이 새로운 방법론은 안정적인 세포-세포 접촉을 확립하여 비특이적 친수성 중합체를 포함하는 수성 완충액에서 원하는 개별 세포로부터 적응된 3차원 어셈블리를 구성할 수 있게 해줍니다. 이 비디오에서는 원하는 단일 세포를 조작하고 인공 비계없이 3D 셀룰러 어셈블리를 구성하는 방법을 시연합니다. 여기서 우리는 예를 들어 Dextran과 우리의 매체에서 실험 절차를 보여줍니다.
시작하려면, 25 입방 센티미터 플라스크에서 10 %의 FBS 와 1 %페니실린 - 연쇄 절제술을 포함하는 DMEM의 5 밀리리터와 NAMRU 마우스 유방 선상동맥 상피 세포를 유지합니다. 진행 할 준비가되면, 보충 DMEM을 제거하고 PBS의 3 ~ 5 밀리리터를 추가하는 아스피러를 사용하여 세포를 세척하기 위해 섭씨 37도로 예열됩니다. 흡인기는 전경을 사용하여 플라스크에서 모든 PBS를 제거합니다.
섭씨 37도에서 예열된 트립신 1.5밀리리터를 추가합니다. 적어도 1 ~ 2 분 동안 섭씨 37도에서 CO2 인큐베이터에서 배양하십시오. 그 후, 10%의 FBS와 1%페니실린-스트렙토마이신을 함유한 DMEM3.5 밀리리터를 추가합니다.
파이펫을 위아래로 섞어 드시고 있습니다. 셀 서스펜션을 15밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 원심분리기는 실온에서 3분 동안 417회 G로 전달합니다. 그런 다음 매체를 흡인합니다.
10%의 FBS와 1%페니실린-연쇄절제술을 함유한 5mm의 신선한 DMEM을 추가합니다. 필요한 경우 냉동 보존 솔루션을 사용하여 제조업체의 지침에 명시된 대로 세포를 냉동 보존하십시오. 첫 번째 믹스 10 DMEM의 밀리리터 10% FBS와 1%페니실린-스트렙토마이신 과 함께 0.8 그램의 Dextran, 밀리리터 Dextran 솔루션 당 80 밀리 그램을 준비.
이 Dextran 용액의 200 마이크로리터를 이전에 준비된 세포 현탁액의 200 마이크로리터와 혼합하여 밀리리터 Dextran 배지당 40밀리그램을 함유한 셀 서스펜션을 만듭니다. 시작하려면 레이저를 켜면 빨간색파장이 있는 레이저 빔을 근적외선 영역으로 사용하는 것이 가장 효과적이라는 점에 유의하십시오. 그런 다음 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭하여 소프트웨어를 엽니다.
카메라의 아이콘을 두 번 클릭하고 해당 디스플레이가 나타납니다. 그런 다음 발광 다이오드, 포커스 조정 및 움직이는 스테이지의 아이콘을 두 번 클릭하여 디스플레이를 엽니다. 1위 유리 스페이서 2개가 하단 커버 글래스 슬라이드에 놓입니다.
이전에 준비된 Dextran 보충 셀 서스펜션을 하단 커버 유리 슬라이드로 옮기는 20 마이크로리터. 그런 다음 상단 커버 유리 슬라이드를 셀 서스펜션을 덮는 스페이서에 놓습니다. 시료 세포를 10마이크로리터의 증류수로 낮은 객관적렌즈에 배치하여 침수 현미경 검사법을 사용할 수 있습니다.
증류수 10마이크로리터를 사용하여 샘플 셀 상단에 상부 객관적 렌즈를 부착합니다. 다음으로 현미경 조명 창의 온-오프 버튼을 클릭하여 LED를 켭니다. 객관적인 포지셔닝 창의 방향 버튼을 클릭하여 초점이 맞을 때까지 샘플과 하부 목표 렌즈 사이의 거리를 조정합니다.
신호 감쇠 창에서 각 레이저 빔의 강도를 1500 밀리와트로 설정합니다. 그런 다음 두 레이저 아이콘을 클릭하여 1번 위치에서 레이저 빔을 조사하고 2개의 위치를 지정합니다. 샘플 위치 지정 창의 방향 단추를 클릭하여 셀이 위치에 끼일 때까지 샘플 스테이지를 이동합니다.
다른 셀이 2위치에 갇혀 될 때까지 두 위치를 나타내는 커서를 클릭하고 드래그합니다. 시작하려면 단일 셀을 조작하여 다른 셀과 접촉하도록 합니다. 이 상태를 300초 동안 유지하여 세포가 레이저에 300초 동안 노출되도록 합니다.
x-y축을 기록합니다. 다른 셀을 트랩하고 임의의 2D 셀 어셈블리를 구성하기 위해 처음 두 세포로 이송합니다. 그런 다음 스테이지를 위아래로 이동하여 3D 셀룰러 어셈블리를 구성합니다.
레이저가 꺼진 후에도 어셈블리가 여전히 안정되어 있는지 확인합니다. 이 연구에서 용해성 폴리머는 3D 단세포 어셈블리의 시공에 사용된다. 이중 빔 광학 핀셋을 사용하여 형성된 예제 구조가 여기에 나와 있다.
실험이 성공하면 레이저가 꺼진 후에도 이러한 셀룰러 어셈블리가 안정적으로 유지됩니다. 이 새로운 방법론은 천연 친수성 중합체를 가진 수성 매체에 있는 3D 세포 어셈블리의 건설을 위한 것입니다. 그것은 매우 재생 의학 및 조직 공학 분야에서 강력한 도구의 일부와 차세대 세포 어셈블리의 이러한 종류의 건설을 시작할 것으로 예상된다.
