라운드 정자 주사는 일부 비폐쇄성 무정자증 환자의 생식 문제를 해결할 수 있지만 효율성은 매우 낮습니다. 본 연구에서는 생쥐를 모델로 삼아 생쥐에서 ROSI의 배아 발달 효율을 향상시킬 수 있는 방법을 모색하였다. 불완전한 통계에 따르면 전 세계적으로 ROSI로 잉태된 인간 태아는 200명 미만입니다.
ROSI 기술의 잠재력에 대한 이해의 전환점은 2015년 Tanaka와 동료들이 ROSI 기술을 통해 14명의 태아를 성공적으로 출산했다는 보고를 통해 ROSI 기술의 임상 적용과 실현 가능성에 대한 새로운 확신을 심어주면서 발생했습니다. 현재 ROSI 연구의 초점은 후성유전학적 변형 및 비정상적인 난모세포 보조 활성화의 이상에 맞춰져 있으며, 둥근 정자 데이터를 정확하게 식별하는 것도 과제입니다. 우리 연구실에서는 이미 생쥐 내 ROSI 배아의 발달 효율이 매우 높으며, 이는 다른 연구실과 유사합니다.
그러나 인간과 같은 설치류가 아닌 동물의 발달 효율성은 여전히 매우 새롭습니다. 앞으로는 비설치류의 개발 효율성 향상에 중점을 둘 것입니다. 먼저, 6주에서 8주 된 암컷 마우스에게 오후 5:00에 임신한 암말 혈청 성선 자극 호르몬 7.5개, 48시간 후에 인간 융모성 성선 자극 호르몬을 각각 복강내 주사합니다.
주사 후 수컷 마우스와의 접촉이 발생하지 않도록 하십시오. 쥐를 안락사시킨 후 복강을 엽니다. 가위를 사용하여 양쪽 난소 근처의 나팔관을 절단하고 섭씨 37도로 예열된 M2 완충액에 넣습니다.
정립 현미경의 10X 대물렌즈 아래에서 나팔관의 투명하고 확대된 부분을 찾습니다. 그런 다음 1ml 주사기를 사용하여 나팔관을 고정하고 확대된 부분을 절단한 다음 난모세포 관상 적운 복합체를 채취합니다. 과립층 세포를 제거하려면 0.1% 히알루로니다아제가 함유된 예열된 M2 작동 용액에 난모세포 복합체를 넣고 경구 피펫을 통해 부드럽게 불어냅니다.
난모세포를 KSOMaa 액적에 순차적으로 옮겨 3회 헹구고 이산화탄소가 5%인 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣습니다. 먼저 안락사된 8주에서 10주 된 수컷 C57BL/6 마우스를 구합니다. 복강을 열고 고환 근처의 부고환을 가위로 부드럽게 절제합니다.
부고환이 담긴 접시를 M2 배지에 올려 놓고 정립 현미경의 10X 대물렌즈 아래에 놓습니다. 그리고 1ml 주사기를 사용하여 부고환을 부드럽게 절제하여 정자가 흘러나오도록 합니다. 현탁액으로 흐르는 정자를 0.5ml의 M2 완충액이 들어 있는 튜브의 바닥으로 빨아들입니다.
둥근 정자 분리를 위해 절개된 고환을 M2 완충액으로 이동합니다. 1밀리리터 주사기를 사용하여 현미경 아래의 흰색 막을 부드럽게 자른 다음 뒤얽힌 정세관을 짜서 절제합니다. 현탁액을 추출한 후 400 메쉬 체로 여과하고 여과된 세포를 원심분리합니다.
상등액을 버리고 섭씨 37도에서 10분 동안 200마이크로리터의 Hoechst 33342로 세포를 배양합니다. 염색된 세포가 들어 있는 세포분석 튜브를 유세포분석기에 넣습니다. 전압을 조정한 후 forward 및 side scatter를 기준으로 세포 모집단을 선택합니다.
그런 다음 전방 산란 및 트리거 펄스 폭에 따라 세포 접착을 제거합니다. 355 나노 미터 파장의 레이저 아래에서 두 개의 검출 채널을 사용하여 둥근 정자를 분류하고 섭씨 4도에서 보관합니다. 현미경으로 보니 쥐의 둥근 정자는 직경이 약 10마이크로미터였고 중간에 돌출부와 같은 핵소체 구조를 보여주었습니다.
시작하려면 마우스에서 난모세포와 둥근 정자를 얻습니다. 그런 다음 적절한 직경의 고정 바늘과 주사 바늘을 준비합니다. 배우자를 연화시키고 보관하기 위해 cytochalasin B가 있거나 없는 10마이크로리터 M2 방울에 난모세포를 놓습니다.
그런 다음 둥근 정자류의 M2 방울을 놓고 현미경 수술대에 수술 접시를 장착합니다. 주입 위치를 조정하고 바늘을 고정하십시오. 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 사용하여 주사 바늘을 적시고 세척합니다.
다음으로, 둥근 정자를 주사 바늘에 추출합니다. 홀딩 바늘로 난모세포를 회전시켜 난모세포의 극체를 12시 방향에 놓습니다. 그런 다음 주사 바늘을 난모세포의 3시 방향 위치에 조심스럽게 놓습니다.
PiezoXpert 장치를 사용하여 난모세포의 투명대에 구멍을 만듭니다. 그런 다음 주사 바늘을 난모세포 안으로 수평으로 부드럽게 밀어 넣고 난모세포막을 파열합니다. 점차적으로 둥근 정자를 난모세포 세포질에 주입합니다.
주사 바늘을 빼내고 개구부 근처에 있는 소량의 난모세포막을 흡인하여 밀봉합니다. 세포질 내 정자 주입을 위해 PVP 활주로에 정자를 놓습니다. 꼬리에서 정자를 흡인하고 목을 주사 바늘 입구에 위치시킵니다.
피에조를 적용하여 정자 머리와 꼬리를 분리합니다. 그런 다음 앞에서 설명한 것처럼 직경이 9-10마이크로미터인 주사 바늘로 난모세포에 정자를 주입합니다. 보조 난모세포 활성화를 위해 난모세포를 20마이크로리터의 칼슘 방울과 염화스트론튬 육수화물을 포함하는 마그네슘이 없는 CZB 배지에 넣습니다.
그런 다음 KSOMaa 배양액으로 옮겨 배양합니다. 동시에, 발생학적 연구를 위해 둥근 정자 또는 정자를 주입하지 않고 단형성 활성화를 위한 그룹을 설정합니다. 활성화 후 KSOMaa 배양액으로 옮겨 배양합니다.
둥근 정자를 주입한 배아는 세포질 내 정자를 주입한 배아에 비해 발달 효율이 감소한 것으로 나타났습니다.
