따라서 원고에서 방법의 목적은 인간 및 마우스 시스템을 사용하여 골수성 세포의 신호 경로에 대한 비교 분석을 제공하는 것입니다. 그것은 어떤 신호 경로 선택 된 패턴 인식 수용 체의 하류에 관련 된 정의 하는 데 도움이. 따라서 이 메서드는 구현하기 쉽습니다.
그것은 1 차적인 세포 준비 및 신호 기전의 해명에 필수적인 검증된 기준 화합물에 의존합니다. 절차를 시연하는 것은 라티바 투일과 아델레인 운터레이너, 각각 우리 그룹의 과학자 및 연구 동료가 될 것입니다. 라미나르 플로우 후드에는 멸균 된 가위, 1 리터 비커 및 비닐 봉지가 놓입니다.
이전에 획득한 버피 코트를 비커에 넣고 가위를 사용하여 조심스럽게 엽니다. 25mm 파이펫을 사용하여 EDTA 2 밀리머로 보충된 PBS 100ml를 추가합니다. 천천히 위아래로 파이프를 통해 섞는다.
그리고 희석 된 버피 코트 25 ml를 각각 15 ml의 다당류 기반 밀도 그라데이션으로 미리 채워진 6 개의 50ml 원심 분리 튜브로 옮긴다. 800g에서 20분 동안 튜브를 원심분리하여 중간 가속을 하여 밀도에 따라 세포를 분리할 수 있습니다. 원심분리 후 3층, 적혈구와 과립구를 함유한 펠릿, 플라즈마로 만든 상층, 말초 혈액 단핵세포를 포함하는 백색 고리가 보일 것이다.
10ml 파이펫을 사용하여 PBMC 링을 수확하고 새로운 50ml 튜브로 옮습니다. PBS 및 EDTA를 통해 최대 를 차지합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 원심 분리 시간과 속도가 줄어 3회 연속 세 가지 연속 세차유를 수행합니다.
마지막 세척 후, 골을 다시 중단 25 얼음 차가운 lysis 버퍼의 삼투압에 의해 적혈구를 lyse. 용액이 명확해질 때까지 실온에서 배양합니다. 그런 다음 25 ml의 분리 버퍼를 추가하여 반응을 중지합니다.
150g의 원심분리기는 8분간 세척하여 용액을 세척합니다. 상체를 붓고 분리 버퍼로 펠릿을 다시 놓습니다. 세포를 계산한 후 배양 배지에서 우물당 12, 500세포로 희석합니다.
이 셀 현탁액 30ml를 384웰 플레이트의 각 웰에 분배합니다. 다음으로 각 우물에 4배 의 농축 화합물 용액 15마이크로리터를 추가하고 1시간 동안 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 플레이트를 미리 배양합니다. 원하는 경우 ML당 1 ng의 최종 농도에 LPS를 추가하거나 Zymosan을 ml당 100 mcg의 최종 농도로 고갈시키세요.
그런 다음 이산화탄소 5 %와 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 접시를 배양합니다. 다음 날 은닉 된 TNF 알파 레벨을 측정하기 위해 10 마이크로 리터를 복용합니다. 직렬 희석을 시작하려면 MLT-827 스톡 용액을 배지로 희석하여 한 이동 중 8 마이크로몰러의 농도에 도달합니다.
0.08%DMSO의 매체를 사용하여 6단계 1:5 직렬 희석을 수행합니다. 단일 용량 테스트를 준비하기 위해 MLT-827, AFN700 및 화합물 11 스톡 솔루션을 배지로 희석하여 한 번의 이동 중에도 4 마이크로몰러의 농도에 도달합니다. 먼저, 멸균 내독소가 없는 물 2ml를 고갈된 자이모산 10mg에 넣습니다.
이 스톡 솔루션을 균질화하기 위해 소용돌이. 용액을 알리쿼트한 다음 알리코를 섭씨 20도에 보관합니다. 이 연구에서 인간 PBMC와 마우스 비장 세포는 고갈 된 Zymosan, Dectin-1 작용제 또는 TL4 작용제 인 lipopolysaccharide로 자극됩니다.
상체에서 NTNF 알파 릴리스는 20 시간 후에 측정됩니다. 인간과 마우스 모두에서 MLT-827 화합물은 데신-1 통로에 의해 구동되는 TNF 알파 생산을 선택적으로 차단하지만 TLR4 경로에 의해서는 차단되지 않는다. LPS로 자극된 단세포에서 TNF 알파의 생산은 AFN700에 의해 거의 완전히 제거되지만 Cd11에 민감하지 않으며, 이는 NF-kappa B 활동에 대한 TLR4 경로의 의존성과 SIC 활동에 대한 의존성과 일치합니다.
반면 Dectin-1 및 MODCs가 구동하는 TNF 알파 생산은 MLT-827, AFN700 및 Cpd11에 대한 민감도를 보여줍니다. 이것은 Dectin-1 통로에 있는 SIC CBM 신호 폭포의 연루를 위한 추가 증거를 제공합니다. IL-1 베타, IL-6 및 IL-23의 생산은 또한 TNF 알파와 유사한 규제 메커니즘을 나타내는 세 가지 억제제에 민감하다.
그러나 IL-8의 생산에 미치는 제한된 효과는 이 사이토카인이 뚜렷한 규제 메커니즘을 가지고 있음을 시사합니다. ML당 50mcg 이상의 트레할로오스-디베헤네이트 농도를 높이면 MLT-827의 차단 효과에 따라 몰트1 파라카스파제 활동에 의존하는 TNF 알파, IL-6 및 IL-1 베타의 생산으로 이어집니다. Dectin-1을 자극하기 위해 고갈 된 자이모산의 농도가 증가함에 따라 MODCs에 도전할 때도 비슷한 결과가 나타났습니다.
이 방법은 파라카파스 MALT1이 C형 렉틴과 같은 수용체 신호를 선택적으로 조절한다는 것을 보여주었습니다. 잘 특징적인 기준 화합물을 사용하는 것이 필수적입니다. 주식 솔루션희석 절차에 주의를 기울이는 다.
이것은 제한된 용해도를 가진 화합물에 대 한 중요 한.
