이 작품은 웰컴 트러스트, 의학 연구위원회, 더 로열 학회, 버밍엄 과학 도시와 불임 연구 신탁에 의해 투자입니다. 우리는 이미징 rigs 구축 및 통합에 케언 연구의 전문가 도움을 인정하고 싶습니다.

정상적인 정액 분석과 건강한 비옥한 남성의 정자는 일반적으로 다음과 같은 이미지 준비하고 있습니다. <ol><li> 정액 샘플은 더 이상 30 분 37 ° C에 저장됩니다. 1.8 CaCl 2 0.2 H 2 O, 5.37 KCl, 0.81 MgSO 4 0.7 H 2 O, 26.2 NaHCO 3, 1.0 아니 2 PO 4 : MM, 세포 보충 얼의 균형 소금 솔루션 (sEBSS에까지 수영을하여 정액 플라즈마에서 격리됩니다. 2 시간 2 O, NaCl 116.4, 55.6 D - 글루코오스, 2.73 나의 pyruvate, 41.8 나의 락트 산)은 0.3 % 숯 de-lipidated/fatty 산성 무료 분수 V BSA (BSA의 품질은 정자의 성공 capacitation 중요합니다)과 보완. sEBBS 1 ML 5 ML 튜브 일련의 각각에 pipetted 부드럽게 정액의 0.3 ML로 underlayered 있습니다. 상단 0.7 ML이 부드럽게 각 튜브에서 제거하고 풀링됩니다.; 1시간 (6 % CO 2가 37 ° C)에 대한 부화 후 정자 정지 10 μl가 세포를 고정하기 위해 포르말린 1% (V / V) 90 μl에 희석되어 그 정자는 노이 바 우어 챔버에 포함됩니다. 서스펜션의 셀 밀도는 다음 6,000,000 세포 / ML로 (sEBSS)를 조정됩니다. </li><li> 5-6 H 위해 capacitation 수 있습니다.; 예제는 다음 느슨하게 덮인 튜브와 incubated (6 % CO 2 37 ° C)는 200 μl의 aliquots으로 나뉘어져 있습니다 </li><li> Coverslips (22x50 mm)는 이전에 폴리 - D - 라이신과 함께 취급하고 있습니다. 폴리 - D - 라이신 용액 (10 % W / V) 10 μl는 coverslip의 중심에 작은 방울의 숫자로 적용됩니다. 폴리 - D - 라이신은 다음 건조 공기를 허용됩니다. 이것은 가열 무대에서 수 있으며 건조를 완료해야합니다. . 워너 RC20 챔버와 비슷한 폴리 - D - 라이신 -; coverslip는 동봉된, 목적 - 건설, perfusable, 폴리 카보 네이트 이미징 챔버 (≈ 180 μl 용량 크기 35mm X 20mm X 5mm)를하기 위해 진공 그리스와 함께 첨부되어 있습니다 코팅 coverslip은 세포가 거꾸로 현미경에서 볼 수 있으며 12mm 직경 원형 coverslip 빛의 전송을 허용, 챔버의 상부 표면을 형성하는 챔버의 기초를 형성합니다. </li><li> 오레곤 그린 BAPTA1 - AM (OGB) 또는 칼슘 그린 1 - AM은 세포를 라벨에 사용됩니다. OGB은 DMSO에 용해에 의해 준비가되어 있습니다. Pluronic F127은 산성 (세제) 염료의 &#39;clumping&#39;을 방지하기 위해 DMSO에 포함되어 있습니다. 이것은 실험실 (0.5 ML DMSO 100 MG의 Pluronic)에서 준비할 수, 즉시 사용하기 전에, 또는 미리 준비를 구입할 수 있습니다. 20 μl는 OGB (2.5 MG / ML)의 50 μg의 나누어지는에 추가됩니다. 유리병은 다음 동결하고 나중에 사용하기 위해 해동 저장할 수 있습니다. </li><li> 정자의 capacitation 후 (sEBBS에 5-6 H, 37 ° C, 6 % CO 2) 튜브가 이미징 및 OGB 솔루션 1.2 μl를 위해 선택되어이 10 μm의의 최종 농도를 제공, 추가됩니다. 튜브는 다음 세포 현탁액이 부드럽게 P1000 (파란색) 피펫 팁과 이미징 챔버의 유입 포트에 주입되는 후, 추가로 40 분 incubated입니다. 챔버 20 분, 아래 보육, 폴리 - D - 라이신 - 코팅 coverslip 측면에 배치됩니다. 세포는 챔버의 표면을 따라 수영하는 경향과 폴리 - D - 라이신 - 코팅 영역을 준수합니다. </li><li> 챔버 이제 재관류 장치에 연결되어 약 0.5 ML / 분 perfused, 현미경에 장착됩니다. 롤러 펌프 출구 포트에서 챔버 및 오버플로 생리가 함정과 흡입 펌프에 의해 제거됩니다 피드. 느슨한 세포와​​ 세포외 염료는 챔버의 재관류에 의해 제거 반면 준비는 적어도 10 분 동안 짙은 어둠 속에서 남아 있습니다. 온도 안정성 작은 변동은 세포 칼슘 2 + 항상성에 영향을 미치지 않을 수도 있기 때문에 결정적인 중요하지만 또한 염료의 K D에 영향을 줄 수 있습니다. 실험은 일반적으로 25 수행됩니다 ° C,이 수준의 어두운 방의 온도를 유지하여 달성했습니다. 우리는 필요한 수준의 실내 온도를 유지하는 것은 온도 조절 단계 또는 호수 유입에 thermostatically 제어 히터를 사용하여보다 온도와 초점 안정성을 제공하는 것으로 확인되었습니다. </li><li> 전지는 위상 대비 (40x 또는 기름 침지 60x) 목적 및 이미징을위한 영역이 선택에 따라 볼 수 있습니다. 생리 흐름 판상하고 일관성이 어디 입구 포트 근처에있는 폴리 - D - 라이신 코팅 영역의 부분은 좋습니다. 세포 밀도가 적절한 영역을 사용하는 것도 중요합니다 (과도한 밀도는 인접한 세포에서 신호의 픽업을 통해 데이터의 품질과 무결성에 영향을)과 세포가 적절하게 연결되어 있지만 flagellar 활동이보고 알 수있는입니다. 위상 콘트라스트 이미지가 저장됩니다. 시간이 명확한 형광 이미지를 (일반적으로 50-200 MS) 취득에 필요한 최소한으로 감소 및 노출, 현미경은 다음 형광 모드 (방출 540 nm의 여기 480 NM)로 전환됩니다. </li><li> 실험은 시간 시리즈 이미지 수집 소프트웨어 (IQ)를 활성화하여 시작합니다. 일반적으로 이미지는 0.1 Hz에서에서 취득하고 조명은 softwa를 사용하여 이미지 수집의 기간으로 제한됩니다제어 셔터를 다시. 훨씬 더 이미지 수집 요금을 사용할 수 있지만 수당은 표백의 문제와 세포 (토론 참조) 사진 손상에 의한 유물 세대하셔야합니다. IQ (및 대부분의 다른 수집 소프트웨어 플랫폼) 실험 중 형광 실시간 그래프를 허용합니다. </li><li> 3~5분 기간 염분 성분의 조작 (예 : [칼슘 2 +] O) 및 약물의 응용 프로그램의 제어 기간 후 재관류 헤더에 호수의 교체에 의해 이루어진다. 각 자극의 이외의 시간은 이미징 챔버 도착의 시간이 느리게 응답 (0.1 Hz에서에서 샘플) 여기에 설명된 평가에 대한 충분한 정확도를 제공하는 계산 수 있도록 기록됩니다. 더 빠른 응답보다 정확도가로 워너 RC20 챔버에서 제공하는 두 번째 유입 포트를 통해 직접 생리 흐름에 자극을 추가하여 얻을 수 있습니다. </li><li> 이미지 IQ를 사용하여 오프라인 분석하고 있습니다. (이자 (로아)의 영역은 각각의 셀 (또는 셀의 일부) 원형 그려되고 또한 세포 자유 구역은 소프트웨어 (자동 배경 제거를 위해 선택됩니다. 이미지 시리즈는 다음 acrosome 반응을 사망 또는 받았습니다 세포를 제거하는 검사 이것은 실험과 시계열로 분석하면 아티팩트를 일으킬 수있는 충분한 운동을 보여주었다 그 동안 세포질 염색의 손실) 형광 다음에 크고 급속한 증가로 나타납니다. </li><li> 시간 형광 강도 시리즈는 다음 각 투자 수익 (ROI)에 대한 취득하고 이러한 데이터는 Excel에서 오프라인 분석하고 있습니다. 처음에는 형광이 방정식을 사용하여 컨트롤 기간 동안 얻은 평균 값을 정규화는 R = [(FF 레스트) / F 휴식] X 100 %, R은 관리 기간에 비해 형광의 % 변화가 어디 있는지, F 형광 강도는 시간 T와 F의 나머지 부분에서 제어 기간 동안 얻은 F의 최소 30 결정의 의미입니다. </li></ol> 대표 결과 그림 1은 세포가 3 μm의 제품 progesterone과 자극했다하는 실험에서 이미지의 일련을 보여줍니다. 상단과 영화 1 회색 규모의 형광 이미지를 표시하고 멋진 &#39;색상 낮은 형광 강도를 나타내는 같은 mages&#39;는 어디에 (이미지 J의 테이블 &#39;16_colors 조회) &#39;pseudocolor에서 (그리고 영화 2) 다음과 같습니다 &#39;따뜻한&#39;색상 높은 형광 강도를 나타냅니다. 세포는 IQ의 조회 테이블을 사용하여 실험 도중 pseudocolor에서 볼지만, 그레이 스케일을 사용하는 것이 일반적 평가에 대한 더 유익합니다. 세포가 잘 표시 여부를하실 수 있습니다. 첫 번째 두 이미지 0 S 100 S 녹음 시작 후에서 수집된 있었다. 형광은 안정 및 게시물 acrosomal 영역과 정자의 목을 강하게하는 경향이 있습니다. Progesterone은 약 175 S에서 이미징 챔버를 입력하고 3 차 및 4 번째 이미지 (180 S와 220 S) [+ 칼슘 2] I (형광) 후부 머리와 세포의 목 지역에서 발생의 급속한 증가를 보여줍니다. 이후 이미지가 290에서 초기의 붕괴를 보여주는 360, 740, 990 및 1440 S입니다 [칼슘 2 +] 나는 과도하고 지속적인 보조 고도의 개발. 그림 2는 표준 형광 각 ROI (제어 기간에 비해 형광의 % 변화)에 대한 원료 형광 값을 변환, 스프레드 시트 분석을 보여주는 그림 3은 3 μm의의 progesterone의 &#39;전형적인&#39;반응을 보여주는 3 셀 시간 - 표준 형광 플롯을 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 전지에서 예제 데이터 progesterone과 자극. 그레이 스케일 (상단)와 pseudocolor (하단 행)의 형광 이미지의 일련 표시됩니다. 타임 포인트가 0, 180, 220, 290, 360과 990s입니다. 3 μm의의 progesterone은 175에서 이미징 챔버를 입력 S. 로아는 첫 번째 패널에 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. Excel의 단일 세포 형광 데이터의 분석. 검은 수치 형광 데이터의 시계열 있으며, 수직으로 배열. 빨간색 숫자는 (아래)의 텍스트에서 주어진 방정식을 사용하여 얻은 정규화된 데이터입니다. 그래프는 자극에 따라, 작은 oscillations의 속도가 느린 상승 및 시리즈 다음 형광의 과도 상승을 보여주는이 실험에서 세포 64 표준 형광 시간 플롯을 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 3 각 세포에 대한 형광 시간 흔적이 가치를 제어에 관한 %의 변화로 표현 .. 3 μm의의 progesterone은 화살표로 표시된 시간에 추가되었습니다. 점선 프로그램은 제어 형광을 뜻합니다.

<ol>
	<li>Haughland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Fluorescent Probes and Research Products. , (2002).</li><li>Nishigaki, T., Wood, C. D., Shiba, K., Baba, S. A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroboscopic+illumination+using+light-emitting+diodes+reduces+phototoxicity+in+fluorescence+cell+imaging.">Stroboscopic illumination using light-emitting diodes reduces phototoxicity in fluorescence cell imaging.</a> Biotechniques. 41, 191-197 (2006).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

성공적으로 수행되면,이 기술은 인간의 정자의 수 및 자발적인 유도 칼슘 2 + 신호의 배포 및 반응 속도론의 기록. 응답은 인간의 정자들이 자연과 칼슘 2 + 자극 신호의 변화를 많이 보여줄 수 있기 때문에 중요합니다 세포의 다수 (최대 200)에서 얻을 수 있습니다. 성공적인 분류 및 녹음하는 동안 세포의 생존은 샘플의 품질에 크게 의존하고 있습니다. 나쁨 샘플 가난한 라벨, 가난한 반응과 세포가 녹음 도중에 죽을 수도를 제공합니다. 인간의 정자는 사진 손상에 민감하고 따라서 세포의 생존을 극대화하고 세포를 파괴로 인해 유물을 최소화하기 위해 최소한의 필요한 조명 (강도와 노출 시간 모두)을 사용합니다. 카메라가 약한 형광을 데리러 때문에 높은 민감도 카메라 (낮은 강도 조명의 사용을 허용) 큰 도움이됩니다. 백 - 조명, EM - CCD 카메라는 매우 비싸지만, 특히 잘 적합합니다. LED 조명 (대신 여기 필터 크세논이나 수은 램프를 사용하여 또한 세포의 생존 (Nishigaki 외, 2006)을 향상시킵니다. 그것이 각각의 비율이 두 가지 이미지를 데리고 필요하기 때문에 Fura은 자외선과 여진을 필요로하고 있기 때문에 우리는 비율 - 메트 릭 영상의 명백한 이점에도 불구하고, Fura - 2를 사용하지 마십시오. 단일 파장, 가시 광선의 염료, 형광 강도의 정상화 주로 세포 사이에 염료를 로딩의 차이에 대한 보상, 아니라 개별 세포 내에 염료 배포하고, 이것을 염두에 부담하셔야와 함께 얻은 데이터. 단일 파장의 염료는, 원칙적으로 보정 수 있지만, 기술의 정확성이 떨어집니다 우리는이 작업을 수행하지 마십시오. 심지어 교정없이 Fura - 2 (또는 방출 비율 염색 인도)로 얻은 비율 데이터,의 상대 변화의 acceptably 충실 표현하다 반면에 [칼슘 2 +] I, 단일 파장 염료의 형광 강도는 훨씬 선형 출신 [칼슘 2 +] I. 관련 포화 곡선의 가장 유용한 부분 단일 파장 염료에 대한 관계는 일반적으로 로그에 대략. 우리는 현재 사용 오레곤 그린 BAPTA - 1 (그림 4)는 작은 변화에 민감하기 때문에 [칼슘 2 +] 나는 가까이 수준의 S (50-100 NM)을 쉬고 있습니다. 언제 [칼슘 2 +] 1 μm의 응답이 포화 수 있습니다 형광 변화와 염료의 관점에서 세 이하 대표한다 위 나 상승합니다. UV 여기에 resorting없이 기술 향상을 위해 옵션은 같은 Fluo - 3 및 Fura 빨강으로 염료와 부하 셀을 두 번하는 것입니다. 둘 다 488 NM에 흥분하지만, 동시에 그들의 반응은 매우 다릅니다 수 있습니다. 540 650 nm의에서 방출의 녹음의 정확한 모니터링을위한 더 나은 방법을 제공할 수있는 비율을 제공하는 [칼슘 2 +] I (Haughland, 2002)과 정자 (Nisigaki 외, 2006)에 적용할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 오레곤 그린 BAPTA - 1과 오레곤 그린 BAPTA - 2 무료 [칼슘 2 +] (NM)와 피크 파장 (약 525 nm의)에서 형광 방출 간의 관계. OGB1 쉬고에서 높은 형광 제공 [칼슘 2 +] 그러므로하지만, 낮은 레벨에서 saturates 그리고이 작은 유용한 범위를하고 있습니다. 이러한 플롯에 대한 데이터는 분자 프로브 핸드북 (Haughland, 2002)에서 얻은되었습니다.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Low light level Camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>QImaging</td>
<td>Rolera XR</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oregon Green BAPTA-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>06807</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Andor</td>
<td>IQ</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>National Institues of Health</td>
<td>Image J</td>
<td>Public domain software</td>
</tr>
<tr>
<td>LED illumination system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cairn Research</td>
<td>Opto LED</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P3000MP</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

techniques for imaging ca2+ signaling in human sperm

형광등, CA 탑재 세포의 형광 현미경<sup&gt; 2 +</sup&gt;에 민감한 염료는 칼슘의 공간과 시간적 측면의 측정에 사용됩니다<sup&gt; 2 +</sup&gt; 라이브 세포에 신호. 여기 우리는 CA와 인간의 정자의 suspensions 로딩을위한 실험실에서 사용되는 방법을 설명<sup&gt; 2 +</sup염료&gt;를 -보고 및 생리적 자극 동안 형광 신호를 측정. 운동성이있는 세포는 직접 수영을 접속하여 분리 실험에 따라 0-24 H에 대한 capacitating 조건 하에서 incubated 있습니다. 칼슘의 세포 permeant AM (acetoxy 메틸 에스테르) 에스테르 형태<sup&gt; 2 +</sup&gt; -보고 염료는 다음 H는 세포질에 염색의 로딩에 사용할 수있는 전지 나누어지는 1의 기간에 추가됩니다. 우리는 세포에 사진 피해를 최소화하기 위해 보이는 파장 염료를 사용하여, 그러나 이것은 ratiometric 녹음이 가능하지 않습니다. 이 방법의 장점과 단점을 설명합니다. 로딩 기간 동안 세포 이미징 챔버로 도입 폴리 - D - 라이신 코팅 coverslip을 준수 사용할 수 있습니다. 로딩 기간 초과 색소와 느슨한 세포의 끝에 재관류 장치에 대한 챔버의 연결에 의해 제거됩니다. 챔버가 지속 perfused이며, 자극 및 수정된 살린스은 다음 재관류 헤더에 추가됩니다. 실험 형광 이미지의 시간 경과 수집하여 기록하고 수동으로 관심 영역을 그림으로써, 세부 오프라인에서 분석하고 있습니다. 데이터는 각각의 셀 (또는 셀의 일부), 그래프가 CA를 보여주는 동안 그러한 사전 자극 수준으로 정규화<sup&gt; 2 +</sup형광의 % 변화로&gt; 응답이 얻어진다.

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Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

자극 - evoked [칼슘<sup&gt; 2 +</sup&gt; 개별 인간의 정자] 나는 신호를 평가하고 있습니다. 운동성이있는 세포는 칼슘과 함께로드됩니다<sup&gt; 2 +</sup&gt; 구분 형광 염료 (AM - 에스테르 방법) 및 perfusable 챔버에 고정. 세포는 시간이 경과 형광 현미경으로 몇 군데와 perfusing 매체를 통해 자극하고 있습니다. 하나의 세포 (또는 지역)의 응답은 Excel을 사용하여 오프라인 분석하고 있습니다.

이미징 CA의 기술 2 + 인간 정자의 시그널링

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

techniques-for-imaging-ca2-signaling-in-human-sperm

Research

JoVE Journal

Biology

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

17.0K 조회수.  University of Birmingham. 자극 - evoked [칼슘 2 + 개별 인간의 정자] 나는 신호를 평가하고 있습니다. 운동성이있는 세포는 칼슘과 함께로드됩니다 2 + 구분 형광 염료 (AM - 에스테르 방법) 및 perfusable 챔버에 고정. 세포는 시간이 경과 형광 현미경으로 몇 군데와 perfusing 매체를 통해 자극하고 있습니다. 하나의 세포 (또는 지역)의 응답은 Excel을 사용하여 오프라인 ...

비디오: Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to measure odor evoked activity in the antennal lobe1. From then on, it has been continuously refined and applied to different neuropiles in the bee brain. Here, we describe the preparation currently used in the lab to measure activity in mushroom body neurons using a dextran coupled calcium-sensitive dye (Fura-2). We retrogradely stain mushroom body neurons by injecting dye into their axons or soma region. We focus on reducing the invasiveness, to achieve a preparation in which it is still possible to train the bee using PER conditioning. We are able to monitor and quantify the behavioral response by recording electro-myograms from the muscle which controls the PER (M17)2.
After the physiological experiment the imaged structures are investigated in greater detail using confocal scanning microscopy to address the identity of the neurons.

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

Bees can be conditioned in an appetitive olfactory learning paradigm (PER-conditioning). Using odors as stimuli, we established a method in which behavior is recorded while simultaneously Calcium Imaging is used to measure odor evoked activity in mushroom body neurons in vivo.

생체내 칼슘 2 + - 허니 비에 강한 학습하는 동안 버섯 바디 뉴런의 영상

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to ...

연구

생물학

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

형광 현장에서</em인간의 정자에서> 하이브리드화 (물고기) 프로토콜

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

이온 채널 유학을위한 패치 클램프 및 재관류 기법으로 표현 Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative stress refers to the aberrant formation of ROS (reactive oxygen species), which include O2&bull;-, H2O2, and hydroxyl radicals. Reactive oxygen species influences a multitude of cellular processes including signal transduction, cell proliferation and cell death1-6. ROS have the potential to damage vascular and organ cells directly, and can initiate secondary chemical reactions and genetic alterations that ultimately result in an amplification of the initial ROS-mediated tissue damage. A key component of the amplification cascade that exacerbates irreversible tissue damage is the recruitment and activation of circulating inflammatory cells. During inflammation, inflammatory cells produce cytokines such as tumor necrosis factor-&alpha; (TNF&alpha;) and IL-1 that activate endothelial cells (EC) and epithelial cells and further augment the inflammatory response7. Vascular endothelial dysfunction is an established feature of acute inflammation. Macrophages contribute to endothelial dysfunction during inflammation by mechanisms that remain unclear. Activation of macrophages results in the extracellular release of O2&bull;- and various pro-inflammatory cytokines, which triggers pathologic signaling in adjacent cells8. NADPH oxidases are the major and primary source of ROS in most of the cell types. Recently, it is shown by us and others9,10 that ROS produced by NADPH oxidases induce the mitochondrial ROS production during many pathophysiological conditions. Hence measuring the mitochondrial ROS production is equally important in addition to measuring cytosolic ROS. Macrophages produce ROS by the flavoprotein enzyme NADPH oxidase which plays a primary role in inflammation. Once activated, phagocytic NADPH oxidase produces copious amounts of O2&bull;- that are important in the host defense mechanism11,12. Although paracrine-derived O2&bull;- plays an important role in the pathogenesis of vascular diseases, visualization of paracrine ROS-induced intracellular signaling including Ca2+ mobilization is still hypothesis. We have developed a model in which activated macrophages are used as a source of O2&bull;- to transduce a signal to adjacent endothelial cells. Using this model we demonstrate that macrophage-derived O2&bull;- lead to calcium signaling in adjacent endothelial cells.

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

An efficient method to gain insights into visualizing the paracrine-derived ROS induction of endothelial Ca2+ signaling is described. This method takes advantage of measuring paracrine derived ROS triggered Ca2+ mobilization in vascular endothelial cells in a co-culture model.

혈관 CA의 시각화 2 + Paracrine 유래 ROS에 의해 트리거된 신호

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

표현 복제가 Grb2 신호 복합 단지를 공부하기 위해 높은 콘텐츠 이미징 워크 플로우

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

The study of electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ handling abnormalities requires isolated cardiomyocytes. In addition, the possibility to investigate myocytes from patients using these techniques is an invaluable requirement to elucidate the molecular basis of cardiac diseases such as atrial fibrillation (AF).1 Here we describe a method for isolation of human atrial myocytes which are suitable for both patch-clamp studies and simultaneous measurements of intracellular Ca2+ concentrations. First, right atrial appendages obtained from patients undergoing open heart surgery are chopped into small tissue chunks ("chunk method") and washed in Ca2+-free solution. Then the tissue chunks are digested in collagenase and protease containing solutions with 20 &mu;M Ca2+. Thereafter, the isolated myocytes are harvested by filtration and centrifugation of the tissue suspension. Finally, the Ca2+ concentration in the cell storage solution is adjusted stepwise to 0.2 mM. We briefly discuss the meaning of Ca2+ and Ca2+ buffering during the isolation process and also provide representative recordings of action potentials and membrane currents, both together with simultaneous Ca2+ transient measurements, performed in these isolated myocytes.

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

We describe the isolation of human atrial myocytes which can be used for intracellular Ca2+ measurements in combination with electrophysiological patch-clamp studies.

칼슘의 동시 측정을위한 인간의 심방 근육 세포의 분리<sup&gt; 2 +</sup&gt; 과도하고 막 전류

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Spermatozoa are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be prepared to face a constantly changing environment and to overcome several physical barriers. Being in essence transcriptionally and translationally silent, these motile cells rely profoundly on diverse signaling mechanisms to orient themselves and swim in a directed fashion, and to contend with challenging environmental conditions during their journey to find the egg. In particular, Ca2+-mediated signaling is pivotal for several sperm functions: activation of motility, capacitation (a complex process that prepares sperm for the acrosome reaction) and the acrosome reaction (an exocytotic event that allows sperm-egg fusion). The use of fluorescent dyes to track intracellular fluctuations of this ion is of remarkable importance due to their ease of application, sensitivity, and versatility of detection. Using one single dye-loading protocol we utilize four different fluorometric techniques to monitor sperm Ca2+ dynamics. Each technique provides distinct information that enables spatial and/or temporal resolution, generating data both at single cell and cell population levels.

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Intracellular Ca2+ dynamics are very important in sperm physiology and Ca2+-sensitive fluorescent dyes constitute a versatile tool to study them. Population experiments (fluorometry and stopped flow fluorometry) and single cell experiments (flow cytometry and single cell imaging) are used to track spatio-temporal [Ca2+] changes in human sperm cells.

세포 내 칼슘 측정<sup&gt; 2 +</sup개의 기술하여 인간 정자에서&gt; 변경 : 기존 Fluorometry은 흐름 Fluorometry, 유동 세포 계측법 및 단일 세포 이미징을 중지

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

이미징 로컬 CA<sup&gt; 2 +</sup&gt; 배양 된 포유 동물 세포에서 신호

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

세포 내 칼슘의 두 광자 이미징<sup&gt; 2 +</sup&gt; 고립 된 쥐 대동맥의 취급 및 내피 세포에서 산화 질소 생산과 부드러운 근육 세포

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

고정의 이미지 Prometaphase 및 중기 감수 분열의 I위한 기술<em&gt; 초파리</em&gt; 난 모세포

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...