우리는이 방법의 개발 기간 동안 기술 지원 리노 김, 스티브 구즈만과 Ujit Satyarthi에 특별한 감사를드립니다. 마이런 호손, 리차드 Spengel, 그리고 로베르토 로자 스 여기에 사용 된 방을 가공하고 꼭 필요한 기술 지원을 제공했습니다. 특히, 로베르토 로자 스는 그림 4를 만들었습니다. 우리는 또한 위의 chemotaxis 분석의 발전에 이전 스콧 프레이저 귀중한 조언 감사합니다. 이 작품은 부분적으로 NIH-MBRS 평가 점수 - 5S06GM048680-13 MEdB에 의해 CW의 CSU, 왕국 대학원 논문 지원 프로그램에서 수상에 의해 지원되었다.

1. 1 일 : coverslips에 밤 문화의 트렁크 신경 튜브의 분리 <ol><li> 38 56 H에 대한 여자의 알을 품어 ° C.는 부화에서 알을 제거 다소 70 %의 에탄올과 함께 물을 뿌리 한 후이를 건조 할 수 있습니다. UV-소독 유리 트레이에 열려있는 알을 해봐. </li><li> 의 난황에서 각 배아를 추출하고 여자는 벨소리의에 배치합니다. 곡선 가위로 그 피 섬 주변의 제 1 절삭하여이 작업을 수행 한 후, 무딘 집게와, 그 extraembryonic 막에 의해 배아를 들고 여자는 벨소리의 솔루션을 포함하는 멸균 플라스틱 페트리 접시에 배치합니다. </li><li> 초과 extraembryonic 멤브레인을 트리밍뿐만 아니라 텅스텐 바늘 (그림 1)를 사용하여, 두개골 vagal, 그리고 성례의 축 수준의 각 배아의 줄기를 분리합니다. 첫째, 단계 HH15-17 11 사이에 구에 대한 배아를 선택합니다. 최대 단계 HH15와 들어, forebrain 및 hindbrain 축이 예각을 형성하고 따라서 머리 caudally 기울 나타납니다. 에무대 HH17는 꼬리 꽃 봉오리는 현재이며, 틸트 ventrally했지만 아직 somites 포함되어 있지 않습니다. 텅스텐 바늘로 배에서 약 2 mm로 extraembryonic 멤브레인을 트림과 10 체절에 앞 모든 배아 조직을 잘라. 또한 다섯 번째 가장 새로 형성된 체절 주변부터 모든 꼬리 배아 조직을 제거합니다. </li><li> Dispase에서 분리 된 배아 줄기을 (0.24 U / ML DMEM) 장소 37에서 1 H 15 분에 넣어 부화 ° C 5 % CO 2. 줄기는 부화를 시작하면 배양 NT의 explants 6 coverslips (CS) (단계 1.5-1.8)를 준비 시작합니다. </li><li> 70 % 에탄올 6 CS를 (살균, ultrapure 물에 희석) 헹굼 후이를 건조 할 수 있습니다. 실험실 마커를 사용 직경 1cm (fibronectin 코트가 적용된 곳이 원 나중에 확인하는 데 도움이됩니다)에 대해 각 CS의 중심부에 원을 그립니다. 각 CS 같은 얼굴에, 그 단어 (이 Y에 도움이 될 그려 원 외부 (또는 다른 비대칭 단어 나 모양) &quot;이&quot;을 작성ou는 CS의 표시된면이 아래로 직면하거나 여부를 확인). </li><li> 별도의 40에 각 CS를 배치 표시된 표면이 아래로 직면하고 음식이 10 분의 살균 UV 램프 아래에 공개 앉아 할 수있는 X 10mm 무균 요리. </li><li> 60 μl fibronectin (FN, 10 μg / ML DMEM)을 적용 1cm의 원 안에 전체 지역 확인하는 동안 CS의 해제 표면에은 코팅되어 있습니다. 30 분에 37 ° C에서 배양 한 후 조심스럽게 각 CS에서 fibronectin을 기음 위해 요리를 놓습니다. </li><li> 의 FN-코팅 영역에 250 μl &#39;문화&#39;중간 [L-글루타민과 DMEM (2 ㎜), 페니실린 (100U/ml), 스트렙토 마이신 (100 mcg / ML) 및 8% 태아 소 혈청 (FBS)를] 추가 CS. 37 각 CS를 포함하는 요리를 놓고 ° C 5 % CO 2 다시 국세청이 분리 될 때까지. </li><li> L15 매체를 포함하는 한 5cm 유리 페트리 접시에 모든 incubated 배아 줄기를 전송하고 고급 집게와 텅스텐 바늘 (그림 1)를 사용하여 각 NT를 해부 시작합니다. CNT를 손상하지 조심하면서 arefully 날카로운 텅스텐 바늘로 NT와 somites의 국경을 따라 잘라. 이 트렁크의 꼬리 - 가장 끝에서 각각 NT를 분리 시작하는 것이 더 쉽습니다. </li><li> (약 8 15 somites 사이에 국세청이 오랜 추천) 밤 문화에 straightest과 긴 국세청 6을 선택합니다. 문화 매체와 중이오 micropipette 팁을 사용하여 (1.8 단계 1.5에서) 자신의 이전 준비 CS에 6 박의 각을 전송합니다. NT는 표면에 떠있는 상태로 유지되지 않습니다 있는지 확인하십시오. NT는 부동 인 경우가 micropipette를 사용하여 침몰 때까지에 매체를 똑. </li><li> 37 ° C 5 % CO 2 박 각 접시를 놓습니다. 각 NT 바로 전에 보육에있는 접시를 (참조로 단계 1.5에서 그려진 원을 사용하여) 배치에 각 CS의 FN-코팅 지역 내에있는 유지를 위해주의하십시오. micropipette는 필요한 경우보다 각각 NT의 위치를​​ 조정하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 장소에서적어도 2는 살균 15 ML의 원심 분리기 튜브에 문화 매체의 ML (혈청없이) 37 ° C 5 % CO 2 박 품다. 뚜껑을 남겨은 약간 밤새 조정하는 매체의 pH를 허용하도록 unscrewed. 사전 잠복기 매체 것은 분자 그라디언트의 설립을 방해 할 수 있습니다 귀하의 챔버에서 거품 형성을 방지하는 것이 중요합니다. 예 : &quot;preinc​​ubated&quot;중간은 모든 향후 단계에 사용되어야합니다. 사용하지 않을 경우,이 매체는 37 잠복기가되어야 ° C.를 </li></ol> 2. 일 2 : 수정 Zigmond 챔버와 셀 마이그레이션의 시간 경과 분석로드 <ol><li> 배양 6 박을 버리고, 가장 분석에 적합 3 문화를 선택합니다. 일반적으로, 적어도 하나의 긴 직선 가장자리가 NCC 문화는 (그림 2A)을 선택해야합니다. 3 가장 문화는 다른 치료와 함께 각 하루 종일 셋 수정 Zigmond 챔버를로드 및 영화에 사용됩니다. 3 문화 중에 loadin에 대한 하나를 선택g는 첫 번째 챔버와 나중에 사용하기 위해 보육에 다른 사람들을 반환합니다. </li><li> 면봉 사용하여 저수지 한 수정 Zigmond 챔버의 다리를 주변 석유 젤리의 얇은, 심지어 레이어를 적용합니다. </li><li> CS의 표면에 부착 주변 NCCs을 떠나는 동안 텅스텐 바늘로 부드럽게, CS에서 NT를 제거합니다. NCC 문화의 straightest 가장자리의 방향을 기억하는 펜으로 요리를 선택합니다. </li><li> 다리에 preincubated 매체의 몇 방울을 넣으십시오. 기존의 문화 매체의 대부분을 제거 할 수 Kimwipe에 대한 고급 집게와 CS, 소량 CS의 가장자리를 들고 다음, 즉시 촬영 할 문화의 직선 가장자리가 위에 중심이되도록 수정 Zigmond 챔버에 CS를 배치 다리의 길이와 거의 수직 다리 - 저수지의 국경 (그림 2A, B)로 변경합니다. </li><li> 역 현미경 사용, 일에 가장 가까운 다리의 편에서는 게 바로 NCC 테두리를 이동(; 컨트롤이 두 번째로드 중 저수지에 해당합니다 그림 2B) 의심 chemotactant이 포함됩니다 전자 저수지. 또한보다 정교하게 다리 - 저수지의 국경에 수직이되도록 문화의 직선 가장자리를 맞 춥니 다. </li><li> 조심스럽게,하지만 안전하게 완전히 더가 밀폐 될 수 있도록 CS의 가장자리를 따라 추가 석유 젤리를 배치 한 후, 챔버에 밀봉되어 있는지 확인하고, Zigmond 챔버에 존재 석유 젤리로 CS를 누르십시오. 밀봉 과정에서 어떤 움직임을 해결하기 위해 다시 NCC 테두리의 각도를 세밀하게 조정할 수 있습니다. </li><li> 의심 chemotactant 첫 번째 (그림 2B)를 포함하지 않습니다 저수지를로드합니다. 약 300 μl preincubated 매체와 (저수지에서 거품을 생성하지 않도록주의하면서) 전체 때까지 저수지에 매체를 삽입으로 1 ML의 주사기 (첨부 바늘 인치 25 G X 1.5를)로드하여 이렇게. suff와 양쪽 저수지를 연결이전 다음 저장소를로드에 석유 젤리의 icient 금액입니다. </li><li> 후보 chemotactant를 포함하는 preincubated 매체를 사용하여이 시간을 제외하고, 단계 2.7을 반복합니다. 항상 테스트 분자를 부족한 저수지를로드 한 후 테스트 할 수있는 분자를 포함하는 저장소를로드 할 수있는 문화를 통해 분자 그라디언트를 생성 할 때이 중요합니다. </li><li> ° C 전에 촬영 1 H에 대한 배양하기 위해 37로드 Zigmond 챔버를 놓습니다. 이미지 90 초 간격으로 3시에 NCC 문화의 straightest 테두리는 약 37 ° C (그림 2A, B)에서 잠복기 동안. 이상적인 대표 점선 상자, 이전의 영화를 만드는, 획득 할 이미지의 가장자리가 함께하고 마지막 저수지로드를 인접 다리 (그림 2B, 상단 패널의 가장자리를 만지지 정렬되도록 카메라를 정렬해야합니다 이미지에 위치). 이것은 분자 적용 그라디언트와 일의 방향을 표준화하여 나중에 소프트웨어 분석을 용이하게합니다각 영화에서 촬영 저수지에서 전자 거리가 제작했다. </li><li> 컨트롤에 대한 반복 (단계 2.1)을 선택한 두 개의 다른 NCC 문화 각각에 대해 2.2-2.9 단계를하지만, 적절한 매체를 사용하여 각 저수지를 채 웁니다. 한 가지 유형의 제어를 들어 preincubated 매체가 테스트 할 수있는 분자를 포함하지 않는과 두 저수지를 채 웁니다. 두 번째 제어 치료, 프라임 CS를 장착하기 전에 의심 chemotactant를 포함하는 preincubated 매체의 몇 방울과 다리입니다. 그런 다음, 의심 chemotactant를 포함하는 동일한 매체 모두 저수지를로드합니다. </li><li> ImageJ (NIH) 수동 추적 사용 <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html">(rsb.info.nih.gov / 엘 제이 / 플러그인 / 트랙 / track.html)</a> 와 Chemotaxis 및 마이그레이션 도구 v1.01 <a href="http://www.ibidi.de/applications/ap_chemo.html">(/ www.ibidi.de / 응용 프로그램 ap_chemo.html)</a> 추적 플러그인을 문화 제이의 직선 국경을 따라 주변 NCCs의 마이그레이션이군요 이미징 및 취득 철새 궤도 (그림 2B-C)의 다양한 매개 변수를 분석 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 대표 결과 : 많은 트렁크 NCCs이 위 기술을 사용하여 후보 chemoattractant에 응답했다 영화에서 셀 궤도의 샘플 (그림 2D) 표시됩니다. 긍정적 인 응답이 예에서 대부분의 세포는 chemoattractant 그라디언트 최대 순 이동을합니다 (빨간색으로 표시) 표시됩니다. 탄도 데이터는뿐만 아니라 세포 이주의 다른 속성을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 시각적으로 수정 Zigmond 챔버, 알렉사 형석 488 IgM 공액 (MW ~ 900 kDa)의 적용 기울기를 평가하기 위해 수정 Zigmond 챔버의 두 번째 저수지 (약 40 μg / ML H 2 O에서)에로드되었습니다. 기울기는 (그림 3) 1 H에 의해 설립, 26 H 후 여전히 다소 존재하지만, 크게 50 H가 감소되었습니다. 테스트 할 수있는 분자가 작은 경우에는 응용 그라디언트 부표시되는 내용보다 더 빨리 저하하겠습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig1.jpg" /> 그림 1. fibronectin - 코팅 coverslips에 하룻밤 배양을위한 트렁크 수준 국세청의 Explantation. 등쪽 NT에서 트렁크 NCCs의 delaminate이 somites 8-28 인접 해 있기 때문에, NT의 세그먼트는 microdissection 및 NT의 explant에서 NCCs의 이민을 허용 할 fibronectin 코팅 CS에서 하룻밤 배양에 의해 격리되어 있습니다. 사람들이 더 이상 직선 국경과 NCC 문화를 얻을하는 경향이로 8-15 somites 길고 상대적으로 직선 사이에 절연 국세청은 최고의 하루 아침에 배양에 적합합니다. 다른 신경 크레스트 축 수준을 야기 할 신경 튜브의 영역은 작은 글꼴로 표시됩니다. 초, 체절. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig2.jpg" /> 그림 2. explanted 트렁크 NCCs의 마이그레이션을 평가하기위한 방법수정 Zigmond 챔버를 사용합니다. (A) 가늘고 긴 트렁크 NCC 문화는 적어도 하나의 긴 직선 테두리와 함께 국세청과 결과 NCC 문화의 밤 배양에 의해 준비가되어이 실험을 위해 선택됩니다. 선택한 문화의 가장 긴 직선 테두리가 다음 다리 - 저수지의 국경에 수직 위치, 그리고 미래를 적용 그라디언트의 벡터에 따라서 평행하다. Zigmond 챔버 및 씰링에 NCC 문화의 위치를 미세 조정 (B) 후 챔버에 coverslip은 챔버가로드됩니다. chemotaxis을 테스트를 할 때, 의심 chemotactant 포함되지 않습니다 저수지 (이 -) 첫 번째와 봉인로드됩니다. 그런 다음, 다른 저수지는 의심 chemotactant (+)와 봉인과 함께로드됩니다. 이전에 선택한 국경을 따라 주변 NCCs는 이미징 및 ImageJ (아래 패널)에 대한 수동 추적 플러그인을 사용하여 추적 할 수 있습니다. 반응 (C) 많은 철새 특성에 적용 기울기는 추적 데이터를 기준으로 평가 될 수있다. 예를 들어, chemotaxis 지수는이 마이그레이션 한 총 거리에 의해 X-축을 따라 세포의 변위를 나누어 도출 할 수 있습니다. (D) 매력 응답의 예는 처음 Chemotaxis 및 마이그레이션에 의해 생성 된 셀 궤적 플롯으로 표시됩니다 ImageJ에 대한 도구 플러그인. 각 궤도의 시작 지점은 원점 (0,0)으로 설정되어 있습니다. 또한 chemoattractant 원본에 가까운 (동일 가중치를 모든 셀 파란색 십자가)은 최종 위치에있는 모든 세포의 질량의 chemoattractant source.The 센터쪽으로 이주 얼마나 더 많은 세포합니다. NCCs, 신경 크레스트 세포, 레드 트랙과로드 저수지를 향해 마이그레이션 세포 의심 chemoattractant, 블랙 트랙, 거리에 마이그레이션 세포, (+), 높은 chemotactant 농도, (-), 낮은 chemotactant 농도. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig3.jpg" /> <stron알렉사 형석 488 IgM의 공액의 추가에 따라 다른 시간에 수정 Zigmond 챔버의 다리 g&gt; 그림 3. 강도 프로필이. 챔버는 메인 예외 프로토콜에 설명 된 그와 비슷한 방식으로로드 된 그 preincubated 물 (대신 preincubated 매체의) 40 μg / ML에 항체를 희석하는 데 사용하고, 작은 공기 주머니가 다리의 끝 (거리에 위의 강도 프로필 촬영 슬라이스에서)에 참석했다되었습니다. 처음에는 아무 그라디언트가 다리의 대부분에 걸쳐 존재 없었다. 로 1 하 기울기는 설립 26 H에 이르기까지 현재 남아되었다. 50 H하여 그라디언트의 존재가 다리의 서로 다른 영역에서 일관했고, 때 현재, 그라디언트의기구가 크게 감소되었습니다. 모든 프로필은 AxioVision 4.6 소프트웨어를 사용하여 다리 동일한 슬라이스 (한 다리 저수지 국경에서 다른까지)에서 생성되었습니다. 참고 동안에도 공기포켓이 존재했다, 기울기는 중단되지 않았습니다. 높은, 높은 강도, 낮은, 낮은 강도, 다리의 전체 너비 (2 ㎜)에서 X 축, 거리, (+), 알렉사 형석 488 IgM 켤레와 함께로드 저수지, (-), 저장소 켤레에로드되지 않았습니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig4.jpg" /> 그림 4. 수정 Zigmond 챔버 사양. 표시는 차원 사양 (± 0.2 mm)과 함께 여기에 사용되는 수정 Zigmond 챔버의 다이어그램이다. 측정은 적당한 개인 환경 설정을 일치하기 위해 조정할 수 있습니다. 보충 프로토콜 : 수정일 Zigmond 상공 회의소의 제작 아래의 프로토콜에 대한 참고 자료로 4 그림 참조하십시오 : <ol><li> 16분의 3 &quot;두께의 광택 아크릴 (4.45 mm 실제 두께)의 시트를 구입하십시오. </li><li> 테이블을 사용하여보고에 대형 챔버 공백을 잘라33.25 mm X 64.57 mm의 거친 크기. 이 가공 3.175 mm 추가 자료를 수 있습니다. </li><li> 바이스에 챔버 빈을 설정합니다. 30.07 mm X 61.39 mm : 밀링 머신 및 6.35 mm (1 / 4 &quot;) 엔드 밀 비트, 마무리 가공 정확한 크기로 챔버의 측면이 있습니다. </li><li> 밀링 머신에 챔버를 비워 놓고 x와 가장자리 찾기와 Y 축 모두 함께 빈의 중심을 찾으 한 후 중앙 위치를 제로. </li><li> 상단 표면에 엔드 밀 비트를 터치하면 챔버 높이 (Z 축)을 취득하고 높이를 제로. </li><li> 3.91 mm (0.154 &quot;) 엔드 밀 비트를 사용하여 첫 번째 저수지의 X-축 (긍정적 인 방향)을 따라 비트 3.03 mm 오프셋. 2.84 mm의 깊이에 챔버로 가공을 시작 완벽한 저수지에 반대 (음수) 방향으로 &quot;(7.62 mm 0.300)로 통과 한 후 7.62 mm (0.300)&quot;로 y 축 (긍정적 인 방향)을 따라 이동하면서 15.24 mm (0.600 &quot;)의 길이입니다. 오프셋X-축 (부정적인 방향)을 따라 3.03 mm (0.119 &quot;)에 비트와 두 번째 저수지에 대해 동일한 과정을 반복합니다. </li><li> 의 가장자리에있는 챔버를 놓고 실험하는 동안 미디어를로드하는 챔버의 측면에 저수지의 끝을 연결하는 각 저수지 (4 총)의 말에 1.09 mm (인치 0.043) 드릴 비트를 사용하여 구멍을 뚫는다. </li><li> 어떤 화학 오염 물질을 제거하는 데 도움 따뜻한 비눗물에 잘 챔버를 적시 게. </li><li> 모든 비누를 제거 두 번 증류수에 잘 챔버를 적시하고 헹굼. 방은 이제 위에서 설명한대로 사용할 수 있습니다. </li></ol>

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

트렁크 NCCs에 chemotaxis 조사를 실시하는 것은 이유 시리즈 도전 입증되었습니다. 따라서 트렁크 NCCs은 트렁크 수준 NT의 주 explantation에서 구할 수해야하며 간선 NCCs는 교양 장기 경우 차별화 이기종 줄기 세포 인구를 구성합니다. 체외에서 homogenously 배포 세포 인구의 chemotactic 응답을 공부하는 종래의 방법은 먼저 세포가 고립과 chemotaxis 챔버 (예를 들어, Boyden 챔버 12)의 replated homogenou...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 오메가 과학 </td><td> DM-22 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린의 스트렙토 마이신 솔루션 </td><td> 오메가 과학 </td><td> PS-20 </td><td> 100X 주식 농도 </td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> 오메가 과학 </td><td> GS-60 </td><td> 100X 주식 농도 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 오메가 과학 </td><td> FB-11 </td><td> 롯 # 105247 (또는 비교가 또) </td></tr><tr><td> 수정 Zigmond 챔버 </td><td> 홈 만든 </td><td> N / A </td><td> 저수지 볼륨 : ~ 160 μl EA, 추가 사양, 그림을 참조하십시오. 4 보충 제조 프로토콜 </td></tr><tr><td> 세포 배양 접시 </td><tD&gt; Denville </td><td> T6040 </td><td> 40 X 10mm </td></tr><tr><td> Fibronectin </td><td> BD </td><td> 354008 </td><td> 10X 증권은 1 ML H 2 O 9 ML DMEM에 1 밀리그램 FN을 diluting하여 준비 </td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> 어부 </td><td> 12-548-B </td><td> Precleaned, 22 X 22mm </td></tr><tr><td> L15 매체 </td><td> 열 과학 </td><td> SH30525.02 </td><td></td></tr><tr><td> 석유 젤리 </td><td> 불우 </td><td> 011110794642 </td><td> 백퍼센트 </td></tr><tr><td> 원심 분리기 관 </td><td> Biologix </td><td> 10-9152 </td><td> 15 ML </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> 전지 시스템 </td><td> 4Z0-850 </td><td> 10X 주식 농도 </td></tr><tr><td> 주사기 </td><td> BD </td><td> 309602 </td><td> 한 ML </td></tr><tr><td> 바늘 </td><td> BD </td><td> 305127 </td><td> 25 G X 1.5 인치 </td></tr><tr><td> 알렉사 형석 488-IgM </td><td> 나는nvitrogen </td><td> A21042 </td><td> 주식은 2 밀리그램 / ML이다; 7 첩자 염료 / 사마귀 IgM </td></tr><tr><td> 해부 집게 </td><td> FST </td><td> 기타. </td><td> 뒤몽 # 5 또는 55, 직선 날붙이, 스테인리스 스틸 또는 티타늄 </td></tr><tr><td> 텅스텐 니들 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 집에서 만든, 핀 홀더에 배치 </td></tr><tr><td> 부근 집게 </td><td> Tiemann </td><td> 160-18 </td><td> 계란 노른자에서 벨소리 집으로 배아를 전송하는 데 사용 </td></tr></tbody></table> 보충 프로토콜 : 수정일 Zigmond 상공 회의소의 제작 아래의 프로토콜에 대한 참고 자료로 4 그림 참조하십시오 : <ol><li> 16분의 3 &quot;두께의 광택 아크릴 (4.45 mm 실제 두께)의 시트를 구입하십시오. </li><li> 테이블을 사용하면 33.25 mm X 64.57 mm의 거친 크기에 대형 챔버 공백을 잘라, 보았다. 이 가공 3.175 mm 추가 자료를 수 있습니다. </li><li> 바이올렛에 챔버를 비워 설정SE. 30.07 mm X 61.39 mm : 밀링 머신 및 6.35 mm (1 / 4 &quot;) 엔드 밀 비트, 마무리 가공 정확한 크기로 챔버의 측면이 있습니다. </li><li> 밀링 머신에 챔버를 비워 놓고 x와 가장자리 찾기와 Y 축 모두 함께 빈의 중심을 찾으 한 후 중앙 위치를 제로. </li><li> 상단 표면에 엔드 밀 비트를 터치하면 챔버 높이 (Z 축)을 취득하고 높이를 제로. </li><li> 3.91 mm (0.154 &quot;) 엔드 밀 비트를 사용하여 첫 번째 저수지의 X-축 (긍정적 인 방향)을 따라 비트 3.03 mm 오프셋. y 축 따라 이동하는 동안 (2.84 mm의 깊이에 챔버로 가공을 시작합니다 7.62 mm (0.300까지) 방향으로 긍정적 인 15.24 mm (0.600 &quot;)의 전체 저수지의 길이에 반대 (음수) 방향으로)&quot;를 선택한 다음)과 7.62 mm (0.300으로 통과 &quot;. X-축 (부정적인 방향)을 따라 3.03 mm (0.119 &quot;)에 비트 오프셋 두 번째 저수지에 대해 동일한 과정을 반복합니다. </li><li> 의 가장자리에있는 챔버를 배치합니다그리고 실험 기간 동안 미디어를로드하는 챔버의 측면에 저수지의 끝을 연결하는 각 저수지 (4 총)의 말에 1.09 mm (0.043 인치) 드릴 비트를 사용하여 구멍을 뚫는다. </li><li> 어떤 화학 오염 물질을 제거하는 데 도움 따뜻한 비눗물에 잘 챔버를 적시 게. </li><li> 모든 비누를 제거 두 번 증류수에 잘 챔버를 적시하고 헹굼. 방은 이제 위에서 설명한대로 사용할 수 있습니다. </li></ol>

analysis of trunk neural crest cell migration using a modified zigmond chamber assay

신경 크레스트 세포는 (NCCs) 상피 - 중간 엽 전이 1,2를 진행 한 후 등쪽의 신경 튜브 (NT)에서 이민을하는 척추 동물의 개발에 존재하는 세포의 과도 인구입니다. 자신의 목표에 도달 할 때까지 EMT 따라 NCCs는 stereotypic 경로를 따라 큰 거리를 마이그레이션. NCCs는 뉴런, glia, melanocytes, 그리고 1-3 chromaffin 세포를 포함한 세포 유형의 광대 한 배열로 차별화. 자신의 적절한 타겟 위치에 도달하고 인식 NCCs의 능력 트렁크 구성 요소를 세 NCC-파생를 포함하는 모든 구조의 적절한 형성을위한 기초입니다. 트렁크 NCC 마이그레이션에 대한 지침의 메커니즘을 Elucidating하는 것은 큰 의미를 갖는 일이었다. 많은 분자 NCC 마이그레이션 4 안내하는 입증되었습니다. 예를 들어, 트렁크 NCCs는 이러한 Semaphorin, Ephrin, 그리고 슬릿 리간드 5-8 등의 제외지도 단서에 의해 거부 될 것으로 알려져 있습니다. 그러나,하지최근 트렁크 NCCs 9 식별 된 모든 chemoattractants이 때까지. 자기편 세포의 chemotactic 동작을 공부에 체외 접근 방법에서 기존는 불후의, homogenously 배포 세포를 가지고 가장 적합한하지만, 처음 균일 분포를 부족 빠르게 (예 : NCCs 등) 차별화 특정 기본 줄기 세포 문화에 적용 할 더 도전합니다. chemotaxis 연구 트렁크 NCCs의 분포를 균질화하는 한 접근 방식이 기본 NT의 explant 문화에서 트렁크 NCCs를 분리하는 것입니다 다음, 리프트하고는 거의 100 % 합류 할 replate. 그러나,이 도금 방식은 시간과 충분한 세포를 explant 노력의 상당한 양을 필요로 거칠고이며, 생체 조건에서 발견 할 수있는 이종 방식으로 트렁크 NCCs를 배포합니다. 여기, 우리는 requirin없이 트렁크 NCCs의 chemotaxis 및 다른 철새 반응을 평가 할 수 있습니다에서 체외 접근 방식을보고균일 한 세포 분포를 GA. 이 기술은, 기본의 시간 경과 영상을 이용하여 수정 Zigmond 챔버 (표준 Zigmond 챔버가 다른 10 설명) 내부 트렁크 NCCs을 교란되지 않은. 자신의 예측 자연 방향에 수직 인 chemotactant 그라디언트로 문화의 주변에서 트렁크 NCCs를 노출하여 적용 chemotactant 기울기에 의해 유도 철새 극성에 변경이 감지 할 수 있습니다. 이 기술은 저렴 복제 치료를 당 두 개의 NT의 explants의 배양을 필요로, 거친 셀 리프팅 (예 : trypsinization 등) 방지 생체 조건에 유사한 배포판에 트렁크 NCCs을 떠난, explantation과 실험 사이의 시간의 양 다운 컷 (이 가능성이 차별화의 위험을 감소), 그리고 수많은 철새 특성을 시간 경과 평가를 할 수 있습니다.

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Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

explanted 전지 (트렁크 신경 크레스트 세포)의 마이그레이션을 분석 접근 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은, 저렴한 부드러운, 그리고 차 트렁크 신경 크레스트 세포 배양에서 세포 세포의 상호 작용에서 파생 된 것과 같은 철새 극성에 모두 chemokinesis 및 기타 영향의 chemotaxis를 구별 할 수 있습니다.

수정 Zigmond 회의소 분석을 사용하여 트렁크 신경 크레스트 세포 마이그레이션 분석

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after ...

analysis-trunk-neural-crest-cell-migration-using-modified-zigmond

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.4K 조회수.  California State University, Northridge. explanted 전지 (트렁크 신경 크레스트 세포)의 마이그레이션을 분석 접근 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은, 저렴한 부드러운, 그리고 차 트렁크 신경 크레스트 세포 배양에서 세포 세포의 상호 작용에서 파생 된 것과 같은 철새 극성에 모두 chemokinesis 및 기타 영향의 chemotaxis를 구별 할 수 있습니다.

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Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

절연 및 Neurosphere 어세를 사용하여 성인 마우스 신경 줄기 세포의 확장

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

연구

신경과학

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Neurosphere 분석을 사용하여 마우스 배아 신경 줄기 세포 문화 구축

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

세포 어세를 형성 신경 콜로니 : 신경 전구 세포로부터 타고난 신경 줄기 세포를 차별 어세이

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a well-characterized niche for adult stem cells1. This segment of the outer root sheath contains a number of different types of stem cells, including epithelial stem cells2, melanocyte stem cells3 and neural crest like stem cells4-7. Hair follicles represent an accessible and rich source for different types of human stem cells. We and others have isolated neural crest stem cells (NCSCs) from human fetal and adult hair follicles4,5. These human stem cells are label-retaining cells and are capable of self-renewal through asymmetric cell division in vitro. They express immature neural crest cell markers but not differentiation markers. Our expression profiling study showed that they share a similar gene expression pattern with murine skin immature neural crest cells. They exhibit clonal multipotency that can give rise to myogenic, melanocytic, and neuronal cell lineages after in vitro clonal single cell culture. Differentiated cells not only acquire lineage-specific markers but also demonstrate appropriate functions in ex vivo conditions. In addition, these NCSCs show differentiation potential toward mesenchymal lineages. Differentiated neuronal cells can persist in mouse brain and retain neuronal differentiation markers. It has been shown that hair follicle derived NCSCs can help nerve regrowth, and they improve motor function in mice transplanted with these stem cells following transecting spinal cord injury8. Furthermore, peripheral nerves have been repaired with stem cell grafts9, and implantation of skin-derived precursor cells adjacent to crushed sciatic nerves has resulted in remyelination10. Therefore, the hair follicle/skin derived NCSCs have already shown promising results for regenerative therapy in preclinical models.
Somatic cell reprogramming to induced pluripotent stem (iPS) cells has shown enormous potential for regenerative medicine. However, there are still many issues with iPS cells, particularly the long term effect of oncogene/virus integration and potential tumorigenicity of pluripotent stem cells have not been adequately addressed. There are still many hurdles to be overcome before iPS cells can be used for regenerative medicine. Whereas the adult stem cells are known to be safe and they have been used clinically for many years, such as bone marrow transplant. Many patients have already benefited from the treatment. Autologous adult stem cells are still preferred cells for transplantation. Therefore, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin/hair follicles are a valuable source for regenerative medicine.

This article presents a robust protocol for isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles.

인간의 모공에서 신경 크레스트 줄기 세포의 분리와 문화

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

전체 마운트 근육 분석에 의한 재현성 마우스 좌골 신경 크러시와 중생의 후속 평가

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. Chimeric avian embryos, in which quail donor tissue is transplanted into a chick embryo in ovo, combine the power of indelible genetic labeling of cell populations with the ease of manipulation presented by the avian embryo.
Quail-chick chimeras are a classical tool for tracing migratory neural crest cells (NCCs)1-3. NCCs are a transient migratory population of cells in the embryo, which originate in the dorsal region of the developing neural tube4. They undergo an epithelial to mesenchymal transition and subsequently migrate to other regions of the embryo, where they differentiate into various cell types including cartilage5-13, melanocytes11,14-20, neurons and glia21-32. NCCs are multipotent, and their ultimate fate is influenced by 1) the region of the neural tube in which they originate along the rostro-caudal axis of the embryo11,33-37, 2) signals from neighboring cells as they migrate38-44, and 3) the microenvironment of their ultimate destination within the embryo45,46. Tracing these cells from their point of origin at the neural tube, to their final position and fate within the embryo, provides important insight into the developmental processes that regulate patterning and organogenesis.
Transplantation of complementary regions of donor neural tube (homotopic grafting) or different regions of donor neural tube (heterotopic grafting) can reveal differences in pre-specification of NCCs along the rostro-caudal axis2,47. This technique can be further adapted to transplant a unilateral compartment of the neural tube, such that one side is derived from donor tissue, and the contralateral side remains unperturbed in the host embryo, yielding an internal control within the same sample2,47. It can also be adapted for transplantation of brain segments in later embryos, after HH10, when the anterior neural tube has closed47.
Here we report techniques for generating quail-chick chimeras via neural tube transplantation, which allow for tracing of migratory NCCs derived from a discrete segment of the neural tube. Species-specific labeling of the donor-derived cells with the quail-specific QCPN antibody48-56 allows the researcher to distinguish donor and host cells at the experimental end point. This technique is straightforward, inexpensive, and has many applications, including fate-mapping, cell lineage tracing, and identifying pre-patterning events along the rostro-caudal axis45. Because of the ease of access to the avian embryo, the quail-chick graft technique may be combined with other manipulations, including but not limited to lens ablation40, injection of inhibitory molecules57,58, or genetic manipulation via electroporation of expression plasmids59-61, to identify the response of particular migratory streams of NCCs to perturbations in the embryo's developmental program. Furthermore, this grafting technique may also be used to generate other interspecific chimeric embryos such as quail-duck chimeras to study NCC contribution to craniofacial morphogenesis, or mouse-chick chimeras to combine the power of mouse genetics with the ease of manipulation of the avian embryo.62

An approach for analyzing migration and eventual fate of avian neural crest cells in quail-chick chimeric embryos is described. This method is a simple and straightforward technique for tracing neural crest cells during migration and differentiation that are otherwise difficult to distinguish within an unmanipulated chick embryo.

크로스 종 이식에 의한 신경 크레스트 마이 그 레이션과 차별화 분석

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of the central nervous system (CNS); namely, astrocytes, oligodendrocytes and neurons. These characteristics make neural stem and progenitor cells an invaluable renewable source of cells for in vitro studies such as drug screening, neurotoxicology and electrophysiology and also for cell replacement therapy in many neurological diseases. In practice, however, heterogeneity of NSC progeny, low production of neurons and oligodendrocytes, and predominance of astrocytes following differentiation limit their clinical applications. Here, we describe a novel methodology for the generation and subsequent purification of immature neurons from murine NSC progeny using fluorescence activated cell sorting (FACS) technology. Using this methodology, a highly enriched neuronal progenitor cell population can be achieved without any noticeable astrocyte and bona fide NSC contamination. The procedure includes differentiation of NSC progeny isolated and expanded from E14 mouse ganglionic eminences using the neurosphere assay, followed by isolation and enrichment of immature neuronal cells based on their physical (size and internal complexity) and fluorescent properties using flow cytometry technology. Overall, it takes 5-7 days to generate neurospheres and 6-8 days to differentiate NSC progeny and isolate highly purified immature neuronal cells.

This video protocol demonstrates a novel method for the generation and subsequent purification of neuronal progenitor cells from a renewable source of neural stem cells (NSCs) based on their physical (size and internal granularity) and fluorescent properties using flow cytometry technology.

Neuroblast 분석 : 유동세포계측법을 사용하여 차별화 신경 줄기 세포에서 자손의 연결 전구 세포의 생성과 강화에 대한 분석

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Co-analysis of Brain Structure and Function using fMRI and Diffusion-weighted Imaging

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when studying the brain, as the functional role that a brain area fulfills may be largely defined by its connections to other brain areas. In this report, we describe a novel, non-invasive approach for relating brain structure and function using magnetic resonance imaging (MRI). This approach, a combination of structural imaging of long-range fiber connections and functional imaging data, is illustrated in two distinct cognitive domains, visual attention and face perception. Structural imaging is performed with diffusion-weighted imaging (DWI) and fiber tractography, which track the diffusion of water molecules along white-matter fiber tracts in the brain (Figure 1). By visualizing these fiber tracts, we are able to investigate the long-range connective architecture of the brain. The results compare favorably with one of the most widely-used techniques in DWI, diffusion tensor imaging (DTI). DTI is unable to resolve complex configurations of fiber tracts, limiting its utility for constructing detailed, anatomically-informed models of brain function. In contrast, our analyses reproduce known neuroanatomy with precision and accuracy. This advantage is partly due to data acquisition procedures: while many DTI protocols measure diffusion in a small number of directions (e.g., 6 or 12), we employ a diffusion spectrum imaging (DSI)1, 2 protocol which assesses diffusion in 257 directions and at a range of magnetic gradient strengths. Moreover, DSI data allow us to use more sophisticated methods for reconstructing acquired data. In two experiments (visual attention and face perception), tractography reveals that co-active areas of the human brain are anatomically connected, supporting extant hypotheses that they form functional networks. DWI allows us to create a "circuit diagram" and reproduce it on an individual-subject basis, for the purpose of monitoring task-relevant brain activity in networks of interest.

We describe a novel approach for simultaneous analysis of brain function and structure using magnetic resonance imaging (MRI). We assess brain structure with high-resolution diffusion-weighted imaging and white-matter fiber tractography. Unlike standard structural MRI, these techniques allow us to directly relate anatomical connectivity to functional properties of brain networks.

fMRI 및 확산 - 가중 영상을 사용하여 뇌의 구조와 기능의 공동 분석

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

배아 Murine 신경 튜브에서 신경 크레스트 세포의 분리 및 문화

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

The discovery of neural stem and progenitor cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult mammalian brain has led to a body of research aimed at utilizing the multipotent and proliferative properties of these cells for the development of neuroregenerative strategies. A critical step for the success of such strategies is the mobilization of NPCs toward a lesion site following exogenous transplantation or to enhance the response of the endogenous precursors that are found in the periventricular region of the CNS. Accordingly, it is essential to understand the mechanisms that promote, guide, and enhance NPC migration. Our work focuses on the utilization of direct current electric fields (dcEFs) to promote and direct NPC migration - a phenomenon known as galvanotaxis. Endogenous physiological electric fields function as critical cues for cell migration during normal development and wound repair. Pharmacological disruption of the trans-neural tube potential in axolotl embryos causes severe developmental malformations1. In the context of wound healing, the rate of repair of wounded cornea is directly correlated with the magnitude of the epithelial wound potential that arises after injury, as shown by pharmacological enhancement or disruption of this dcEF2-3. We have demonstrated that adult subependymal NPCs undergo rapid and directed cathodal migration in vitro when exposed to an externally applied dcEF. In this protocol we describe our lab's techniques for creating a simple and effective galvanotaxis assay for high-resolution, long-term observation of directed cell body translocation (migration) on a single-cell level. This assay would be suitable for investigating the mechanisms that regulate dcEF transduction into cellular motility through the use of transgenic or knockout mice, short interfering RNA, or specific receptor agonists/antagonists.

In this protocol we demonstrate how to construct custom chambers that permit the application of a direct current electric field to enable time-lapse imaging of adult brain derived neural precursor cell translocation during galvanotaxis.

외부 응용 직류 전기 분야에 신경 전구체 세포 마이그레이션 속도론 분석을위한 Galvanotaxis 분석

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...