 바로 가위를 사용하여 두개골의 해부학 오른쪽 광대뼈 아치와 얼굴 근육을 제거 </li><li> 입의 지붕을 노출 (복부 측면을 위로) 주둥이를 뒤집으십시오. </li><li> 잘라 앞니에 미각이 바로 꼬리 제거합니다. 입천장에 구개 병렬에서 메스 블레이드의 팁을 삽입하여이 작업을 수행 한 후 앞니를 향해 칼날을 이동합니다. </li><li> Adson 집게와 미각의 해제 (주동이의) 가장자리를 잡고 꼬리 쪽 잡아 당겨 제거합니다. </li><li> 두개골의 해부학 왼쪽에, 어금니 근처의 작은 난원에서 시작, 꼬리 쪽 팔 라틴 난원을 확장 메스 블레이드를 사용합니다. 메스 즐의 끝을 삽입하여이를 달성어금니 근처 무효로 해제하고 손목을 회전. 참고 : 블레이드의 팁만을 사용에 각별한주의를 기울이십시오 - 깊은 상처가 중격 조직을 손상시킬 수 있습니다. </li><li> 해부학 왼쪽 vomeronasal 기관에 주동이를 시작, 앞니를 통해 구개 난원에서 잘라 메스 블레이드의 팁을 사용. 여러 점수 인하를 사용합니다. 너무 깊이 블레이드를 삽입하여 중격 조직과 vomeronasal 신경을 손상하지 마십시오. </li><li> 그래서 지느러미 두개골가 직면하고있는 조직을 켠 다음 준비의 꼬리 가장자리에 수직으로 직선 면도날 (중간 선에 평행) 방향. </li><li> 조직의 복부 에지에서 즉시 정중선의 왼쪽 면도날의 절삭 날을 터치. 날을 부드럽게 바위와 왼쪽 팔 라틴 난원 (단계 3.14에 도입 된 지역을 절감)를 따라 이동합니다. </li><li> 조직의 지느러미 가장자리에서 즉시 정중선의 왼쪽 (1 mm 미만)에 면도기의 최첨단을 배치합니다. </li><li> 유지블레이드가 조직의 전방을 향해 압력을 서서히 면도날 바위, 중앙선에 평행. 소공 질의 플레이트에 저항을 알 수 있습니다. 이 저항을 돌파 한 후 즉시 중지합니다. NOTE :이 시점에서, 우반구가 좌반구에서 느슨하게된다. 유일하게 남아있는 연결은 소공 질의 플레이트 등의 주둥이 앞쪽에 따라 반구 사이에있다. </li><li> 장갑을 낀 손가락으로 꼬리 양쪽 근처를 잡고 부드럽게 옆으로와 전방을 회전하여 반구를 분리합니다. 참고 :이 단계는 특히 편향 또는 부서지기 쉬운 주둥이 (예를 들어, 이전 마우스)와 생쥐 실험 다양성의 원천입니다. 또한, 강한 저항이 결합 조직을 약화 등의 주둥이 (소공 질의 플레이트 앞쪽) 점수가 발생하는 경우, 서로 떨어져 반구를 회전하는 동안. 이렇게하는 동안, 중격 TI를 손상시킬 수있는, 깊이 메스를 삽입하지 세심한주의를 가지고ssue 및 vomeronasal 신경. </li><li> 판자에 조직 접착제의 소량 (50 ~ 100 μL)을 적용하고 부드럽게 Adson의 집게를 사용하여 접착제에 오른쪽 반구의 측면 가장자리를 놓습니다. 판자에 조기 접착제의 중합 및 느슨한 부착을 방지하기 위해 종이 타월을 사용하여 준비의 측면에서 과잉 수분을 제거합니다. 참고 : 조직이 접착제에 배치 된 후 접착제의 중합 반응을 가속화하기 위해 샘플에 냉장 해부 ACSF 몇 방울을 적용합니다. 이 조직은 판자에 단단히 개최 유지되도록합니다. </li><li> 보조 해부 실의 중간에 진공 그리스의 작은 금액 (3-5 mm 직경, 깊이 2mm)를 놓고 단단히 그리스에 대한 조직 맞은 판자의면을 배치합니다. 즉시 미세 해부 영역에 전송하고 산소 표준 ACSF와 관류를 시작, 냉장 해부 ACSF으로 해부 챔버를 입력합니다. 후각 망울이 직접 있도록 판자의 방향을갓 산소 표준 ACSF의 스트림. </li></ol> 4. 보조 해부 <ol><li> 미세 집게를 사용하여 준비에서 눈에 보이는 반대편 (왼쪽) 후각 망울 또는 대뇌 피질의 조직을 제거합니다. (세미 무딘 점을 형성하는) 미세 집게를 함께 꼬집어하고 중간 선 부근의 지느러미와 조직의 꼬리 부분에 배치합니다. 부드럽게 멀리 전방 움직임에 천천히 오른쪽 뇌의 조직을 박리, 중간 선을 따라 슬쩍 집게를 실행합니다. 반대측의 후각 망울의 조직을 포함하여 반대측의 조직을 모두 제거합니다. AOB 또는 vomeronasal 신경에 손상을 줄 수있는 조직을 찌르지 않도록 세심한주의를 기울입니다. </li><li> 후각 망울의 등 / 내측 표면을 따라 흰색 뇌경막을 준수하십시오. 미세 집게 두 쌍의 경질의 백인 부분에 잡고 후각 망울의 등 / 꼬리 가장자리를 따라이 경막 눈물 멀리 그 시점에서 그들을 잡아 당깁니다. 경질 단단히입니다후각 전구를 감싸, 그것을 제거하는 동안 쉽게 자체 조직을 통해 슬라이스 할 수 있습니다. 후각 망울과 AOB 자체의 내측 표면의 손상을 방지. 참고 : 경질이 시점에서 쉽게 찢어 저항하는 경우, 분리를 용이하게하기 좋은 봄 팁 해부 가위로 작은 상처를 소개합니다. </li><li> 차분히 기본 후각 전구를 손상시키지 않고 미세 집게와 정면 외피를 벗겨. AOB에 바로 꼬리 반투명 순으로 나타나는 혈관의 컬렉션을 준수하십시오. 전기 생리학 실험에서 전극의 침투를 용이하게하기 위해 미세 집게로이 그물을 제거합니다. 그것은 정면 피질 후퇴하는 동안 AOB에서 분리로 집게로 그물을 잡고 AOB을 만지지 않도록 조심하면서, 꼬리 쪽과 내측으로 잡아 당겨 제거합니다. 전두엽 피질의 후각 전구에서 분리되면, AOB에 복부와 뒤 집게로 절단하여 제거합니다. 참고 : 예를 가지고그것이 너무 크게 할 경우 그물 제거와 함께 치료를 트림에 대한 사구체 층이 손상 될 수 있습니다. </li><li> 노출 반대편 비강에서, 미세 집게를 사용하여 남아있는 반대측 중격 조직 (혈관을 포함하는 얇은 황색 시트)를 제거합니다. (중격 뼈 근처) 꼬리 / 등의 지역에서 조직을 파악하고 전방 측을 향해 조직을 리프트 / 당깁니다. 참고 : 반대측 중격 조직이 실수로 hemisection 단계 (단계 3.20) 동안 제거 할 수 있습니다. 이러한 경우에, 흰색, 무 혈관 중격 연골과 약간 투명, 혈관 중격 뼈를 관찰합니다. 이 경우, 스텝 8.8은 생략 될 수있다. </li><li> 조심스럽게 중격 연골과 VNO &quot;날개&quot;(두 VNOs의 지느러미 가장자리를 따라 실행 뼈 조직의 얇은 조각 사이의 미세 집게의 단일 지점을 실행하여 반대측 VNO를 제거합니다. <ol><li> 연골의 날개 분리 후, 배쪽으로 집게의 끝으로 이동중간 선 부근 반대측 VNO에. 집게로 잡고 멀리 들어 올려 제거 할 수 있도록, 그것을 풀어야 반대측 VNO의 주동이 / 꼬리 축을 따라 여러 위치에서이 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 미세 집게와 꼬리 / 복부 가장자리에 상처를 (그것이 중격 뼈의 복부 가장자리를 따라 흰색 무혈성 지구 실행에 좁은 곳)함으로써 중격 연골을 제거하기 위해 준비합니다. </li><li> 반 무딘 점을 만들기 위해 함께 미세 집게를 집어 중격 연골을 제거합니다. 단계 4.6에서 만든 컷을 확인, 해당 컷에 (측면) 뒤에 슬쩍 집게를 삽입 한 다음 천천히 중격 조직에서와 rostrally 진행 연골을 들어 올립니다. 참고 : 기본 중격 조직을 방해하지 마십시오. 연골 들어 올릴으로 인해 연골에 느슨하게 유착에 중격 조직 스트레칭의 기본 시트를 관찰합니다. 느슨한의 사이트를 따라 슬쩍 미세 집게의 정기 온화하고 안정된 움직임dhesion 크게 두 구조의 성공적인 분리를 용이하게 할 수있다. </li><li> 중격 뼈를 제거하기 위해 구부러진 팁 # 3 포셉 한 쌍을 사용합니다. 각도 중격 뼈 접근 거의 중격 뼈의 평면에 평행. 중격 조직과 중격 뼈 사이의 곡선 가지를 삽입합니다. 집게와 뼈를 잡고 부드럽게 소공 질의 플레이트 근처에 균열 때까지 앞뒤로 뼈를 이동합니다. NOTE : 일부 경우에, 중격 뼈 소공 질의 플레이트 근처 속보 레지스트 것이다. 이 경우, 부드럽게 단지 4.8 단계를 반복 한 다음, 소공 질의 판에 전방 지느러미 / 복부 축을 따라 중격 골을 득점하는 미세 집게를 사용합니다. </li><li> 입구에 미세 집게 일쌍으로 곤란 및 미세 집게의 또 다른 쌍의 rostrally 당겨 단지 VNO에 주동이의 흰색 연골을 제거합니다. </li><li> 빠른 관류 장치에 폴리이 미드 정맥을 연결하고 폴리이 미드 캐 뉼러를 통해 링거액 (0.1 ~ 0.3 ㎖ / 분)의 흐름을 시작합니다.NOTE : 라인, 작은 양의 유량계 측정 유량. 컴퓨터 제어 공기 부양 스위칭 장치의 사용은 자극시 유량의 변화를 줄일 수 있습니다. 응답을 자극 특정 보장하기 위해 모의 자극 (링거액을 제어)에 대한 응답으로 자극을 테스트하는 신경 반응을 비교. </li><li> VNO 입구 정맥 평행의 방향. 캐 뉼러가 만족 VNO 입구 평행하면 출구 압력이 VNO이 원인으로, 혈관의 피난 선도 &quot;팽창&quot;본다. 바로이 VNO 개방 평행하게되도록 정맥 상수의 각도를 유지하는 VNO에 캐 뉼러를 삽입합니다. 참고 : 플라스틱 판자에 대한 미세 집게 일쌍과 정맥을 잡고 약간 위쪽 각도로 정맥의 끝을 미세 집게의 또 다른 쌍을 사용하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 하나의 실수 VNO 뒤에 뉼러를 배치하는 경우, 유출은 VNO 혈관에게 발생할 수대피, 적절한 삽관을 수행 한 인상을 선도. 적절한 위치는 링거 용액에 염료를 혼입에 의해 확인 될 수있다. 정맥이 제대로 배치되면, 염료 만해야 VNO 입구를 통해 종료합니다. 또한, 하나는 정맥이 VNO의 반투명 중간 부분을 통해 쉽게 볼 수 있음을 확인하여 적절한 위치를 확인할 수 있습니다. </li><li> AOB가 VNO에서 정맥을 제거하지 않도록주의하고, 표준 ACSF의 직접 교류가 될 때까지 천천히 플라스틱 판자를 이동합니다. 해부가 완료되고 생리 기능의 평가는 즉시 시작할 수 있습니다. 5 단계는 간단히 이러한 평가를 만들기위한 한 가지 방법에 대해 설명합니다. </li></ol> 5. 평가 <ol><li> 세포 증폭기 및 오실로스코프에 연결된 2-4 MΩ 붕규산 유리 미세 전극으로 AOB의 표면을 침투. </li><li> 천천히에서 100 ~ 200 ㎛의 깊이에 미세 전극을 사전50 ㎛ / 분의 속도로 표면. 참고 :이 조직의 깊이에, 하나는 미세 전압의 날카로운, 짧은 (~ 1 ~ 2 밀리 초) 편향에 의해 예시 가끔 자발적 활동 전위 파형을 발생합니다. </li><li> 활동 전위 파형을 발생하면, 미세 전극을 발전 정지. </li><li> 관찰 및 / 또는 VSN 활성의 공지 된 활성화 제 (예를 들어, 50 mM의 KCl을 함유 링거액)로 제어 링거에서 자극 전달 솔루션을 바꾸면서 활동 전위 속도를 기록한다. 해부에 성공하면, 활동 전위 속도 또는 지역 현장 잠재력 자극에 의​​존하는 변화는 관찰 할 수있다. 참고 : 모든 AOB 뉴런 (50 밀리미터의 KCl을 포함하는 링거액 등의) 발사 속도의 증가에 따라 모든 자극에 응답합니다. 발사 속도의 자극에 의​​존 감소는 또한 기능적인 연결 및 성공적인 절개를 나타냅니다. 두 개 이상의 뉴런가 발생하는 경우에 그VNO의 자극에 응답하지 않는, 또는 어떤 활동 전위가 여러 전극 침투 후 관찰되지 않은 경우,이 실패 절개를 제안합니다. 이 경우, 새로운 절개는 3 단계에서 시작될 수있다. </li></ol>

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	<li>Bruce, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+exteroceptive+block+to+pregnancy+in+the+mouse.">An exteroceptive block to pregnancy in the mouse.</a> Nature. 184, 105 (1959).</li><li>Bellringer, J. F., Pratt, H. P., Keverne, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+vomeronasal+organ+and+prolactin+in+pheromonal+induction+of+delayed+implantation+in+mice.">Involvement of the vomeronasal organ and prolactin in pheromonal induction of delayed implantation in mice.</a> J Reprod Fertil. 59, 223-228 (1980).</li><li>Bean, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+agonistic+behavior+by+the+dual+olfactory+system+in+male+mice.">Modulation of agonistic behavior by the dual olfactory system in male mice.</a> Physiol Behav. 29, 433-437 (1982).</li><li>Meredith, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vomeronasal+organ+removal+before+sexual+experience+impairs+male+hamster+mating+behavior.">Vomeronasal organ removal before sexual experience impairs male hamster mating behavior.</a> Physiol Behav. 36, 737-743 (1986).</li><li>Hendrickson, R. C., Krauthamer, S., Essenberg, J. M., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+shapes+sex+selectivity+in+the+mouse+accessory+olfactory+bulb.">Inhibition shapes sex selectivity in the mouse accessory olfactory bulb.</a> J Neurosci. 28, 12523-12534 (2008).</li><li>Ben-Shaul, Y., Katz, L. C., Mooney, R., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+vomeronasal+stimulation+reveals+sensory+encoding+of+conspecific+and+allospecific+cues+by+the+mouse+accessory+olfactory+bulb.">In vivo vomeronasal stimulation reveals sensory encoding of conspecific and allospecific cues by the mouse accessory olfactory bulb.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (2010).</li><li>Tolokh, I. I., Fu, X., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+sex+and+strain+discrimination+in+the+mouse+vomeronasal+organ+and+accessory+olfactory+bulb.">Reliable sex and strain discrimination in the mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 13903-13913 (2013).</li><li>Luo, M., Fee, M. S., Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+pheromonal+signals+in+the+accessory+olfactory+bulb+of+behaving+mice.">Encoding pheromonal signals in the accessory olfactory bulb of behaving mice.</a> Science. 299, 1196-1201 (2003).</li><li>Binns, K. E., Brennan, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+electrophysiological+activity+in+the+accessory+olfactory+bulb+and+medial+amygdala+associated+with+mate+recognition+in+mice.">Changes in electrophysiological activity in the accessory olfactory bulb and medial amygdala associated with mate recognition in mice.</a> Eur J Neurosci. 21, 2529-2537 (2005).</li><li>Leszkowicz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noradrenaline-induced+enhancement+of+oscillatory+local+field+potentials+in+the+mouse+accessory+olfactory+bulb+does+not+depend+on+disinhibition+of+mitral+cells.">Noradrenaline-induced enhancement of oscillatory local field potentials in the mouse accessory olfactory bulb does not depend on disinhibition of mitral cells.</a> Eur J Neurosci. 35, 1433-1445 (2012).</li><li>Ames, A., Gurian, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+Recordings+from+Isolated+Mammalian+Retina+Mounted+as+a+Membrane.">Electrical Recordings from Isolated Mammalian Retina Mounted as a Membrane.</a> Arch Ophthalmol. 70, 837-841 (1963).</li><li>Flock, A. F., Strelioff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+hair+cells+in+isolated+coils+from+the+guinea+pig+cochlea.">Studies on hair cells in isolated coils from the guinea pig cochlea.</a> Hear Res. 15, 11-18 (1984).</li><li>Woodbury, C. J., Ritter, A. M., Koerber, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+anatomy+of+individual+rapidly+adapting+low-threshold+mechanoreceptors+innervating+the+'hairy'+skin+of+newborn+mice:+early+maturation+of+hair+follicle+afferents.">Central anatomy of individual rapidly adapting low-threshold mechanoreceptors innervating the 'hairy' skin of newborn mice: early maturation of hair follicle afferents.</a> J Comp Neurol. 436, 304-323 (2001).</li><li>Llinas, R., Muhlethaler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electrophysiological+study+of+the+in+vitro,+perfused+brain+stem-cerebellum+of+adult+guinea-pig.">An electrophysiological study of the in vitro, perfused brain stem-cerebellum of adult guinea-pig.</a> The Journal of physiology. 404, 215-240 (1988).</li><li>Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formyl+peptide+receptor-like+proteins+are+a+novel+family+of+vomeronasal+chemosensors.">Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors.</a> Nature. 459, 574-577 (2009).</li><li>Meeks, J. P., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex+vivo+preparation+of+the+intact+mouse+vomeronasal+organ+and+accessory+olfactory+bulb.">An ex vivo preparation of the intact mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb.</a> J Neurosci Methods. 177, 440-447 (2009).</li><li>Leinders-Zufall, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+pheromone+detection+by+mammalian+vomeronasal+neurons.">Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons.</a> Nature. 405, 792-796 (2000).</li><li>Kato, H. K., Chu, M. W., Isaacson, J. S., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+sensory+representations+in+the+olfactory+bulb:+modulation+by+wakefulness+and+experience.">Dynamic sensory representations in the olfactory bulb: modulation by wakefulness and experience.</a> 76, 962-975 (2012).</li><li>Meeks, J. P., Arnson, H. A., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Representation+and+transformation+of+sensory+information+in+the+mouse+accessory+olfactory+system.">Representation and transformation of sensory information in the mouse accessory olfactory system.</a> Nature. 13, 723-730 (2010).</li></ol>

저자는 공개 할 관심의 큰 충돌이 없습니다.

이 프로토콜에서 설명하는 VNO-AOB 생체 준비는 생체 내 5-7 급성 라이브 슬라이스 AOB 기능의 17 실험에서 마취 할 수있는 유용한 대안이다. 또한 전기 생리학 및 광학 레코딩을위한 회로 소자를 노출 급성 AOB 슬라이스 실험과는 달리,이 혼합물은 모든 감각 구 심성과 내 AOB의 연결을 유지합니다. 이 또한 생체 방법에 마취라고 할 수 있지만, 마취제의 존재?...

포유류의 뇌에있는 감각 처리는 일반적으로 감각 입력에서 특정 기능을 추출하고, 각각의 다중 상호 연결의 연결 회로에 걸쳐있다. 감각 경로에서 초기 정보 처리는 정상적인 인식과 행동에 매우 중요합니다. 액세서리 후각 시스템 (AOS)에서 액세서리 후각 망울 (AOB)은 호르몬 균형, 2, 침략 3, 4 각성을 지시 다운 스트림 구조로 감각 주변을 연결하는 주요 신경 회로이다. 이와 같이,이 회로 내의 정보 처리 강하게 동물 행동의 변화에​​ 연계된다. 액세서리 후각 망울이 조밀 한 아래의 주요 후각 망울 (MOB)의 등 / 꼬리 / 후방 측면에서 생쥐와 쥐에 있으며 rhinal 부비동 혈관이. AOB는 vomeronasal 기관 (VNO)에있는 주변 vomeronasal 감각 뉴런 (하여 VSN)의 축삭에서 구 심성 신경 지배를받는, 스말그냥 부드러운 구개 위의 앞쪽 주둥이에있는 L 블라인드 종단 관. 이 축삭은 비강의 내측 경계에서 중격 조직의 섬세한 시트를 통과. 몇몇 연구는 마취 된 쥐 5-7 자유로이 탐험 동물 8을 사용하여 생체 내에서 (예 : 마우스 소변 등) AOS 냄새의 근원에 AOB 신경 반응을 탐색 할있다. 영웅은 () tracheotomies 비 휘발성 냄새를 소개하는 깊은 마취를 보장하고 액체 자극 5-7의 구토물이기도를 막는 것을 방지, 교감 자궁 경부 신경절 6 vomeronasal 기관 5,7 직접 삽관의 (b)의 자극에 참여 생체 내 연구에서 마취 및 (c) 전두엽 절제 유무에 관계없이 craniotomies는 AOB (6)에 전극의 발전을 허용합니다. 깨어 / 연구에게 마이크로 드라이브 8-10 참여 외과 주입을 행동. 결론적으로,이 실험 패러다임은 강력하지만 매우 어려운 종종 마취를 필요로합니다. 11-15로 신체 (생체) 외부 살아 감각 구조 및 다운 스트림 신경 회로를 유지하려고했습니다. VNO와 AOB 간의 연결은 동측 남아 있고, 정중선 중격 티슈는 단일 반구 산소화 superfusate에 노출 될 수 있기 때문에, 우리는 자신의 기능적 연결성을 유지하면서, 이러한 구조를 분리하는 이러한 단일 반구 생체 외 접근법을 개발하기 위해 노력하기 때문에. 우리는 최근에 이러한 목표 16 달성에 성공했다. (중간 선 소프트 중격 조직을 따라) 축삭과 AOB 모두 산소 인공 뇌척수를 (superfused에 액세스 할 수있는 600 μm의 기능 &lt;비교적 얕은 때문에 6 시간 -이 준비 VNO과 AOB 살아 기능적 최소 4에 대한 연결을 모두 유지 ACSF). 이 VNO-AOB 생체 준비 얇은 캐 뉼러를 통해 VNO에 제어 자극의 도입을 허용하고,대상 전극 배치 및 / 또는 라이브 형광 현미경의 작은 AOB에 직접 시각적으로 액세스 할 수 있습니다. 하나는 마취제의 부재에서 이러한 회로를 공부하기를 원하는 경우,이 메소드는 장점이있다. 이 방법은 원심 연결을 끊고이므로, 잘 AOB 기능의 원심 변조에 문의에 적합하지 않다. VNO-AOB 생체 준비는 배우기 어렵지만, 한 번 달성이 강력한 감각 회로 회로 조직, 정보 처리 및 신경 가소성을 조사 할 때 신뢰할 수있는 플랫폼을 생산하고 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Straight Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors-Straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors-Curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#3 Scalpel Handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#11 Scalpel Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3120030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Carbon Steel Razor Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri Dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Chamber</td>
			<td>Custom&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See Fig. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm</td>
			<td>Custom&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning Silicon Vacuum grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>146355D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps, Student</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps, Biologie Tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps, Student</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.0045&#34; Polyimide Tubing</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>823400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45505-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-171-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two ton epoxy</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>5E157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ValveBank Pressurized Perfusion Kit</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>09-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ValveLink digital/manual controller</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>01-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myo-inositol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo preparations of the intact vomeronasal organ and accessory olfactory bulb

마우스 액세서리 후각 시스템 (AOS)는 비 휘발성 사회 냄새, 페로몬, 및 kairomones을 검출하는 전문적인 감각의 통로입니다. AOS 경로의 첫 번째 신경 회로는, 액세서리 후각 망울 (AOB)가, 같은 영토 침략과 짝짓기 같은 섹스의 전형적인 행동을 수립에 중요한 역할을했다. 이 작은 (&lt;1mm 3) 회로는 동종의 분비물과 배설물에 화학 감각 신호의 성별, 긴장, 스트레스 등의 독특한 행동 상태를 구별 할 수있는 능력을 가지고 있습니다. 이 시스템의 컴팩트 한 조직이 동시에 회로의 많은 부분에서 기록에 대한 독특한 기회를 제공하는 동안, AOB에있는 감각 처리의 조사는 크게 인해 뇌의 실험적으로 불리한 위치에 도전 남아있다. 여기, 우리는 연결 떠나, 전방 마우스 두개골의 단일 반구 안에 그대로 AOB를 제거하는 다단계 해부을 보여모두 주변 vomeronasal 감각 뉴런 (하여 VSN) 지역 신경 회로 손상에 이온. 절차는 마취제의 부재 및 전기 생리 AOB 회로 소자로부터 광 기록을 용이하게 외관 검사를 지시하는 AOB 표면을 노출. AOB 다운 스트림 활동을 기록하는 동안하여 VSN을 수용하는 vomeronasal 기관 (VNO)로가는 캐뉼라를 삽입하면, 하나는 직접 사회 냄새와 페로몬에 주위를 노출 할 수 있습니다. 이 절차는 행동의 변화에​​ 페로몬에 노출을 연결하는 메커니즘에 대해 설명해 주실 수있는 AOS 정보 처리에 제어 문의 할 수 있습니다.

이러한 준비와 성공을 달성하는 것은 광범위한 연습이 필요하고, 실패 할 수있는 몇 가지 단계가 있습니다. 하나는 성공을 달성하기 전에 많은 시도를 필요로 할 것으로 예상해야한다. 사용자 지정 해부 실이 프로토콜의 성공적인 완료를 위해 필요하며, 이전에 절개의 이후 단계를 시작하기 얻어야한다. 도 1에 제시된 챔버 설계는이 목적을 위해 충분하며, 최소의 가공 요구에 비교적...

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Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

마우스 액세서리 후각 전구 (AOB)는 감각 코딩의 맥락에서 공부하기 어렵다. 여기, 우리는 AOB 신경 마우스 페로몬과 kairomones의 정보 처리에 대한 연구를 촉진, 자신의 주변 입력에 기능적으로 연결되어있는 한 생체 준비를 생산하는 절개를 보여줍니다.

본래 Vomeronasal 기관 및 액세서리 후각 망울의 생체 준비

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

ex-vivo-preparations-intact-vomeronasal-organ-accessory-olfactory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

10.7K 조회수.  UT Southwestern Medical Center.  마우스 액세서리 후각 전구 (AOB)는 감각 코딩의 맥락에서 공부하기 어렵다. 여기, 우리는 AOB 신경 마우스 페로몬과 kairomones의 정보 처리에 대한 연구를 촉진, 자신의 주변 입력에 기능적으로 연결되어있는 한 생체 준비를 생산하는 절개를 보여줍니다. 

비디오: Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is planar multielectrode array (MEA) recording. Here we document the use of MEAs to study the mouse vomeronasal organ (VNO), which plays an essential role in the detection of pheromones and social cues via a diverse population of sensory neurons expressing hundreds of types of receptors. Combining MEA recording with a robotic liquid handler to deliver chemical stimuli, the sensory responses of a large and diverse population of neurons can be recorded. The preparation allows us to remove the intact neuroepithelium of the VNO from the mouse and stimulate with a battery of chemicals or potential ligands while monitoring the electrical activity of the neurons for several hours. Therefore, this technique serves as a useful method for assessing ligand activity as well as exploring the properties of receptor neurons. We present the techniques needed to prepare the vomeronasal epithelium, MEA recording, and chemical stimulation.

Multielectrode array (MEA) recordings provide a method for studying the electrical activity of large populations of neurons. Here, we present the details of a MEA preparation to record from the mouse vomeronasal epithelium while simultaneously stimulating the tissue.

Vomeronasal 상피의 Multielectrode 배열 레코딩

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

연구

신경과학

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

손상의 감각 오르간 전구체 세포 라이브 셀 이미징 Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

강한 감각 뉴런의 Lentivirus - 중재 유전자 조작 및 시각화 생체내에</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

결합을 사용하여 타겟팅 후각 망울의 뉴런 VIVO에서 Electroporation 및 Gal4 기반 향상제 트랩 Zebrafish 라인

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. Functional optical imaging techniques are advantageous to visualize the activation of these modules in sensory cortices with high spatial resolution. In this context, endogenous optical signals that arise from molecular mechanisms linked to neuroenergetics are valuable sources of contrast to record spatial maps of sensory stimuli over wide fields in the rodent brain.
Here, we present two techniques based on changes of endogenous optical properties of the brain tissue during activation. First the intrinsic optical signals (IOS) are produced by a local alteration in red light reflectance due to: (i) absorption by changes in blood oxygenation level and blood volume (ii) photon scattering. The use of in vivo IOS to record spatial maps started in the mid 1980's with the observation of optical maps of whisker barrels in the rat and the orientation columns in the cat visual cortex1. IOS imaging of the surface of the rodent main olfactory bulb (OB) in response to odorants was later demonstrated by Larry Katz's group2. The second approach relies on flavoprotein autofluorescence signals (FAS) due to changes in the redox state of these mitochondrial metabolic intermediates. More precisely, the technique is based on the green fluorescence due to oxidized state of flavoproteins when the tissue is excited with blue light. Although such signals were probably among the first fluorescent molecules recorded for the study of brain activity by the pioneer studies of Britton Chances and colleagues3, it was not until recently that they have been used for mapping of brain activation in vivo. FAS imaging was first applied to the somatosensory cortex in rodents in response to hindpaw stimulation by Katsuei Shibuki's group4.
The olfactory system is of central importance for the survival of the vast majority of living species because it allows efficient detection and identification of chemical substances in the environment (food, predators). The OB is the first relay of olfactory information processing in the brain. It receives afferent projections from the olfactory primary sensory neurons that detect volatile odorant molecules. Each sensory neuron expresses only one type of odorant receptor and neurons carrying the same type of receptor send their nerve processes to the same well-defined microregions of &tilde;100&mu;m3 constituted of discrete neuropil, the olfactory glomerulus (Fig. 1). In the last decade, IOS imaging has fostered the functional exploration of the OB5, 6, 7 which has become one of the most studied sensory structures. The mapping of OB activity with FAS imaging has not been performed yet.
Here, we show the successive steps of an efficient protocol for IOS and FAS imaging to map odor-evoked activities in the mouse OB.

This article presents the protocols of intrinsic optical signals and flavoproteins autofluorescence signals imaging to map odor-evoked activities at the surface of the olfactory bulb in mice.

광 반사율과 Autofluorescence 신호를 사용하여 마우스 후각 망울에서 이미징 냄새 Evoked 활동

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

영상의 연결 응답 Vomeronasal 조직의 슬라이스 준비에 유전적으로 인코딩된 칼슘 센서를 표현

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

전체의 전의 생체내의 Culturing, 개발 Drosophila의 뇌는

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

모델로 후각 시스템은 축삭 성장 패턴 및 형태를 연구하는<em&gt; 생체</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. Choroid plexus epithelial cells (CPECs) covering the surface of choroid plexus tissue harbor multiple unique cilia, but most of the functions of these cilia remain to be investigated. To uncover the function of CPEC cilia with particular reference to their motility, an ex vivo observation system was developed to monitor ciliary motility during embryonic, perinatal and postnatal periods. The choroid plexus was dissected out of the brain ventricle and observed under a video-enhanced contrast microscope equipped with differential interference contrast optics. Under this condition, a simple and quantitative method was developed to analyze the motile profiles of CPEC cilia for several hours ex vivo. Next, the morphological changes of cilia during development were observed by scanning electron microscopy to elucidate the relationship between the morphological maturity of cilia and motility. Interestingly, this method could delineate changes in the number and length of cilia, which peaked at postnatal day (P) 2, while the beating frequency reached a maximum at P10, followed by abrupt cessation at P14. These techniques will enable elucidation of the functions of cilia in various tissues. While related techniques have been published in a previous report1, the current study focuses on detailed techniques to observe the motility and morphology of CPEC cilia ex vivo.

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

맥락총 상피 세포의 섬모 운동의 관측<em&gt; 전의 VIVO</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

의 후각 망울에서 칼슘의 변경 사항을 모니터링을 통해 온도에 의한 신경 세포의 활동을 기록<em&gt; Xenopus의의 laevis의</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...