RNA 간섭은 모기의 역 유전학에 사용되는 주요 도구 중 하나이며 경구 전달을 통해 마이크로 주사없이 성인 모기에서 유전자 침묵을 유도하고 유지할 수 있습니다. 성인 모기에 이중 가닥 RNA를 경구 전달하는 것은 유전자 기능을 연구하기위한 작업과 시간과 노력을 크게 줄이는 저렴한 비용과 다목적 RNA 간섭 방법입니다. 이 방법은 Anopheles gambiae의 다른 표적 유전자뿐만 아니라 Anopheles albinamus와 같은 관심있는 다른 anopheles에서도 연구 할 수 있습니다.
시작하기 위해, 암피실린 및 테트라사이클린을 함유하는 플라스미드를 발현하는 이중 가닥 RNA를 함유하는 에스케리치아 콜라이 균주 HT115(DE3)의 단일 박테리아 콜로니로부터 배양물을 섭씨 37도 및 180 RPM에서 12시간 동안 플랫폼 진탕기 상에서 성장시킨다. 12시간 후, 밤새 성장한 박테리아 배양물 0.5 밀리리터를 취하고, 암피실린과 테트라사이클린을 함유하는 2X 효모 트립톤 배지에서 1000 희석액을 만든다. 이중 가닥 RNA 생산을 유도하기 위해, IPDG를 40 마이크로몰의 최종 농도로 첨가한다.
이어서, 입증된 바와 같이 진탕 조건에서 배양물을 두 시간 동안 인큐베이션한다. 배양의 광학 밀도가 600 나노미터에서 0.4에 도달했을 때, 섭씨 4도에서 10분 동안 4, 000배 G에서 농축함으로써 박테리아 세포를 펠릿화한 다음, PBS의 한 부피로 세포를 세척한다. 세포를 한 번 더 회전시킨 후, 세포를 PBS에 재현탁시키고 섭씨 70도에서 한 시간 동안 배양한다.
박테리아를 열로 죽인 후 400 마이크로 리터 부피의 분취량을 만들어 더 이상 사용할 때까지 섭씨 20도에 보관하십시오. 이중 가닥 RNA를 발현하는 해동 열 파괴 박테리아의 400 마이크로리터 분취량 1.6 밀리리터와 0.2 % 메틸 파라벤을 함유 한 12 % 설탕 용액 1.6 밀리리터를 혼합하십시오. 이 용액에 작은 면봉을 담그고 오일 된 모기가 들어있는 새장 안에 넣고 모기가이 용액을 먹는지 확인하십시오.
이중 가닥 RNA 설탕 용액에 담근 면화 볼을 여덟 일 연속으로 격일로 바꿔 케이지가 일정한 조건에서 유지되도록하십시오. 모기를 감기에 걸리게하려면 모기가 움직이지 않을 때까지 얼음 위에 용기를 놓은 다음 모기를 차가운 표면에 올려 놓고 암컷을 분리하여 해부를 위해 암컷을 격리하십시오. 모기를 에탄올로 분무 한 후 PBS로 유리 표면에 놓습니다.
한 쌍의 포셉으로 모기 머리를 고정하고 흉부를 매우 천천히 당겨 타액선이 PBS로 방출되도록하십시오. 타액선이 10 마리의 모기에서 해부되면 RNA 추출을 위해 땀샘을 당깁니다. RNA 추출이 완료되면, RNA 펠릿을 30 마이크로리터의 RNAs 유리 물에 현탁시킨다.
흡광도를 측정하고 텍스트 원고에 설명 된대로 RNA 농도를 계산하십시오. 상용 역전사 키트를 사용하여, RNA의 한 마이크로그램으로부터 cDNA를 합성한다. cDNA를 10 번 희석하고 제조업체의 권장 사항에 따라 표적 및 하우스 키핑 유전자에 대한 RTPCR 반응을 세 배로 설정하십시오.
CDNA를 표준 실시간 PCR 조건으로 증폭시킨다. 혈액 공급 능력을 평가하기 위해 표적과 통제 된 이중 가닥 RNA로 처리 된 15 마리의 암컷 모기 그룹을 작은 케이지에 놓고 네 시간 동안 굶어 죽입니다. 섭씨 37도까지 설정된 순환 수조, 유리 모기 피더 및 페리 필 멤브레인을 사용하여 모기에게 defibrillated 값싼 혈액을 제공하십시오.
처음 다섯 명의 여성으로부터 혈액 식사를 성공적으로 획득하여 각 그룹에 완전히 참여하기위한 조사 시도 횟수를 관찰, 계산 및 기록하십시오. PBS가 이전에 입증한 신선한 조직과 PBS를 분리한 후, 이를 얼음처럼 차가운 아세톤에 90초 동안 고정시킨다. 그 다음 PBS에서 조직을 여러 번 헹구고 PBS에 희석된 항혈청으로 섭씨 네 도에서 하룻밤 동안 일차 항체와 함께 인큐베이션한다.
인큐베이션이 끝나면 PBS로 조직을 여러 번 세척하십시오. PBS에 희석된 형광 이차 항체를 첨가하고, 두 시간 동안 실온에서 어둠 속에서 인큐베이션한다. 임의의 카운터 염색을 두 시간 인큐베이션이 끝나기 30분 전에 첨가한다.
두 시간 후, 조직을 PBS로 세 번 세척한 다음, 1밀리미터 두께의 커버 슬립으로 표준 현미경 슬라이드에 100%글리세롤에 조직을 장착하고 이미징될 때까지 섭씨 20도에서 보관한다. 마이크로아레이 발현 데이터는 성인 타액선에서 선택된 모든 표적 유전자의 발현을 보여주었고, AAPP 및 세이지의 수준은 특히 높았다. 이중 가닥 RNA는 타액선에서 포크 헤드 전사체의 풍부함을 효과적으로 감소시켰다.
모기를 먹인 포크 헤드 이중 가닥 RNA는 대조군 또는 FEG 이중가닥 RNA 공급 모기가 혈액에 완전히 얽혀 있는 것보다 다섯 배 더 많은 먹이 시도를 나타내었다. 세이지 및 CrebA 염색의 수준은 개미 대조군 RNA 간섭에 비해 포크 헤드 RNA 간섭에 뒤따르는 모든 타액선 엽에서 현저하게 감소하였다. 고도로 풍부한 타액 성분 단백질을 고려할 때, AAPP의 수준은 대조군 RNA 간섭 처리와 비교하여 포크 헤드 RNA 간섭에 이어 세 개의 타액선 엽 모두에서 감소되었다.
반면에, 뮤신 수준의 변화는 관찰되지 않았다. 이들 데이터는 포크 헤드가 상이한 타액 단백질 유전자의 발현에 다르게 기여한다는 것을 시사한다. 감소된 Rab11 형광은 포크 헤드 RNA 간섭 처리 후 원위 측엽에서 관찰되었지만, 내측 및 근위 측엽에서의 Rab11 신호 증가도 또한 발생하였다.
포크 헤드 RNA 간섭 처리 후 나일 레드 신호에서 대조군 RNA 간섭 처리와 비교하여 뚜렷한 차이가 관찰되지 않았다. 일부 비서 기계 반응은 타액선과 다른 복잡한 방식으로 반응합니다. 이 기술을 통해 연구자들은 이중 가닥 RNA의 단일 주사로 발현을 감소시킬 수있는 유전자를 침묵시키고 RNAi를 잠재적 인 벡터 제어 방법으로 사용하기 위해 이중 가닥 RNA의 경구 전달을 탐구 할 수 있습니다.
