이 프로토콜은 근육 질환을 모델링하고 전임상 치료 테스트를 수행하는 데 사용할 수있는 인간 골격 근 이노 이식을 만드는 데 사용할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 xenograft 모형은 연구원이 인간 적인 근육 세포 생물학을 더 잘 이해하고 희소하거나 취득한 근육 질병을 위한 새로운 모형을 개발하기 위하여 생체내에서 인간적인 근육을 공부할 수 있게 합니다. 인간의 근육 생검을 얻은 후, 근육 매체를 포함하는 100-15 밀리미터 페트리 접시에 표본을 배치하고 스테레오 현미경과 수술 가위를 사용하여 남은 근막 또는 지방 조직을 제거합니다.
근육 생검을 약 7-3-3밀리미터 조각으로 해부하여 섬유가 시편 내에서 세로로 배열되도록 주의하십시오. 다음으로, 얼음에 해부된 근육을 함유한 페트리 접시를 옮기고, 합성, 흡수할 수 없는 봉합사를 100-15mm 페트리 접시에 70%에탄올로 놓습니다. 8-12주 된 발가락 꼬집어 에 대한 반응의 부족을 확인한 후, 마취 된 NOD-Rag-감마 마우스는 면역 결핍 동물의 눈에 연고를 바르고 트리머를 사용하여 발목에서 무릎까지 티비리얼리스 전방을 덮어 머리카락을 제거합니다.
그런 다음, 포비단 요오드 용액과 70 %에탄올로 수술 부위를 소독하기 전에 노출 된 피부에 1 분 동안 디필 크림을 바르습니다. 인간 조직을 이식하려면 마우스 다리 아래로 첫 번째 테이프를 바르고, 말단 힘줄에서 유래하고 무릎 아래에서 종료되는 티비알리스 전방에 직선 절개를 합니다. 무딘 해부를 사용하여 근육을 분리하고 가위를 사용하여 티비알리스 전방 근육의 에피미슘을 통해 0.5 밀리미터 미만의 절개를 하고 힘줄에서 시작하여 무릎에서 끝납니다.
티비알리스 전방의 단면 힘줄을 절단 한 후, 홍채 집게로 힘줄을 잡고 무릎을 향해 근육을 당깁니다. 다음으로, 엑스텐소 디지오룸 롱더스의 단면 힘줄을 자르고, 무릎쪽으로 장시간 엑스텐소 리시올을 당깁니다. peroneus longus 근육의 근위 힘줄이 보이면, 가위를 가진 전근 자리 수 와 티비리얼 전방을 제거하십시오.
PBS와 함께 젖은 외과 닦기를 사용하여 hemostasis가 달성 될 때까지 약간의 압력을 가하고 근위 peroneus longus 힘줄을 통해 봉합사를 스레드하여 힘줄의 양쪽에 약 1.5 인치 조각을 남깁니다. 원을 형성하기 위해 조인하지 않고 두 손 수술 사각형 매듭의 전반을 확인하고, 접목 조직을 확보하기 위해 루프를 조이고, 원에 이종이 접목을 배치합니다. 사각형 매듭의 나머지 절반은 속내 롱더의 근위 힘줄에 이종이 접기를 봉합하고, 탈구 반쪽 긴 힘줄을 통해 봉합사를 스레드하여 탈모 힘줄에서 정사각형 매듭 기술을 반복한다.
접목의 양쪽 끝이 고정되면, xenografted 근육 위에 피부를 당기고, 수술 접착제로 절개를 밀봉하고, 접착제 위에 2 ~ 3 개의 수술 스테이플을 놓습니다. 그런 다음 마우스를 가열 패드에 깨끗한 케이지에 넣고 전체 세척이 끝날 때까지 모니터링합니다. 수술 후 4~6개월 후, 2-메틸부탄 200밀리리터가 들어있는 덮인 비커를 식이식 수확 하기 최소 30분 전에 드라이 아이스 상자에 놓습니다.
2-메틸부탄이 식으면 발가락 꼬집어 대한 반응이 부족한지 확인하고, 트리머와 디필 크림으로 발목에서 무릎까지 티비알리스 전방을 덮어 머리를 제거합니다. 제소 이식을 제자리에 두는 봉합사는 피부를 통해 관찰되어야 합니다. 테이프로 다리를 고정하고 가위와 홍채 집게를 사용하여 두 봉합사가 모두 발견 될 때까지 xenograft 위에 피부를 엽니 다.
메스를 사용하여 자궁 이식과 경골 사이를 절단하여 복상 동맥 긴 근육과 위트로테네미악 근육 사이를 절단하기 전에 xenograft의 한쪽을 자유롭게하십시오. 불사조 봉합사 아래와 속의 종말 힘줄을 통해 잘라, 그리고 아이리스 집게를 사용하여 잡고 기본 근육 조직에서 멀리 제노 이식을 절단 하는 동안 무릎쪽으로 봉합사를 편향. 그런 다음 가위를 사용하여 근위 봉합사 위로 잘라 이종이 이식과 속내 롱러스를 제거하고 수확한 표본을 작은 판지에 놓습니다.
근육을 부드럽게 스트레칭하면서 가능한 한 봉합사에 가까운 조직을 고정하여 스냅 동결 과정에서 섬유 방향이 유지되도록 합니다. 핀이 단단히 고정되어있을 때, 조직이 골판지 바로 위에 놓여 있도록 핀위로 근육을 밀어 내고, 영하 80도 저장을 위해 미리 냉각 된 2 메틸 부탄에서 xenograft를 고정합니다. 성공적인 이노이식은 인간 특정 항체로 확인된 인간 근섬유의 강력한 재생을 보여줍니다.
양근섬유의 비율 내에서 염색하는 양성 배아 묘신은 재생 과정이 여전히 진행 중임을 나타냅니다. 대조적으로, 나쁜 외과 기술 또는 부적당한 견본은 근육 섬유의 가난한 재생으로 이끌어 낼 수 있습니다. 특발성 염증성 근병증으로 진단된 환자로부터 수행된 제노이식은 4개월 과 6개월 컬렉션에서 재생된 인간 근섬유의 적당한 수를 나타내며, 배아 근신 얼룩은 6개월에 지속된다.
염증 성 세포는 또한 H와 E 염색에 의해 관찰된 바와 같이, xenograft 안에 존재합니다. 개별 근섬유 크기는 특발성 선동적인 근병증 xenografts에서 4 그리고 6 달 사이에서 유사합니다. 3, 500 마이크로미터보다 큰 단면 영역을 나타내는 희귀 섬유는 제곱된 제곱된 제곱이식 내에서 관찰되지만 특발성 염증성 근병증 생검에서는 관찰되지 않으며, 제노이트내 의 근섬유 중 일부는 건강한 근섬유와 유사한 크기로 재생될 수 있음을 나타낸다.
이 절차의 가장 중요한 부분은 초기 절개가 만들어지고 성공적으로 상피를 통해 절단 한 후 발목의 모든 힘줄을 식별하는 것입니다. 제노이식의 기능적 역량은 단일 심섬유를 효소적으로 분리하고 칼슘 과도를 테스트하거나 전기 자극 에 따른 강제 측정을 수행함으로써 평가될 수 있습니다.
