이 잘 정의된 프로토콜은 포유류의 1차 신경 문장 이동을 살펴봅니다. 우리는 신경 문장에 영향을 미치는 출생 결함을 연구하기 위하여 1 차적인 신경 문장 이주를 이용합니다. 이 접근은 신경 판에서 나올 때 신경 문장 세포를 자세히 살펴볼 수 있습니다.
돌연변이 유전자 매력을 운반하는 조직에서 세포 행동에 대한 테스트 또는 약제 치료 후, 배아 발달 중 약물 치료 또는 환경 변화의 효과에 대한 건강 검진을 허용합니다. 유사한 접근은 심혼 또는 창자에 이동하는 신경 문장 세포를 공부하거나 전이성 종양 세포를 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다. 배아 권리의 해부학을 추측하는 것은 도전이다.
그것의 조직은 초기 발달 도중 아주 급속하게 변화합니다. 우리는 큰 실험을 착수하기 전에 미세 절제술을 연습하는 것이 좋습니다. 배아는 살아 있고 3차원이기 때문에 속도와 정밀도가 중요합니다.
배아 일 8.5에서 멸균 도구와 용액을 사용하여 자궁을 얼음 차가운 PBS 용기로 수확하십시오. 각 배아를 분리하기 위해 메소메트리움을 자른다. 자궁을 조심스럽게 해부하여 각 데시듀얼 붓기를 분리합니다.
올바른 발달 단계에서 배아를 수확하는 것은 가변성을 감소시키고 세포 이동뿐만 아니라 매트릭스에 식재의 성공증가를 증가시키는 데 매우 중요합니다. 근육 층과 배아의 데시듀얼 조직 사이의 집게를 밀어 내고 두 번째 쌍의 집게를 사용하여 근육 층을 제거합니다. 집게를 사용하여 심방 풀의 가장자리에서 데시두아를 관통하고 두 번째 봉힘을 사용하여 조직을 당김에 수직으로 찢어냅니다.
조심스럽게 막을 제거하기 전에 리아트 멤브레인을 시각화하는 집게로 데시티를 다시 껍질. 내장 노른자 삭스가 눈에 띄게되고 배아는 내부에서 관찰될 것입니다. 내장 노른자 삭스와 애니온을 제거하고 배아를 배치하여 머리 접기의 시각화를 허용합니다.
머리를 심장 위로 접어 서 깨끗한 신경판을 얻기 위해 기본 중구를 긁어냅니다. 그런 다음 신경판 테두리를 해부해야 합니다. 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 해부된 신경판을 컨디셔닝 된 신경 문장 매체로 채워진 하이드로겔 코팅 접시에 옮기고 부드럽게 접시를 소용돌이어 신경판을 우물 중앙에 놓습니다.
그런 다음 적절한 실험 기간 동안 신경판을 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%로 배양합니다. 24시간 후, 조직 배양 접시를 얼굴 대비 현미경의 표본 홀더에 넣고, 다중 우물 획득 시 흔들림을 방지하기 위해 플레이트 뚜껑과 이산화탄소 바늘을 테이프로 놓습니다. 그런 다음 선택된 응축기에서 일치하는 위상 링과 함께 10배 배율로 두개골 신경 문장 세포에 초점을 맞춥니다.
신경 문장 세포 철새 용량을 정량화하기 위해 현미경을 설정하여 10 배율로 5 분마다 하나의 프레임을 획득하십시오. 세포 형태를 정량화하기 위해 현미경을 설정하여 분당 1프레임을 40배 배율로 획득합니다. 라멜리포디아 역학을 정량화하려면 현미경을 설정하여 10초마다 10초마다 10분마다 10배 배율로 한 프레임을 획득하도록 설정합니다.
다중 웰 이미징의 경우, 선택한 X, Y 위치 사이를 이동하는 기계적 단계를 설정하고 두개골 신경 문장 세포가 초점을 맞추고 있으며 스테이지 위치가 올바른지 확인합니다. 그런 다음 획득을 클릭하여 시간 경과 이미징을 시작합니다. 단일 셀 추적의 경우 이미지 J를 열고 데이터를 티프 스택 파일로 가져옵니다.
방향 및 밝기 및 대비 수준을 변경하고 현미경 설정에 따라 점 스톡 파일을 픽셀 마이크로미터로 보정하기 위해 분석 및 설정 크기를 클릭합니다. 플러그인, 추적 및 수동 추적을 클릭하여 이미지 J 수동 셀 추적 플러그인을 열고 추적을 추가하여 셀 추적을 시작합니다. 그런 다음 핵을 기준점으로 사용하여 시간 경과 영화의 모든 프레임을 통해 세포를 추적합니다.
신경 문장 마이그레이션 용량을 평가하기 위해 적절한 마이그레이션 분석 소프트웨어 프로그램을 열고 가져오기 데이터 탭을 클릭하여 셀 추적 데이터를 점 트 txt 파일로 가져옵니다. 데이터 집합 및 초기화에서 분석할 슬라이스 또는 프레임 수를 선택하고 X Y 교정 및 프레임 간 시간 간격을 설정합니다. 설정을 저장하려면 적용 설정을 선택합니다.
그런 다음 플롯 데이터 기호를 선택하여 궤적 플롯을 형성하고 통계 기호를 선택하여 거리 및 속도 측정값을 정량화합니다. 신경 문장 세포 영역및 원형을 정량화하려면, 이미지 J를 열고 측정을 분석하고 설정하려면 클릭하여 셀 모양 매개 변수, 세포 영역, 둘레 및 모양 설명기를 선택합니다. 무료 손 선택 도구를 사용하여 셀막 경계를 사용하여 각 셀 주위의 윤곽선을 가이드로 수동으로 그립니다.
키보드의 Control+B 키를 눌러 이미지의 셀 윤곽선 오버레이를 유지하고 각 셀에 대해 반복합니다. 이미지 오버레이를 클릭하고 관심 관리자에 도달하고 관심 있는 셀을 선택합니다. 그런 다음 측정을 클릭하여 선택한 셀 셰이프 매개 변수에 대한 값을 가져옵니다.
24시간 이내에 절제 및 배양, 전철 상피 두개골 신경 문장의 영역은 신경판 을 둘러싼 것을 명확하게 관찰할 수 있다. 더욱이, 신경 문장 세포의 하위 인구는 중간엽 전이에 상피를 겪고 완전히 중간엽으로 나타납니다. 세포외 매트릭스 계 하이드로겔 또는 섬유네크틴에 도금된 박사 배양은 신경판 의 전이 신경 문장과 철새 신경 문장 세포 집단으로 구성된 유사한 각성 구조를 형성한다.
그러나 섬유넥틴에 도금된 각종은 세포 앞가장자리에서 더 눈에 띄는 라멜리포디아를 가진 세포를 생성하여 이동 방향으로 더 양극화된 것처럼 보입니다. 시간 경과 현미경 검사는 개별 세포의 X, Y 좌표 및 신경 문장 세포 이동의 분석 및 시간이 지남에 따라 두개골 신경 문장 세포 형태 역학의 분석을 할 수 있습니다. 개별 세포막을 요약함으로써, 세포 영역 및 둘레 측정은 세포의 세포 영역및 개별 및 세포의 그룹의 연속적인 정량화를 허용하기 위하여 영화의 모든 프레임에서 계산될 수 있습니다.
세포가 엑셀에서 멀리 이동함에 따라 세포 순환이 상대적으로 일정하게 유지되는 동안 세포 영역이 크게 증가하므로 세포가 상피 가장자리에서 출발하여 세포 접점에 세포를 잃을 때 세포 확산 영역이 증가한다는 것을 시사합니다. 이 조직에서 멀리 신경 문장 세포의 이동을 촉진으로, 깨끗한 신경 판을 얻기 위해 기본 중구를 긁어 특별한주의를 기울이. 면역스테인링, RTPCR 또는 단일 세포 분석과 같은 다른 많은 기술은 배양 세포의 상이한 집단 들 사이에서 관심있는 상이한 단백질 또는 유전자를 분석하기 위해 수행 될 수있다.
우리는 신경 문장 세포 이동에 관여 할 수있는 몇 가지 주요 신경 모세포종 유전자의 발달 롤에 관심이 있고 인간 질병 유전자를 연구하기 위해이 접근 방식을 사용하여.
