이 작품은 국방부 부여 PT074620 (SLJ)와 NIH 그랜트 R01NS245014 (SLJ)에 의해 지원되었다.

1. 시약 준비 <ol><li> 해동은 실험 (활성 온난화에 의해 처리 속도를하지 않음)하기 전에 충분한 시간을두고, 젖은 얼음에 Matrigel을 냉동. Matrigel가 밀접하게 세포의 마이 그 레이션에 도움이되는 세포외 기질과 유사한 3D 환경을 구축하는 데 사용됩니다. 이것은 기판과 기계 모두 표시할 수와 세포를 제공합니다. Matrigel은 -20 ° C.에 냉동 저장됩니다 사용하기 전에, 그것이 점차적으로 0-4의 온도까지 가지고 있어야 ° C, 즉이 젖었 얼음이나 냉장고에 해동. Matrigel은 irreversibly 인큐베이션의 온도 (37 ° C)에서 젤 형태로 설정합니다. 따라서 그것은 따뜻한 물에 컨테이너를 immersing하여 해동 속도를하지 않는 것이 좋습니다. </li><li> 단백질 분수는 출생 후의 일 0 (P0) 페렛의 대뇌 피질에서 총 단백질 추출물의 isoelectric 초점 (IEF)에 의해 준비가되어 있습니다. 분리 후, 분수가 조직에 독성 수도 초점 버퍼 성분에서 추출한 청소 20mM 트리스 - HCL pH7.2에 대한 하룻밤 dialyzed 있습니다. </li><li> 대뇌 피질에서 추출된 단백질 전달 시스템입니다. 단백질은 다음 천천히 형광 기능 microspheres의 영상 처리에 도움의 사이트에서도 최소한 spillovers 쉽게 검출을 허용 것을 발견 environment.We에 단백질을 출시 형광 라텍스 구슬에 adsorbed 아르 형광 현미경으로 관찰 구슬 예금. <ol class="lalpha"><li> 단백질 용액 100 - 200μl에 형광 구슬의 10μl를 추가 </li><li> 흔드는에서 RT에 어둠 속에서 30 분 대한 부화 </li><li> 최대 속도로 1 시간을위한 벤치의 원심 분리기에서 비즈를 스핀 다운 </li><li> 뜨는 제거 </li><li> 신선한 매체의 10μl를 사용하여 소용돌이에 다시 중지 </li><li> 중지 Matrigel의 30μl를 추가, 잘 믹스하고 얼음에 놓으십시오. </li></ol></li><li> 버퍼와 미디어 <ol><li> 인공 뇌척수를 (; NaCl 124mM, NaHCO 3 26mM, 아니 2 PO 4 1.2mM, 3.2mM KCl, MgSO 4 1.2mM, CaCl 2 2.4mM, 10mM 포도당 aCSF) 준비하고 여과 - 소독. 미리 aCSF을 슬러쉬 - 동결, 그래서 그것이 조직 해부의 시간에 준비가되지.하려면, -80 ° C의 냉동고에 살균 aCSF 가득한 플라스틱 플라스크를 놓으십시오. 그래서 얼음 층 벽 안쪽에 빌드 때, 그것을 휴식하고 유체와 혼합, 자주마다 냉동 모니터링합니다. 술병은 대부분 얼음 윤활유를 포함 때까지 반복합니다. 버퍼뿐만 아니라 조직의 생존을 지원하는이 방법을 준비하지만, 낮은 온도가 더 이상 인정할 것이다 게다가, 청키 얼음 조각보다는 조직에 기계적으로 덜 유해합니다. </li><li> N - 2, B - 27 보충은 제조 업체의 제안뿐만 아니라 1mg/100ml gentamycin, 2 MM L - 글루타민, 및 0.6 % 포도당에 따라 추가되었습니다.들과 Neurobasal 매체를 준비 0.22μm 세포막을 통해 여과하여 소독. 37 보온 ° C를 사용까지. </li></ol></li><li> 문화 플레이트 <ol class="lalpha"><li> 문화 학년 플라스틱 여섯 잘 플레이트는 20μl 피펫 팁을 사용하여 감기 Matrigel 소량 (2μl에 대한)를 중심으로 각 우물을 dotting, 각 드롭 autoclaved 라운드 18mm 유리 coverslip을 배치 준비가되어 있습니다. 나도 접시이나 coverslips 달리 문화가 대접 필요가 없습니다. </li></ol></li></ol> 2. 조직 준비 <ol><li> 뇌 조직을 구하기 <ol class="lalpha"><li> 깊이 Euthasol과 동물을 anesthetizing 후, 머리를 제거하고 얼음처럼 차가운 aCSF에 배치 </li><li> 메스로 반구를 분리하고 얼음처럼 차가운 aCSF을 포함하는 작은 그릇에 조각을 수집, 선택의 장치를 사용하여 500μm에서 coronally 슬라이스 </li></ol></li><li> 만들기 explants (해부 현미경을 사용) <ol class="a"><li> GE를 통해 내면 추가 단계를 방해할 수 있습니다 ganglionic eminences (GE)과 피질의 트림 지역을 포함하는 조각을 식별 </li><li> GE의 심실 표면에 가까운 지역에 구멍 해리스 유니 코어를 눌러 주로 심실 영역을 포함하는 핵심을 접어야하고 얼음처럼 차가운 매체 (Fig.1)에 플런저로 추방. 0.5의 서너 explants가 mm 직경은 단일 P0 페렛 뇌 슬라이스에 GE에서 할 수 있습니다. 설치류와 기가 실려 모두에서, 중간과 측면 릿지이 나이에 융합되는 유의하시기 바랍니다. 코어 통에 숙박이나 음식의 플라스틱 바닥에 붙어있다면, 차가운 Neurobasal 매체를 포함하는 그릇에 피펫과 피펫 팁 및 전달 aCSF를 squirting하여 동원. 서부 유럽 표준시 얼음 접시 보관하십시오. </li><li> explants가 완전히 잠겨와 거품을 피하게 할 간병, 별도의 접시에 배치 얼음처럼 차가운 Matrigel의 큰 드롭 (0.25 - 0.5ml 정도)로 매체에서 explants의 배치를 전송합니다. 서부 유럽 표준시 얼음 접시 보관하십시오. 배치의 크기는 워크플로우 하류의 속도에 따라 달라집니다. </li></ol></li></ol> 3. 문화 설치 (해부 현미경을 사용) <ol><li> 항상 경화를 방지하기 위해 Matrigel 얼음에 Matrigel 함유 믹스를 유지. </li><li> 리믹스 비드 정지 장소 이전에 잘 20μl 피펫 팁을 사용하여 문화 접시에 놓인 유리 coverslip의 중심에 얼음처럼 차가운 Matrigel에 비드 정지 1 - 2μl 이하. 조금을 설정하자 건조하지 마십시오. </li><li> 20μl 피펫 팁을 사용하면 Matrigel 드롭에서 2 explants를 선택하고 반대편에 대칭 (떨어진 보증금의 가장자리에서 1mm 이상) 비드 보증금을 원하는 주변에서 그들을 놓으십시오. 는 상온에서 5 분 이상 더 이상을 설정하자. 단계의 오른쪽시기가 B와 C가 중요합니다. 시간이 너무 짧은 경우에는 그것은 그들이 Matrigel의 최종 층으로 덮여있을 때 이동 문화 설치의 불완전 겔화 및 부품으로 이어질 것이며 시간이 너무 긴 경우 그것은의 젤과 창조 이상의 건조가 발생할 수 있습니다 세포의 자유로운 움직임을 방해 물리적인 장벽. </li><li> explants (Fig.2) 이상을 확대, Matrigel의 30μl 약 평면 레이어로 비즈와 explant 표지. 약 15 분 동안은 인큐베이터에서 설정하자. </li><li> 보조제와 함께 Neurobasal 매체의 2ml를 추가합니다. </li><li> 매일 37 ° C 5 % CO 2 / 95% O 2 모니터링 철새 활동 품어. </li></ol> 4. 라이브 영상 <ol><li> 3-4일에 대한 부화 후, 문화 접시를 검토하고 관심 coverslips를 선택합니다. explants은 세포의 반경 유니폼 구름을 생성한다. 라이브 영상에 사용될 수있는 새로운 문화 접시에 선택한 coverslips를 교체하십시오. </li><li> coverslips 밤 동안 새 접시에 앉아 보자. 이미징을위한 현미경의 번호판을 배치하기 전에, 세포 배양 후드에 coverslip 및 세포 배양 플레이트 사이의 수집에 microbubbles을 공개하기 위해 coverslip을 이동하는 살균 주걱을 사용합니다. 거품의 간섭은 이미지를 망치는 것입니다. 잘의 중심에 coverslips 이동합니다. </li><li> 증발을 방지하기 위해 물을 우물 사이의 공간을 채우십시오. </li><li> 우물의 중심에서 coverslips를 이동하지 않도록으로 세포 배양 후드에서 현미경으로 접시를 주의깊게 전송합니다. </li><li> 이미징 소프트웨어를 사용하여 이미지 방식을 정의합니다. 문화 설정의 3D 특성으로 인해 세포가도 수직으로 이동, 따라서 그것은 이주 구름의 전체 깊이를 포함한 Z - 비행기를 수집하는 것이 중요합니다. 몇 군데 지역의 XY 범위는 또한 상대 explant의 각도 방향 및 마이 그 레이션하는 세포를 기록, 녹음의 과정에서 마이 그 레이션 세포에 의해 채워진 것으로 예측된 영역을 커버하고 위해 비드 보증금을 포함할 정도로 큰 설정해야합니다 단백질의 소스. 또한 더 군데 Z의 비행기, 또는 더 많은 지역, 그건 샘플 및 세포 추적의 시간적 해상도의 손실 사이의 긴 시간 간격을 강요, 특정 시점에서 사이클을 기록하는 데 걸리는 시간을 더 적용되는 고려하십시오. 우리의 경우에는 10 배 목표를 사용하여 최적의 계획은 10 각각의 Z - 비행기 30 분 간격으로 모든 20μm를 간격을위한 3x3 타일 녹음했습니다. 우리는 30 분 간격으로 자신들의 움직임에 안정적인 추적을위한 중요 연속 시간 지점에서 세포의 애매하지 않은 신분을 허용하는 가장 긴을 발견했습니다. </li><li> 시간 경과 이미징을 시작합니다. </li><li> 원하는 시간 후, 접시를 제거하고 4퍼센트 인산염 버퍼 paraformaldehyde의 문화를 해결할 수 있습니다. 그것은 더 형태학의와 immunocytochemical 분석을 위해 사용될 수 있습니다. </li></ol> 5. 운동의 분석 <ol><li> 추가 처리를위한 가장 편리한 형식, TIFF는 가장 휴대용으로 하나되는 이미지의 기록 시간 시리즈를 변환합니다. </li><li> 녹음 XY 좌표에 의해 시간이 지남에 따라 개별 세포의 움직임을 추적합니다.이 매뉴얼 추적 플러그인, 또는 ImagePro, Volicity 또는 AutoQuant 같은 다른 상업적인 응용 프로그램과 함께 ImageJ (NIH)과 같은 자유롭게 사용할 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있습니다. </li><li> Excel 또는 자체 개발한 소프트웨어를 사용하여 트랙을 플롯. </li><li> 각 추적 세포는 같은 평균 속도, 경로의 곡률, 시간이 지남에 따라 방향 다양성, 분기, 단백질의 원천 대한 편차로 운동 매개 변수를 계산에 대한 등 계산은 MS Excel 또는 이와 동등한 스프레드 시트에서 할 수 있습니다. 그들은 그보다 더 정교한 분석 방법을보다 유연 사용자 정의 및 포함을 허용으로 우리의 경험, 그것이 사내 스크립트를 (R, Matlab, 파이썬, 펄 혹은 다른 주로 오픈 소스 언어를 사용) 개발 훨씬 더 생산적는 것을 나타냅니다 엑셀의 기본 설치 가능합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 해부 학적 origi의 다이어그램N explants니다. 이것은 hemisected 페렛 두뇌의 코로나 조각의 그림입니다. 회색 동그라미 explants을 찍은하는 지역을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 문화 설치 프로그램의 다이어그램. 비드 보증금 단백질의 원천이며 explants가 양쪽에 위치하고 있으며 모든 요소가 Matrigel 덮여있다. <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. quadrants (비드 보증금 방향 화살표 지점)에 의해 색깔 세포 트랙에 해당 플롯. 오른쪽에 셀 트랙 세포를 유치하기 위해 나타나는 분수 D, 대한 마이 그 레이션되며 왼쪽에있는 세포가 마이 그 레이션 세포를 격퇴하기 위해 나타나는 분수 방면 마이 그 레이션됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig4.jpg" alt="그림 4"/> 그림 4. explant 밖으로 마이 그 레이션하는 세포의 성장을 보여주는 구름 선택한 timepoints에서 이미지의) 일련의. (스케일 바 200μm) 아래에 표시로 화살표로 표시 예제 세포는, 시간을 통해 추적할 수 있습니다. 이 explant은 38 H. 삶의 이미지와 함께 시각했습니다 . B) 세포는 시간이 표시된 부분에 표시된 최종 이미지로 이미지를 기록 처음부터 explant 떠나 세포의 이미지가 여기에 표시됩니다. 세포는 반복 분기 (스케일 바 50μm)을 보여줍니다.

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동물을 사용 : 동물과 관련된 모든 절차 USUHS와 NIH 기관 지침에 따라 수행하고 USUHS IACUC 승인되었습니다.

여기 우리가 화학 신호에 대한 응답으로 신경 세포의 철새 행동을 연구하고 분석하는 간단한 시스템을 제시한다. 체외 마이 그 레이션 assays에서 세포의 운동에 영향을 미치는 세포 분자를 식별하는 데 사용되었습니다. 우리의 패러다임은 공부를 각각의 세포 상호 작용에있는 3 차원 (3D) 환경을 보장합니다. . 그것은 세포외 기질 (예 : Hirschberg 외 &#39;10과 상호 작용함으로써 찾아볼 수없는, 폴리 - D - 라이신 - 코팅 coverslip의 평평한 표면에 이동하도록 강요 아르 세포 explants 밖으로 마이 그 레이션 문화에 비해 상당한 장점이다; 8. Métin 외. &#39;07). 세포가 세로 가로 자유에 비해 바닥에 유리 coverslip 상대적으로 얇은입니다 Matrigel의 상단 표면 사이의 공간에 제약이 있으므로 그러나 추적 마이 그 레이션하는 세포의 큰 규모에 관하여는, 2 차원 유지 마이 그 레이션. 이러한 설정은 여전히​​ 본질적으로 2 차원 운동의 유적 쉽게 분석을 위해 수 있습니다. . 마티니 동부 표준시, 콜라겐이나 Matrigel에 포함된 GE 세포의 GE의 explants하거나 다시 집계 구성된 비슷한 3D 패러다임은 이전에 화학 신호의 소스 (예 : Liodis 외 &#39;07로서 특정 신호 단백질을 표현하는 세포의 집계를 사용하여 고용했다 .. 알 &#39;09,. Nóbrega - 페레 외 &#39;08; Wichterle 외 &#39;03).. 여기서 제시하는 방법은 시스템이 특히 적합, 단백질은 매체에 직접 추가보다 높은 지역 환경에 지속적인 수준에 대해 허용을 준수 단백질과 라텍스 구슬의 형태로 속도가 느린 릴리스 시스템을 사용하면 사용 가능한 양을 단백질은 단백질의 복잡한 혼합물이 테스트 때 제한이나됩니다. 구슬의 선택은 라텍스 기반 제품에 한정하고, 또한 다른 재료, 예를 들어, 아가로 오스 비즈, 다양한 특성과 각각 포함되지 않습니다. 추가 분석의 밀도를 증가하기 위해, 우리는 반대편에있는 비즈 입금 apposed이 explants를 사용합니다. 원산지의 특정 영역을 보장하기 위해, 우리는 세포의 소스로 ganglionic 에미넨스 explants를 사용했습니다. 우리는 ganglionic 예하의 중간과 측면 부분의 차이를 평가하지만, 어떤 차이를 보지 못했어요. 우리는이 연구가 기가 실려을 사용하는 지적한다,이 종류에있는 중간과 측면 ganglionic eminences은 (. Poluch 외 &#39;08) 설치류보다 이전 퓨즈. 문화가 만들어진 시간 (P0)의 중간과 측면 ganglionic eminences는 네크로 텍스 채우지 많은 세포가 여전히 발생하고 마이 그 레이션되고있다하더라도, 융합되었다. 세포의 진정한 동질적인 소스가 선호하는 경우 그러나, 세포 현탁액은 해부 조직에서 준비할 수 있으며, 직접 Matrigel과 혼합하거나, 또는 아래로 돌다 결과 펠렛은 &#39;explants&#39;을 만들어 냈어. proteolytic 활동도 잔여 흔적이 실험의 과정을 통해 Matrigel 녹일 수에 대한 세포 현탁액을 준비하는 효소 조직 소화의 사용은 낙담이다. 또한, 실사는 문화 설치의 타이밍에 적용되어야합니다. Matrigel은 온난 기간은 건조 공기 원인과 마이 그 레이션 세포로 꿰뚫을 수 있으며, 지울 수없는 쉘에있는 결과에 Matrigel의 작은 방울의 노출 (이 프로토콜에서 사용되는)의도 약간 연장 기간을 중합하기 위해 필요하지만 신선한 Matrigel과 후속 취재하여.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </td><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> Neurobasal 중간 (1X), 액체 </td><td> Invitrogen </td><td> 21103-049 </td><td></td></tr><tr><td> N - 2 보충 (100X), 액체 </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td></td></tr><tr><td> B - 27 보충 (50X) </td><td> Invitrogen </td><td> 0080085 - SA </td><td></td></tr><tr><td> BD Matrigel의 지하 막 매트릭스 </td><td> BD Biosciences </td><td> 354234 </td><td></td></tr><tr><td> 해리스 유니 코어, 0.5mm 크기 </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 69036-05 </td><td> 펀치 구멍 </td></tr><tr><td> 그린 Retrobeads IX </td><td> Lumafluor 주식 회사 </td><td></td><td> 라텍스 microspheres </td></tr></tbody></table>

migratory behavior of cells generated in ganglionic eminence cultures

세포의 마이 그 레이션은 척추 중추 신경계의 발달과 성숙 (헤튼, 99)에 연결 일반적인 과정이다. 흥분성의 억제와 : 대뇌 피질은 두 가지 기본 유형의 연결로 구성되어 있습니다. 이러한 세포는 뚜렷한 지역에서 발생하고 다른 노선 (Pearlman 외., 98)을 따라 피질로 마이 그 레이션. 억제 interneurons 대부분은 ganglionic eminences (.; 쑤 외, &#39;04. Gelman 외, &#39;09)의 여러 지역에서 tangentially subcortical 소스로부터 마이 그 레이션. (; 헤튼, &#39;90 년, Rakic​​, &#39;90 년 카비 &amp; Rakic​​, 78) 그들의 운동은 대뇌 피질에 적절한 cytoarchitecture 및 연결의 설립 수 있도록, 환경 신호에 의해 부과된 정확한 spatiotemporal 컨트롤이 필요합니다. 체외에서 신생아 기가 실려에 ganglionic eminences (GE)의 proliferative 영역에서 생성된 세포의 철새 동작을 연구하기 위해 우리는 BD Matrigel 매트릭스의 3 차원 문화 배치를 사용했습니다. 문화 설치 두 GE의 explants 및 대뇌 피질에서 추출하고 explants (.; 리들 외, 97. 외를 Hasling, &#39;03) 사이에 위치 형광 라텍스 Retrobeads IX에 adsorbed 테스트 단백질의 소스로 구성되어. 문화로부터 2-3 일 후에, 세포는 요골 방향으로 조직을 떠날 성향을 보여주는 explant의 가장자리에 나타나는 시작합니다. 라이브 영상은 세포를 라벨링 또는 마킹의 필요성없이 철새 패턴의 관찰을 허용했다. isochronic 페렛 피질에서 얻은 추출물 단백질의 분수에 노출되면, GE 세포는 각 세포의 이동 정량 분석​​ 운동에 의해 판단으로 다른 동작을 표시합니다.

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Migratory Behavior of Cells Generated in Ganglionic Eminence Cultures

3D 조직 문화의 시간 저속 영상은 대뇌 피질에서 fractionated 단백질 추출에 대한 반응으로 ganglionic 예하에서 발생하는 각각의 세포의 철새 행동을 공부하고 있습니다.

Ganglionic 에미넨스 문화에서 생성된 세포의 철새 행동

Migration of cells is a common process that leads to the development and maturation of the vertebrate central nervous system (Hatten, '99). The cerebral ...

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JoVE Journal

Neuroscience

9.9K 조회수.  Uniformed Services University. 3D 조직 문화의 시간 저속 영상은 대뇌 피질에서 fractionated 단백질 추출에 대한 반응으로 ganglionic 예하에서 발생하는 각각의 세포의 철새 행동을 공부하고 있습니다.

비디오: Migratory Behavior of Cells Generated in Ganglionic Eminence Cultures

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

곤충의 단일 Sensillum 레코딩 Drosophila melanogaster과 아노 펠 레스 gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

연구

신경과학

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly enriched neuronal cultures. For this protocol the freezing medium used is 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) diluted in Hank's Buffered Salt Solution (HBSS). Blocks of cortical tissue are transferred to cryovials containing the freezing medium and slowly frozen at -1&deg;C/min in a rate-controlled freezing container. Post-thaw processing and dissociation of frozen tissue blocks consistently produced neuronal-enriched cultures which exhibited rapid neuritic growth during the first 5 days in culture and significant expansion of the neuronal network within 10 days. Immunocytochemical staining with the astrocytic marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the neuronal marker beta-tubulin class III, revealed high numbers of neurons and astrocytes in the cultures. Generation of neural precursor cell cultures after tissue block dissociation resulted in rapidly expanding neurospheres, which produced large numbers of neurons and astrocytes under differentiating conditions. This simple cryopreservation protocol allows for the rapid, efficient, and inexpensive preservation of cortical brain tissue blocks, which grants increased flexibility for later generation of neuronal, astrocyte, and neuronal precursor cell cultures.

Here, we describe a method for efficient cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly enriched neuronal cultures. This simple protocol provides flexibility for later generation of neuronal, astrocyte, and neuronal precursor cell cultures.

고도의 연결을 강화 문화의 생성을위한 두피 조직 블록의 Cryopreservation

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

손상의 감각 오르간 전구체 세포 라이브 셀 이미징 Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

의 이스케이프 문제의 Optogenetic의 자극<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling of auditory axons within the VIIIth cranial nerve would enhance the study of central auditory circuit development. This approach is challenging because multiple sensory organs of the inner ear contribute to the VIIIth nerve 1. Moreover, markers that reliably distinguish auditory versus vestibular groups of axons within the avian VIIIth nerve have yet to be identified. Auditory and vestibular pathways cannot be distinguished functionally in early embryos, as sensory-evoked responses are not present before the circuits are formed. Centrally projecting VIIIth nerve axons have been traced in some studies, but auditory axon labeling was accompanied by labeling from other VIIIth nerve components 2,3. Here, we describe a method for anterograde tracing from the acoustic ganglion to selectively label auditory axons within the developing VIIIth nerve. First, after partial dissection of the anterior cephalic region of an 8-day chick embryo immersed in oxygenated artificial cerebrospinal fluid, the cochlear duct is identified by anatomical landmarks. Next, a fine pulled glass micropipette is positioned to inject a small amount of rhodamine dextran amine into the duct and adjacent deep region where the acoustic ganglion cells are located. Within thirty minutes following the injection, auditory axons are traced centrally into the hindbrain and can later be visualized following histologic preparation. This method provides a useful tool for developmental studies of peripheral to central auditory circuit formation.

Here we describe a microdissection technique followed by fluorescent dye injection into the acoustic ganglion of early chick embryos for selective tracing of auditory axon fibers in the nerve and hindbrain.

조류 배아 Vestibulocochlear 신경 청각 섬유의 선택적 추적

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

종의 척추 상공 회의소를 주입하는 절차<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 척수의 영상

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Assays to Detect UV-reflecting Structures and Determine their Importance in Mate Preference using the Sailfin Molly Poecilia latipinna

Many organisms use cues and signals beyond human sensitivity during social interactions. It is important to take into account how organisms perceive their worlds when trying to understand their behavior and ecology. Sensitivity to the ultraviolet spectrum (UV; 300 - 400 nm) is found across multiple genera of birds, fish, reptiles, amphibians, and even mammals. This protocol describes a technique for examining organisms for the presence of UV-reflecting structures and a method for testing whether these cues are used as social signals in the context of mate choice. A spectrophotometer is used to detect the presence of UV reflectance and variation in reflective intensity between individuals and sexes. An example of this technique is presented in which a dichotomous mate choice test exposes sexually receptive individuals to opposite sex individuals whose visual appearance can be manipulated by filters that either transmit full spectrum or block UV wavelengths. This system allowed for the determination that female, but not male, sailfin mollies (Poecilia latipinna) were using UV markings as part of their mating decisions. These types of studies serve to expand our knowledge of the range of organisms that utilize UV and provide insight into how UV plays a role in their lives.

Assays to Detect UV-reflecting Structures and Determine their Importance in Mate Preference using the Sailfin Molly Poecilia latipinna

This protocol outlines the use of spectrophotometry to detect ultraviolet-reflecting structures on organisms (in this example, the sailfin molly Poecilia latipinna) and describes dichotomous choice tests for fish that allow inferences to be made on the role of ultraviolet cues during mate selection.

분석은 UV 반사 구조를 검색 및 SailFin을 몰리를 사용하여 메이트 환경 설정에서 자신의 중요성을 확인하는 방법<em&gt; Poecilia latipinna</em

Many organisms use cues and signals beyond human sensitivity during social interactions. It is important to take into account how organisms perceive their ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

초파리 멜라노가스터에서 학습 유발 시냅스 가소성의 생체 내 광학 칼슘 이미징

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Measuring and Manipulating Functionally Specific Neural Pathways in the Human Motor System with Transcranial Magnetic Stimulation

Understanding interactions between brain areas is important for the study of goal-directed behavior. Functional neuroimaging of brain connectivity has provided important insights into fundamental processes of the brain like cognition, learning, and motor control. However, this approach cannot provide causal evidence for the involvement of brain areas of interest. Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a powerful, noninvasive tool for studying the human brain that can overcome this limitation by transiently modifying brain activity. Here, we highlight recent advances using a paired-pulse, dual-site TMS method with two coils that causally probes cortico-cortical interactions in the human motor system during different task contexts. Additionally, we describe a dual-site TMS protocol based on cortical paired associative stimulation (cPAS) that transiently enhances synaptic efficiency in two interconnected brain areas by applying repeated pairs of cortical stimuli with two coils. These methods can provide a better understanding of the mechanisms underlying cognitive-motor function as well as a new perspective on manipulating specific neural pathways in a targeted fashion to modulate brain circuits and improve behavior. This approach may prove to be an effective tool to develop more sophisticated models of brain-behavior relations and improve diagnosis and treatment of many neurological and psychiatric disorders.

This article describes new approaches to measure and strengthen functionally specific neural pathways with transcranial magnetic stimulation. These advanced noninvasive brain stimulation methodologies can provide new opportunities for the understanding of brain-behavior relations and development of new therapies to treat brain disorders.

경두개 자기 자극을 통해 인간 모터 시스템의 기능적으로 특정신경 경로 측정 및 조작

Understanding interactions between brain areas is important for the study of goal-directed behavior. Functional neuroimaging of brain connectivity has ...

Combining Behavior and EEG to Study the Effects of Mindfulness Meditation on Episodic Memory

Although there has been recent interest in how mindfulness meditation can affect episodic memory as well as brain structure and function, no study has examined the behavioral and neural effects of mindfulness meditation on episodic memory. Here we present a protocol that combines mindfulness meditation training, an episodic memory task, and EEG to examine how mindfulness meditation changes behavioral performance and the neural correlates of episodic memory. Subjects in a mindfulness meditation experimental group were compared to a waitlist control group. Subjects in the mindfulness meditation experimental group spent four weeks training and practicing mindfulness meditation. Mindfulness was measured before and after training using the Five Facet Mindfulness Questionnaire (FFMQ). Episodic memory was measured before and after training using a source recognition task. During the retrieval phase of the source recognition task, EEG was recorded. The results showed that mindfulness, source recognition behavioral performance, and EEG theta power in right frontal and left parietal channels increased following mindfulness meditation training. In addition, increases in mindfulness correlated with increases in theta power in right frontal channels. Therefore, results obtained from combining mindfulness meditation training, an episodic memory task, and EEG reveal the behavioral and neural effects of mindfulness meditation on episodic memory.

Here we present a protocol for combining mindfulness meditation training, an episodic memory task, and EEG to understand the behavioral and neural effects of mindfulness meditation on episodic memory.

행동과 EEG를 결합하여 마음 챙김 명상이 에피소드 기억에 미치는 영향 연구

Although there has been recent interest in how mindfulness meditation can affect episodic memory as well as brain structure and function, no study has ...