신경 볏 세포는 배아의 두개골 신경 주름에서 또는 배양에 배치 될 때 이동합니다. 이것은 세포 해리없이 1 차 이동 신경 볏 세포를 분리하는 편리한 방법을 제공합니다. 신경 볏 이동은 일반적으로 3차원 배아 환경 내에서 발생하지만 2차원 배양은 이동 관련 프로세스의 시각화 및 조사를 가능하게 합니다.
두개신경구 배양 프로토콜이 존재하지만 이 방법에는 훈련 및 유기체별 단계가 필요합니다. 이 비디오는 병아리 두개골 신경 접힘 배양의 재현 가능한 준비를 용이하게하는 기술을 보여줍니다. 초보자는 종종 신경 주름을 해부 및 도금하고 문화 결과를 평가하는 데 어려움을 겪습니다.
해부 지침을 따르고 여기에 설명된 형태 측정 분석을 적용하면 일관되고 정량적인 결과를 얻을 수 있습니다. 시작하려면 수정란을 섭씨 38도의 가습 인큐베이터 안에 똑바로 세웁니다. 인큐베이터에서 알을 꺼낸 후 70 % 에탄올을 완전히 뿌리고 건조시켜 껍질을 소독하십시오.
배양물을 고정 및 염색하기 위해, 유리 커버 슬립을 사용하여 멀티웰 조직 배양 접시에 넣고, 웰의 바닥을 덮기에 충분한 피펫 피펫 용액을 사용한다. 다음으로, 뚜껑을 교체하고, 신경 주름을 해부하면서 적어도 1 시간 동안 섭씨 38 도의 가습 인큐베이터에서 피브로넥틴 용액으로 플레이트를 배양한다. 무딘 집게를 사용하여 달걀 길이의 1/4에서 1/3로 껍질에 작은 구멍을 뚫습니다.
무딘 집게를 작은 구멍에 조심스럽게 삽입하여 노른자를 방해하지 않도록하십시오. 그런 다음 달걀 주위의 달걀 껍질을 자르고 달걀 껍질의 상단을 제거한 다음 분리를 위해 배아를 배치합니다. 닫힌 무딘 집게의 평평한 가장자리를 사용하여 배아를 덮고 있는 노른자 표면의 과도한 알부민을 닦아내어 배아를 준비합니다.
집게를 사용하여 배아 위에 여과지 지지 프레임을 놓고 배아는 프레임 창에 놓습니다. 노른자에 부착되도록 여과지를 부드럽게 누릅니다. 해부 가위로 여과지 프레임 외부를 자릅니다.
집게나 가위 끝을 사용하여 프레임의 가장자리를 잡고 배아를 노른자에서 부드럽게 들어 올립니다. 종이 프레임이 아래로 향하도록 배아를 펜 스트렙이 있는 링거로 채워진 60 또는 100밀리리터 페트리 접시에 넣습니다. RNA 또는 단백질에 민감한 다운스트림 적용을 위해 배아를 수집하는 경우 배아 접시를 얼음 위에 보관하십시오.
배아를 Ringer의 펜 - 연쇄상 구균 용액이 들어있는 깨끗한 접시에 옮깁니다. 배아를 앞뒤로 부드럽게 헹구어 시야를 가리는 노른자를 제거하고 링거의 펜 스트렙 용액을 교환하거나 흐려지면 신선한 접시에 옮깁니다. 해부 현미경 아래에서 배아 등쪽과 프레임 쪽이 위로 향하도록 배치합니다.
배아를 종이 프레임에 놓아 스트레칭을 유지하고 제자리에 고정하십시오. 그런 다음 집게를 사용하여 신경 주름을 노출시켜 vitelline 막을 제거합니다. 확장하는 시신경 소포에 조직 꼬리를 포함하고 마름모꼴 수축이 막 나타나기 시작한 뒷뇌에 주둥이를 포함합니다.
봄 가위를 사용하여 중뇌 신경 주름을 조심스럽게 절제하십시오. 신경관과 비신경성 외배엽의 오염을 최소화하면서 신경구의 등쪽 최측면을 절제하고 P20 피펫터 또는 노른자 링거의 펜-연쇄상 구균 용액으로 헹군 멸균 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 링거의 펜-스트렙 용액이 들어 있는 깨끗한 접시에 신경 주름을 옮깁니다. 추가 주름을 해부하면서 수집 된 주름을 얼음에 보관하십시오.
인큐베이터에서 배양 접시를 꺼낸 후 피펫터 또는 파스퇴르 피펫을 사용하여 커버 슬립, 접시 또는 웰에서 피브로넥틴 용액을 제거합니다. 피브로넥틴으로 코팅된 기질을 링거스 펜-스트렙 용액으로 헹군 후, 적절한 양의 완전한 배양 배지를 접시 또는 웰에 첨가한다. 플라스틱을 막고 티슈가 달라붙는 것을 방지하려면 P20 또는 P200 피펫터를 사용하고 노른자 링거의 펜 스트렙 용액으로 피펫 팁을 헹굽니다.
그런 다음 분리된 신경 주름을 피브로넥틴으로 코팅된 커버 슬립의 중앙으로 옮기고 가능한 한 적은 Ringer의 펜-스트렙 용액을 옮기도록 주의하십시오. 체외이식편을 10 내지 15분 동안 가라앉힌 후, 도금된 신경 주름이 있는 배양 접시를 천천히 조심스럽게 운반하여 섭씨 38도의 가습 챔버에 넣는다. 파스퇴르 피펫으로 배양 배지를 제거하고 필터 멸균 PBS로 웰을 헹굽니다.
4% 파라포름알데히드를 추가하고 실온에서 15분 동안 플랫폼 셰이커에 보관하십시오. 배양이 끝나면 파라포름알데히드를 제거하고 PBS로 웰을 3회 헹구고 5% 혈청을 포함하는 PBST를 추가합니다. 이제 30 마이크로리터의 200-나노몰 오레곤 그린 컨쥬게이트된 팔로이딘을 각 커버 슬립에 대해 매끄러운 표면에 피펫팅합니다.
한 쌍의 집게를 사용하여 5% 혈청이 포함된 PBST에서 덮개 슬립을 제거하여 세포의 방향이 위쪽을 향하도록 합니다. 커버 슬립의 가장자리를 섬세한 작업 와이퍼에 짧게 대어 과도한 액체를 제거합니다. 각 커버 슬립 셀 쪽을 아래로 향하게 희석된 팔로이딘 방울에 부드럽게 놓고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
배양 기간 후, 염색 용액에서 커버 슬립을 들어 올려 배양 접시에 다시 넣고 세포 면이 위로 오도록 뒤집습니다. 커버 슬립을 PBST로 덮고 플랫폼 셰이커에 10분 동안 놓고 커버 슬립을 덮고 어두운 곳에 두십시오. PBST를 제거하고 커버 슬립을 두 번 반복하여 총 10분 세척을 3회 반복합니다.
현미경 슬라이드에 장착 미디어 한 방울을 놓습니다. 기포가 생기지 않도록 장착 용지 위에 덮개 슬립을 비스듬히 천천히 내리고 이미징하기 전에 용지가 굳도록 하여 덮개 슬립 셀 면이 아래로 향하도록 합니다. 마지막으로 염색된 세포를 이미지화하고 TIFF 파일로 내보냅니다.
신경 볏 세포는 배양 후 3-4 시간 이내에 부착 된 신경 폴드 외식편에서 나오기 시작했으며 약 20 시간 후에 이동이 완료되었습니다. 이동 신경 볏 세포는 HNK-1을 사용하여 표지되었으며 대부분의 세포는 HNK-1 양성인 것으로 나타났습니다. 이동된 신경 볏 세포는 필라멘트 액틴을 팔로이딘으로 염색하여 시각화했습니다.
팔로이딘으로 염색된 세포의 이미지는 ImageJ를 사용하여 처리되어 세포가 흰색 배경의 검은색으로 나타나는 임계값 이미지를 생성했습니다. 임계 이미지를 분석하고 다양한 측정 값을 대조되는 막대 그래프 또는 바이올린 플롯으로 표시했습니다. 예를 들어, 분석 된 69 개의 세포의 평균 면적은 대략 802.11 평방 마이크로 미터였으며, 60.27에서 2, 664.53 평방 마이크로 미터 범위였다.
원형도는 세포의 돌출성을 반영하며 범위는 0.101에서 0.875입니다. 낮은 값은 길쭉한 모양을 나타내고 값 1은 완벽한 원을 나타냅니다. 대부분의 세포는 바이올린 플롯에서 가장 쉽게 볼 수있는 길쭉한 모양을 나타 냈습니다.
이 분야의 이동 신경 볏 세포는 평균 종횡비가 약 2.13이고 종횡비가 1이면 대칭 모양을 나타냅니다. 신중한 절제와 체외이식편 도금은 성공적인 배양에 매우 중요합니다. 신경 주름이 잘린 면이 아래로 향하도록 10-15분 동안 그대로 둔 다음 천천히 인큐베이터로 옮겨 접착을 촉진합니다.
이러한 기술의 변형에는 배양 전 일시적인 유전자 조작과 배양 중 타임 랩스 이미징이 포함됩니다. 또한 이 프로토콜을 사용하면 omics 수준 분석을 위해 이동 전 및 이동 신경 볏 세포 집단을 수집할 수 있습니다.
