이 연구는 NSF 커리어 그랜트 (MCB0954016)와 DOE Bioenergy 연구 부여 (DEFG0208ER64694)에 의해 지원되었다.

1. 세포 배양 (그림 1) <ol><li> 미량 원소, 소금, 비타민 및 경로 조사에 가장 구체적으로 표시 탄소 기판과 최소한의 매체 세포를 성장. 세포 배양에 대한 흔들림 flasks 또는 bioreactors 중 하나를 사용하십시오. 이러한 효모 추출물로 유기 영양분은 아미노산 라벨의 측정을 방해할 수 있으며 따라서 문화 매체에있는 수 없습니다. </li><li> UV / VIS 분광 광도계와 함께 최적의 파장 (예 : 51,142 Cyanothece에 대한 OD 730)에서 문화의 광학 밀도에 의한 세포 성장을 모니터링합니다. </li><li> 세포가 처음이 아닌 표시 매체 성장하실 수 있습니다. 중간 로그 성장 위상 세포는 레이블 매체 접종 (볼륨 접종 비율을 3 % (V / V))에 사용 선호하고 있습니다. 표시된 문화는 초기 inoculum 이외의 레이블 탄소의 도입을 피하기 위해 같은 표시된 매체 (3 % V / V 접종 비율) 하위 교양하여야한다. </li></ol><p클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. 아미노산 추출 <ol><li> 원심 분리 (10 분, 8,000 × g)하여 중간 로그 성장 단계에서 수확 하위 교양 전지 (10mL). </li><li> 6M HCL의 1.5mL의 펠렛을 Resuspend하고 맑은 유리, 나사 맨 GC의 약병에 전송할 수 있습니다. 튜브를 모자 아미노산으로 바이오 매스 단백질 hydrolyze 24 시간 동안 100 ° C의 오븐에 넣어. 바이오 매스 펠렛의 가수 분해는 20 일반적인 아미노산 (그림 2) 5 16를 얻을 수 있습니다. 시스테인과 트립토판가 타락하고, 글루타민과 아스파라긴는 각각, 글루 탐 산염 및 aspartate로 변환됩니다. </li><li> 이 ML Eppendorf 튜브를 사용하여 5 분 20,000에서 아미노산 솔루션 × g을 원심 분리기, 새로운 GC의 튜브에 supernatants을 전송. 이 단계는 가수 분해 용액에 고체 입자를 제거합니다. </li><li> GC 유리 뚜껑을 제거하고 써모 과학 Reacti - Vap 증발기 (주를 사용하여 공기의 흐름에 따라 완전히 샘플을 건조 : 동결 건조기에도 T를 사용할 수 있습니다O 건조 샘플). 이 단계는 하룻밤 사이에 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 아미노산 derivati​​zation 및 GC - MS 조건 GC를 통해 아미노산 또는 유료 / 높은 극지 metabolites 분석이 metabolites는 아미노산이 휘발성이며, 가스 크로마 토그래피 2 분리될 수 있도록 derivatized 있어야합니다. <ol><li> tetrahydrofuran 150 μL (THF)와 N - (tert - butyldimethylsilyl) - N - methyltrifluoroacetamide derivati​​zation 시약 150 μL로 건조 샘플을 디졸브. </li><li> ° C 1 시간 65 80 사이의 오븐이나 열탕 목욕의 모든 샘플을 품어. 유리병에 metabolites가 해산되어 있는지 확인하기 위해 가끔 소용돌이. </li><li> 10 분 20,000 × g에서 샘플을 원심 후 새로운 GC의 튜브에 뜨는을 전송. 뜨는은 명확하고 노란 솔루션을해야합니다. 감지기의 포화로 인해, GC - MS 측정 정확도가 높은 conce에 의해 영향을받을 수주입 TBDMS derivatized 아미노산 (이 예제는 종종 어두운 갈색 색상을 보여줍니다)의 ntration 따라서, 우리는 GC - MS 측정 6 전 THF를 사용하여 이러한 샘플을 희석한다. </li><li> GC - MS (1시 5분 또는 1시 10분 분할 비율, 주입 부피 이용 = 1 μL, 캐리어 가스 헬륨 = 1.2 ML / 분).하여 샘플을 분석 다음 GC 온도 프로그램 사용 : 150에서 보류 ° 2 분 C, 3 증가 ° C 280 분 당 ° C, 20 ° C 증가 분 당 300 ° C, 그리고 5 분 만요. 솔벤트 지연이 ~ 5 분 (30m GC 열)로 설정할 수 있습니다. MS의 비율 (M / Z)를 충전하기 위해 대량의 범위는 60 500 사이에서 설정할 수 있습니다. </li></ol> 4. GC - MS 데이터 분석 <ol><li> TBDMS derivati​​zed 아미노산 측정은 또한 GC 분리의 동위 원소의 차별에 의해 영향을받을 수 있습니다. 가벼운 동위 원소는 GC 열의 동위 원소을 끌어들여보다 약간 이동합니다. 잠재적인 측정 바이어스를 줄이기 위해, 우리는 전체의 질량 스펙트럼을 평균 수아미노산 피크 범위 6 </li><li> TBDMS derivatized metabolites의 GC와 MS 스펙트럼 7 이전에보고되었습니다. 각각의 아미노산에 대한 GC 유지 시간과 고유한 M / Z 봉우리는 그림 3에서 그림입니다. </li><li> 아미노산이나 중앙 metabolites의 Derivatization 13 C (1.13 %)를 포함한 자연 - 분류 동위 원소의 상당 금액, 18 O (0.20 %), 29시 (4.70 %), 30시 (3.09 %)를 소개합니다. 원시 대량 isotopomer 스펙트럼 자연 동위 원소에서 측정 잡음은 출판 소프트웨어 5, 8을 사용하여 해결할 수 있습니다. 최종 isotopic 라벨 데이터는 대량 분수, 예를 들어, M 0, M 1, M 2, M 3 M 4로보고됩니다 (영 네 가지 13 C 표시된 탄소를 포함하는 조각을 대표). </li><li> 2 - 옥소 - glutar : 아미노산의 측정 여덟 중요한 전구체 metabolites에 대한 isotopic 라벨 정보를 제공할 수3 - P - glycerate, 아세틸 - COA, erythrose - 4 - P, oxaloacetate, phosphoenolpyruvate, pyruvate, 그리고 리보 오스 - 5 - P, 먹었다. 이러한 metabolites의 라벨 패턴은 여러 중앙 신진 대사 경로 (그림 2) 9을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 라벨 실험의 결과는 더 이상 (예, RT - PCR) 다른 생화학 방법을 사용하여 확인할 수 있습니다. </li></ol> 5. 표시 아미노산 데이터를 사용하여 경로 분석 잘 설계된 13 C 추적 실험에서 생산 단지 몇 주요 아미노산을 조사함으로써, 우리는 전체 중앙 대사 정교한 13 C - 신진 대사 흐름 분석을 수행하지 않고도 여러 가지 독특한 경로 또는 효소 활동을 보여줄 수 있습니다. <ol><li> Entner - Doudoroff 경로 : [1-13 C] 포도당은 탄소 소스로 사용할 수 있습니다. 통로가 활성화되어 있으면, 세린 라벨은 알라닌 10 라벨보다 훨씬 낮은 것입니다. </li><li> 분지 TCA 사이클 : [1-13 C]pyruvate는 탄소 소스로 사용할 수 있습니다. TCA 사이클이 깨진 경우 글루 탐 산염은 하나의 탄소 11, 12으로 표시되는 동안, aspartate는 두 탄소로 표시하실 수 있습니다. </li><li> mixotrophic 신진 대사에 캘빈 - 벤슨 - Bassham 사이클에 의해 CO 2 고정 : CO 2 비 - 표시 및 탄소 기판 라벨은 탄소 소스로 사용 둘. 캘빈 사이클이 작동하는 경우, 세린과 히스티딘 라벨이 크게 다른 아미노산으로 비교, 희석됩니다. 유기 탄소 소스 매체 13에있는 경우 이러한 방법은 상대적으로 CO 2 고정을 결정할 수 있습니다. </li><li> 산화 pentose 인산 경로 : [1-13 C] 포도당은 탄소 소스로 사용할 수 있습니다. 통로가 활성화되어 있으면이 아닌 레이블 알라닌은&gt; 50 % 12 수 있습니다. </li><li> Anaplerotic 경로 (예 : 응원 + CO 2의 oxaloacetate) : 13 CO 2와 비 표시된 탄소 기판 (예 : 글리세롤 또는 pyruvate)은 탄소 소스로 사용할 수 있습니다. 통로가 활성화되어 있으면, aspartate 라벨 13 세린 알라닌 및 비교, 훨씬 풍부합니다. </li><li> 다시 구연산의 synthase : [1-13 C] pyruvate가 탄소 소스로 사용할 수 있습니다. 효소가 활성화되어 있으면, 글루 탐 산염은 β - 카르 복실 그룹 3, 4에 표시됩니다. </li><li> Citramalate 경로 : [1-13 C] pyruvate, [2-13 C] 글리세롤, 또는 [1-13 C] 아세테이트는 탄소 소스로 사용할 수 있습니다. 통로가 활성화되어 있으면, 류신 이소 류신과 라벨 금액 14 동일합니다. </li><li> 세린 - isocitrate의 lyase주기 : [1-13 C] pyruvate 또는 [1-13 C] 락트 산은 탄소 소스로 사용할 수 있습니다. 통로가 활성화되어 있으면, 세린에서 세 번째 위치 탄소는 15 표시됩니다. </li><li> 영양분의 활용 (즉, 외인성 아미노산) : 완전히 표시 탄소 기판이 아닌 레이블 아미노산과 문화 매체사용할 수 있습니다. 세포가 선택이 보충되지 않은 레이블 영양소를 활용하면, 우리는 바이오 매스에서 이러한 아미노산의 중요한 상표 희석을 볼 수 있습니다. 이 방법은 영양 보충은 세포 16 선호하는 조사하는 데 사용할 수 있습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 최근 bioenergy 연구 bioenergy 생산을위한 소설 phototrophic의 미생물을 사용하여 이익을 부흥 2 캡처를 CO있다. 중앙 신진 대사 경로의 생화 학적 지식을 잘 설립되지 않기 때문에 과거 몇 년 동안, 첨단 13C - 신진 대사 플럭스 분석 (13C - MFA)를 포함한 몇몇 13C - 대사 분석은,,, phototrophic 박테리아 중앙에 신진 대사를 조사하기 위해 적용되었습니다 이 이외의 모델 생물 10, 11, 17-20인치 여기, 우리는 Cyanothece에서 대체 이소 류신 경로의 발견 51,142 21 예제를 제시한다. 청록색이othece 51142은 전형적인 이소 류신 합성 경로에서 2 ketobutyrate로 트레오닌의 전환 catalyzes 효소 (EC 4.3.1.19, 트레오닌 암모니아 - lyase)를 포함하지 않습니다. 이소 류신 경로를 해결하기 위해, 우리는 54 MM의 글리세롤 (2 - 13C&gt; 98%)와 ASP2 중간 22 Cyanothece 51,142 (20 ML)를 성장. Cyanothece 51142은 주요 탄소 소스로 분류 글리세롤 2 차 위치를 사용합니다. 우리는 이소 류신 세 탄소와 함께 표시되는 동안 트레오닌과 알라닌 하나가 탄소 라벨이 있는지 관찰합니다. 따라서, Cyanothece 51142의 합성은 대부분의 생물 (그림 4)에 의해 고용 트레오닌 경로에서 파생 수 없습니다. 한편, 류신과 이소 류신이 단편을 기반으로 동일한 상표 패턴을 가지고 (M - 15) +와 조각 (M - 159) +. 예를 들어,에서 isotopomer 데이터 [이 M - 15] +이 (조각 화되지 않은 아미노산을 포함하는) 류신에 대해 동일한 상표 (M0 = 0.01, M1 = 0.03, M2 = 0.21, M3 = 0을 표시0.69) 및 이소 류신 (M0 = 0.01, M1 = 0.03, M2 = 0.24, M3 = 0.67). 따라서 류신과 이소 류신은 같은 엽 성의 전구 물질 (즉, pyruvate 및 아세틸 - COA)에서 합성되어야합니다. 이 관찰 이소 류신 합성에 대한 citramalate 경로에 표시된 탄소 전환과 일치합니다. 이 경로를 확인하려면, 우리는 공동 게놈 연구소의 데이터베이스를 검색하고 Cyanothece에 citramalate synthase CIMA (cce_0248)의 존재를 찾으십시오. <img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 13 C를 이용한 경로 분석 단계를 반복합니다. <img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 자신의 신진 대사 엽 성의 전구 물질의 라벨 패턴을 습득에 사용되는 아미노산. ACoA, 아세틸 - COA, AKG, α - Ketoglutarate, C5P, 리보 오스 5 - 인산, CIT, 구연산, E4P, erythrose 4 인, G6P, 포도당 6 인산, OAA,<html> oxaloacetate, 격려, phosphoenolpyruvate, PGA, 3 phosphoglycerate, PYR, pyruvate. <img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. 16 아미노산에 대한 GC의 봉우리. TBDMS derivatized 아미노산은 두 조각으로 MS에 의해 금이 다음과 같습니다 (M - 57) +, 전체 아미노산을 포함하고, (M - 159) +, 어떤 아미노산의 α 카르 복실 그룹을 부족합니다. 류신과 이소 류신에 대한 (M - 57) +은 다른 대량 봉우리에 의해 overlapped했다. 우리는 전체 아미노산 라벨을 분석 조각 (M - 15) + 사용하는 것이 좋습니다. (f302) + 그룹은 아미노산 백본에서 첫 번째 (α - 카르 복실 그룹)와 두 번째 탄소를 포함하는 대부분의 아미노산에 감지됩니다. 이 MS 피크가 자주 높은 잡음 대 신호 비율을 가지고 있기 때문에 (f302) + 것은 양적 신진 대사 fluxes 7 ​​분석하지 않는 것이 좋습니다. igure 4 &quot;/&gt; 그림 4. Cyanothece 51,142 (우리의 이전 논문에서 수정) 21 이소 류신 경로로 전환 레이블.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 프로토콜은 표시 기판으로 세포를 먹이 및 GC - MS를 통해 아미노산의 결과 isotopic 라벨 패턴을 측정 구성되어 있습니다. MS 데이터 (M / Z 비율)는 MS 이온의 라벨의 단지 전체 금액을주고 있기 때문에, 우리는 M / Z 두 조각 화되지 않은 (M - 57) +의 비율과 조각 아미노산을 조사하여 아미노산의 isotopomer의 배포판을 평가해야 (즉, (M - 159) +과 (f302) +). 또한, 우리는 화학적으로 ?...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> TBDMS </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 19,915 </td><td> - </td></tr><tr><td> THF </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 34,865 </td><td> - </td></tr><tr><td> 표시된 탄소 기판 </td><td> 캠브리지 동위 원소 연구소 </td><td> 실험 요구 사항에 따라 달라집니다 </td><td> 웹사이트 : <a href="http://www.isotope.com">http://www.isotope.com</a> </td></tr><tr><td> 기체 크로마토 그래프 </td><td> 애질런트 테크놀로지 </td><td> 휴렛 팩커드, 모델 7890A </td><td> - </td></tr><tr><td> GC 열 </td><td> J &amp; W 과학, Folsom, CA </td><td> DB5 (30m) </td><td> - </td></tr><tr><td> 질량 분석계 </td><td> 애질런트 테크놀로지 </td><td> 5975C </td><td> - </td></tr><tr><td> Reacti - Vap Evaporator </td><td> 써모 과학 </td><td> TS - 18825 </td><td> 아미노산 샘플을 건조 </td></tr></tbody></table>

metabolic pathway confirmation and discovery through 13c-labeling of proteinogenic amino acids

미생물이 생화학 및 기능 유전체학 방법을 사용하여 조사 수있는 복잡한 신진 대사 경로를했습니다. 셀 중앙 신진 대사를 검토하고 새로운 효소를 발견하는 한 가지 중요한 기술은 13 C를 이용한 대사 분석 1입니다. 이 기술은 미생물이 13 C 라벨 기판과 먹이 아르 의하여 isotopic 라벨에 따라 달라집니다. 생화학 네트워크의 metabolites 사이의 원자 전이 경로를 추적함으로써, 우리는 기능 경로를 결정하고 새로운 효소를 발견하실 수 있습니다. transcriptomics 및 proteomics에 대한 보완 방법, 대사 경로의 isotopomer를 이용한 분석을위한 접근 방식은 세 가지 주요 단계 2를 포함하는으로. 첫째, 13 C 표시된 기판과 세포를 성장. 이 단계에서 매체와 라벨 기판의 선택의 구성은 두 가지 핵심 요소가됩니다. 영양 보충제가 아닌 레이블 탄소의 측정 잡음을 방지하려면, 단독 탄소 소스와 최소한의 매체가 필요합니다. 또한, 레이블 기판의 선택은 그것이 분석되는 경로를 명료하게하다하는 방법을 효과적으로 기반으로합니다. 소설 효소는 종종 일반적인 다른 반응 입체 또는 중간 제품을 포함하기 때문에 단독으로 표시된 탄소 기판이 소설 경로 3, 4의 검출에 대한 균일하게 표시된 것보다 소설 경로의 탐지에 대한 더 정보를 제공하고 있습니다. 둘째, 우리는 GC를 사용하여 아미노산 라벨 패턴을 분석 - MS. 아미노산은 단백질이 풍부하고 따라서 바이오 매스 가수 분해로부터 얻을 수 있습니다. 아미노산은 GC 분리하기 전에 N - (tert - butyldimethylsilyl) - N - methyltrifluoroacetamide (TBDMS)에 의해 derivati​​zed 수 있습니다. TBDMS derivati​​zed 아미노산은 MS와 조각의 다양한 배열의 결과에 의해 조각난 수 있습니다. 조각과 조각 화되지 않은 아미노산의 요금 (M / Z) 비율 질량에 따라, 우리가 중앙 metabolites의 가능한 표시 패턴을 추론할 수아미노산의 엽 성의 전구 물질. 셋째, 우리는이 경로가 활성 2아르 여부를 확인 isotopomer 데이터를 기반으로 제안된 경로의 13C 탄소 전환을 추적합니다. 아미노산의 측정은 중앙 신진 대사에 8 중요한 전구체 metabolites에 대한 isotopic 라벨 정보를 제공합니다. 이러한 대사 주요 노드는 관련 중앙 통로의 기능을 반영하실 수 있습니다. proteinogenic 아미노산을 통해 13 C를 이용한 대사 분석 널리 저조한 특징 미생물 대사 1 특성화 기능에 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 새로운 효소 기능을 발견하기위한 표시된 탄소 기판의 사용을 설명하기 위해 모델 변형으로 Cyanothece 51142을 사용합니다.

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Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

13 C - 동위 원소 라벨링은 미생물의 다양한 유형의 셀 중앙 신진 대사를 결정하기위한 유용한 기법입니다. 세포가 특정 레이블 기판과 교양되었습니다 후, GC - MS 측정은 proteinogenic 아미노산의 고유 라벨 패턴을 기반으로 기능성 대사 경로를 확인할 수 있습니다.

을 통해 대사 경로 확인 및 검색 13</supProteinogenic 아미노산> C - 라벨링

Microbes have complex metabolic pathways that can be investigated using biochemistry and functional genomics methods. One important technique to examine ...

metabolic-pathway-confirmation-discovery-through-13c-labeling

Research

JoVE Journal

Biology

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

24.1K 조회수.  Washington University. 13 C - 동위 원소 라벨링은 미생물의 다양한 유형의 셀 중앙 신진 대사를 결정하기위한 유용한 기법입니다. 세포가 특정 레이블 기판과 교양되었습니다 후, GC - MS 측정은 proteinogenic 아미노산의 고유 라벨 패턴을 기반으로 기능성 대사 경로를 확인할 수 있습니다.

비디오: Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

액상 복구와 분자량 기반 분류에 대한 GELFREE 8100 분획화 시스템을 사용하여

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

연구

생물학

One-step Metabolomics: Carbohydrates, Organic and Amino Acids Quantified in a Single Procedure

Every infant born in the US is now screened for up to 42 rare genetic disorders called "inborn errors of metabolism". The screening method is based on tandem mass spectrometry and quantifies acylcarnitines as a screen for organic acidemias and also measures amino acids. All states also perform enzymatic testing for carbohydrate disorders such as galactosemia. Because the results can be non-specific, follow-up testing of positive results is required using a more definitive method. The present report describes the "urease" method of sample preparation for inborn error screening. Crystalline urease enzyme is used to remove urea from body fluids which permits most other water-soluble metabolites to be dehydrated and derivatized for gas chromatography in a single procedure. Dehydration by evaporation in a nitrogen stream is facilitated by adding acetonitrile and methylene chloride. Then, trimethylsilylation takes place in the presence of a unique catalyst, triethylammonium trifluoroacetate. Automated injection and chromatography is followed by macro-driven custom quantification of 192 metabolites and semi-quantification of every major component using specialized libraries of mass spectra of TMS derivatized biological compounds. The analysis may be performed on the widely-used Chemstation platform using the macros and libraries available from the author. In our laboratory, over 16,000 patient samples have been analyzed using the method with a diagnostic yield of about 17%--that is, 17% of the samples results reveal findings that should be acted upon by the ordering physician. Included in these are over 180 confirmed inborn errors, of which about 38% could not have been diagnosed using previous methods.

The urease method of sample preparation for GC/MS analysis of intermediary metabolites is presented by its inventor. The method allows one-step follow-up of newborn screening for inborn errors by tandem mass spectrometry by quantifying carbohydrates, organic and amino acids all in a single process.

한 단계 Metabolomics : 탄수화물, 단일 절차 계량 유기 및 아미노산

Every infant born in the US is now screened for up to 42 rare genetic disorders called "inborn errors of metabolism". The screening method is based on ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

핵산의 NanoDrop Microvolume의 Quantitation

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Zebrafish 태아의 대사 프로필 분석

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

대사율의 측정에<em&gt; 초파리</em&gt; Respirometry를 사용하여

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

성장 기반의 결정 및 단백질 분해에 대한 유전 요구 사항의 생화학 적 확인에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by providing improved methodology for the identification of inhibitors for such binding sites and which represent the majority of potential drug targets. The main goal of this paper is to provide a methodological overview of the use and application of the REPLACE strategy which involves computational and synthetic chemistry approaches. REPLACE is exemplified through its application to the development of non-ATP competitive cyclin dependent kinases (CDK) inhibitors as anti-tumor therapeutics. CDKs are frequently deregulated in cancer and hence are considered as important targets for drug development. Inhibition of CDK2/cyclin A in S phase has been reported to promote selective apoptosis of cancer cells in a p53 independent manner through the E2F1 pathway. Targeting the protein-protein interaction at the cyclin binding groove (CBG) is an approach which will allow the specific inhibition of cell cycle over transcriptional CDKs. The CBG is recognized by a consensus sequence derived from CDK substrates and tumor suppressor proteins termed the cyclin binding motif (CBM). The CBM has previously been optimized to an octapeptide from p21Waf (HAKRRIF) and then further truncated to a pentapeptide retaining sufficient activity (RRLIF). Peptides in general are not cell permeable, are metabolically unstable and therefore the REPLACE (REplacement with Partial Ligand Alternatives through Computational Enrichment) strategy has been applied in order to generate more drug-like inhibitors. The strategy begins with the design of Fragment ligated inhibitory peptides (FLIPs) that selectively inhibit cell cycle CDK/cyclin complexes. FLIPs were generated by iteratively replacing residues of HAKRRLIF/RRLIF with fragment like small molecules (capping groups), starting from the N-terminus (Ncaps), followed by replacement on the C-terminus. These compounds are starting points for the generation of non-ATP competitive CDK inhibitors as anti-tumor therapeutics.

We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

를 통해 교체 단백질 - 단백질 상호 작용의 억제제의 개발 : 설계 및 개발 비 ATP 경쟁 CDK 억제제에 응용

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by ...

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes limitations on potential protein applications. The incorporation of noncanonical amino acids can enlarge this scope. There are two complementary approaches for the incorporation of noncanonical amino acids. For site-specific incorporation, in addition to the endogenous canonical translational machineries, an orthogonal aminoacyl-tRNA-synthetase-tRNA pair must be provided that does not interact with the canonical ones. Consequently, a codon that is not assigned to a canonical amino acid, usually a stop codon, is also required. This genetic code expansion enables the incorporation of a noncanonical amino acid at a single, given site within the protein. The here presented work describes residue-specific incorporation where the genetic code is reassigned within the endogenous translational system. The translation machinery accepts the noncanonical amino acid as a surrogate to incorporate it at canonically prescribed locations, i.e., all occurrences of a canonical amino acid in the protein are replaced by the noncanonical one. The incorporation of noncanonical amino acids can change the protein structure, causing considerably modified physical and chemical properties. Noncanonical amino acid analogs often act as cell growth inhibitors for expression hosts since they modify endogenous proteins, limiting in vivo protein production. In vivo incorporation of toxic noncanonical amino acids into proteins remains particularly challenging. Here, a cell-free approach for a complete replacement of L-arginine by the noncanonical amino acid L-canavanine is presented. It circumvents the inherent difficulties of in vivo expression. Additionally, a protocol to prepare target proteins for mass spectral analysis is included. It is shown that L-lysine can be replaced by L-hydroxy-lysine, albeit with lower efficiency. In principle, any noncanonical amino acid analog can be incorporated using the presented method as long as the endogenous in vitro translation system recognizes it.

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

An easy-to-use, cell-free expression protocol for the residue-specific incorporation of noncanonical amino acid analogs into proteins, including downstream analysis, is presented for medical, pharmaceutic, structural and functional studies.

를 사용하여 모델 단백질로 비정규 아미노산의 잔류 특정 법인 설립<em&gt; 대장균</em&gt; 휴대없는 전사 번역 시스템

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

핵산의 여과 분리 : 간단하고 신속한 DNA 추출 방법

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal epithelium. Despite their physiological importance, enteroendocrine cells represent only a small fraction of the epithelial cell population and in the past, their characterization has presented a considerable challenge resulting in a reliance on cell line models. Here, we provide a detailed protocol for the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary cultures have been used to identify the signaling pathways underlying the stimulation and inhibition of gut peptide secretion in response to a number of nutrients and neuropeptides as well as pharmacological agents. Furthermore, in combination with the use of transgenic fluorescent reporter mice, we have demonstrated that these primary cultures become a powerful tool for the examination of fluorescently-tagged enteroendocrine cells at the intracellular level, using methods such as patch clamping and single-cell calcium and cAMP-FRET imaging.

This protocol describes the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary intestinal cultures enable the investigation of signaling pathways underlying gut peptide secretion using a number of techniques.

을 통해 대사 경로 확인 및 검색 13 C - 라벨링

을 통해 대사 경로 확인 및 검색^{13 C - 라벨링}