이 작품은 Knut와 앨리스 발렌 버그 기초에서 교부금에 의해 지원되었다. 웁살라, 스톡홀름과 인도에서 인간 단백질 아틀라스 센터의 전체 직원은 인간 단백질 아틀라스를 생성하는 그들의 노력에 대해 인정하고 있습니다. 촬영 때 저자는 특히 TMA 생산과 도움을 사진과 Elené Karlberg에 도움 프랭크 Hammar과 소피 Gustafsson 감사하고 싶습니다.

1. 조직 Microarray 생산을위한 조직을 준비하는 방법 (애니메이션 1) <ol><li> 해당 hematoxylin 스테인드 조직 섹션을 포함하여 관련 포르말린 고정 파라핀 임베디드 자료 (조직이나 세포 샘플을)를 선택합니다. </li><li> 조직 섹션에 관련 영역을 표시한다. 그것은 파라핀 블록에 대응 자른 hematoxylin의 스테인드 섹션을 가지고하는 것이 좋습니다. </li><li> TMA 생산에 사용되는 템플릿을 디자인합니다. 이러한 전체 TMA 섹션과 sectioning 문제 이상 항체의 범위 등 기술적인 문제로 인한 아티팩트를 피하기 위해 템플릿 내에서 샘플을 무작위. 방향 설정을위한 템플릿에 추가 오리 엔테이션 마커를 추가합니다. </li><li> 템플릿에 따라 조직을 구성합니다. </li></ol> 2. 수동 조직 Microarray 제작 (촬영을위한 필수) <ol><li> , 조직 코어의 표준 길이를 구하는 탐침 예 : 4.5 mm (그림 2)를 표시하기 위해서입니다. Guidel샘플 센터 사이의 간격에 대한 아이 네스 : 코어 크기가 0.6 mm - 0.8-1.0 mm 코어 크기가 1.0 mm - 1.8-2.0 mm 코어 크기가 1.5 mm - 2.0-3.0 mm 코어 크기가 2.0 mm - 2.5-4.0 mm 그것은 파라핀으로 균열을 피하기 위해 파라핀 블록의 각 측면에 2.5-3.0 mm 여백을두고하는 것이 좋습니다. </li><li><ol class="lalpha"><li> 사용되는 선택된 펀치를 탑재합니다. 대신에 펀치를 보유 진수 소켓 나사를 풀어으로 시작합니다. 펀치 허브의 홈에 단단히 V-블록 플라스틱에 금속 봉에 대한 배치하면 펀치가 올바르게 배치됩니다. 나사를 고정하고 금속 클립의 가장자리가 수평인지 확인하십시오. </li><li> 받는 펀치 왼쪽으로 배치해야합니다 (녹색과 빨간색, 유통 업체에 대한 특정이 표시된). 기증자 펀치 약간 큰 직경을 가지고있는, (그림 3) 오른쪽에 위치해야합니다 (녹색과 청색, 유통 업체에 대한 특정에 표시). </li></ol></li><li><ol class="lalpha"><li> XY 조정 단자를 사용하여 X-와 Y-축을 따라 펀치를 이동합니다. 바로 조절 손잡이는 X-축을 따라 펀치를 이동하고 왼쪽 조절 노브는 y 축은 함께 펀치를 이동합니다. 조정 단자가 모두에서 디지털 마이크로 미터 판독이 있습니다. 손잡이를 이동할 때 이들은 활성화됩니다. </li><li> 리셋 → 제로 / ABS 버튼을 누르십시오. 인치와 mm 사이의 변화 → / 밀리미터 버튼을 누르십시오. 9x8 템플릿 1 밀리미터 펀치를 사용할 때 구멍 사이의 공간은 2.0 mm (구멍의 중심 사이에 측정된)이어야합니다. </li></ol></li><li><ol class="lalpha"><li> 카세트를 때리는하고 펀치를 파괴, 당신은 블록으로 너무 멀리 아래로 펀치를 강요하지 않도록하기 위해 홀더에 파라핀 않고 카세트를 넣고 카세트의 바닥 위에 1mm로받는 주먹의 바닥 위치를 설정 에 깊이 정지 나사를 사용하여Z-가이드의 왼쪽 위 모서리 (그림 3). </li><li> 홀더에받는 블록을 넣고 나사를 고정하는 작은 드라이버를 사용합니다. 꽉로 나사를 고정하지 마십시오이나 파라핀은 카세트에서 느슨한 손상시킬 수 있습니다. </li><li> 받는 블록으로 아래로받는 펀치 약 5mm 밀어하고 (그림 3) 번 앞뒤로 펀치를 회전 펀치에 핸들을 사용합니다. 가능한 한 블럭에까지 아래로 펀치를 밀어 때 구멍이 5mm 깊이 될 것입니다. </li><li> 온천가 펀치를 이동할 수 있도록 천천히 아래로 밀어 압력을 완화. 펀치를 비우고 파라핀 코어를 삭제하 탐침을 사용하십시오. </li></ol></li><li> 기증자 펀치 (그림 3)로 전환하는 터렛으로 이동합니다. </li><li> 받는 블록 홀더 이상 기증자 블록 (그림 3)과 기증자 블록 다리를 놓습니다. </li><li><ol class="lalpha"><li> 기증자 punc 밀어기증자 블록의 선택된 영역으로 H. 해당 hematoxylin과 관심의 영역이 샘플되어야하는 조직을 찾습니다 표시되었습니다 eosin 스테인드 슬라이드를 사용합니다. 수동으로 왼손과 위치에 기증자 블록을 잡고 오른손으로 펀치를 밀어. 당신은 탐침에 강요하지 말아야합니다. 깊이 정류장 기증자 블록에 맞는 위치에서 펀치 모션을 차단하지 않으므로 그것은 두 번째 마크 탐침에서 볼 때 밀어 중지하는 것이 중요합니다. </li><li> 일단 펀치 (그림 3)에 손잡이를 회전합니다. 아직 기증자 블록 다리에 기증자 블록을 누른 상태에서 천천히 아래쪽으로 압력을 릴리스합니다. </li><li> 기증자의 조직이 선호받는 코어보다 짧은 0.5 mm를 찍었다고합니다. 이 과정은 귀중한 대표 조직의 손실을 피하기 위해,받는 블록 표면에 코어의 조절 정렬을 보장합니다. </li></ol></li><li> 다리와 기증자 블록을 제거합니다. 하다기증자 펀치는 (점 4) 이전되었다 구멍에 정렬되었는지 확인합니다. 당신은 기증 펀치와 수신자 블록에 구멍이 정렬되지 않을 경우 설정 나사를 사용하여 펀치의 위치를​​ 조정해야합니다. </li><li> 그 조언이받는 블록의 구멍의 상단에 도달할 때까지 조심스럽게 아래로 펀치를 밀어. 이 자리를 잡고 있지만, 구멍으로 조직 코어를 비우러 탐침을 사용합니다. 코어 표면은 블록 표면에 정렬에 있어야합니다. </li><li> 받는 주먹으로 터렛 뒤로 이동합니다. </li><li> XY 조정 단자가있는 다음 위치로 이동합니다. </li><li> 배열이 완료될 때까지 위의 점 4c부터 반복합니다. </li><li> 전체받는 블록이 완료되면받는 블록 홀더의 나사를 느슨하게. 40 분 동안 42 블록 ° C를 굽습니다. 유리 슬라이드를 아래로 향하게 sectioning 면적 블록을 넣어. 테스트 튜브 홀더 (또는 다른 적절한 시공) 및 T의 장소 위에 블록으로 유리 슬라이드를 삽입그는 오븐. 베이킹 후 오븐에서 테스트 튜브 홀더를 제거하고 부드럽게 유리 슬라이드를 쓰다듬어하여 블록의 표면을 평평하게. </li><li> 10 분 냉각 판에있는 유리 슬라이드에 블록을 삽입합니다. TMA에 걸쳐 대표적인 조직을 높이기 위해 각 50 회 섹션에서 품질 관리가 수행됩니다. </li></ol> 3. 방법 섹션 TMAs (애니메이션 2) <ol><li> 섹션 전송 시스템 (HM 355S, Microm)로 마이크로톰를 사용하여 4 μm의 두께 부분을 잘라 버릴거야. 시스템은 현재의 모든 로터리 microtomes 사용할 수 있습니다. 시스템 통합 환승 다리, 온수 물이 욕조와 제어 유니트와 블레이드 캐리어로 구성되어 있습니다. 블레이드에서 섹션 물 목욕으로 전송 다리를 통해 젖은 전송 표면에​​ 미끄러지듯. </li><li> 섹션들이 민감한 조직 명소 (유방과 뇌 등 예 : 지질 풍부한 조직)의 용융을 피하기 위해, 버리지 않은 후 즉시 물 목욕으로 연결됩니다. 괞찮아superfrost 유리 슬라이드에 CE가 절을 참조하십시오. 섹션 물 속에 남아있을 수있는 시간은 파라핀의 종류 사용하고 수온 왁스에 따라 달라집니다. ° C와 우리는 37-39의 물 목욕 온도를 권장 ° C. 56-58의 융점을 가지고 HistoLab 제품 AB에서 우리 실험실 사용 파라핀 왁스 </li><li> 하룻밤 동안 실온 (RT)에 건조 슬라이드 홀더에 슬라이드를 삽입합니다. </li><li> 슬라이드는 12~24시간 동안 50 ° C에서 구워있다. 당신 브러쉬 예를 들어 사용하여 수동으로 블레이드의 물을 욕조에 섹션을 수송해야 STS없이 microtom 사용하기. </li></ol> 4. 테스트 및 Immunohistochemistry을위한 적정 절차 (애니메이션 3) 각각의 항체는 조직과 다른 세포 유형의 혼합을 포함하는 특별히 고안된 TMAs를 사용하여 표준화된 테스트 절차를 받게됩니다. 목표는 각 항체에 대한 개인과 최적화된 immunostaining 프로토콜을 평가하는 것입니다. 개미를 기반으로 한 초기 희석,일차 항체의 ibody 주식 농도가 테스트됩니다. 이 테스트 염색법의 결과는 프로토콜의 추가 dilutions 및 최적화를 안내하는 데 사용됩니다. <ol><li> 증류수로 크실렌 및 등급 에탄올의 Deparaffinization 및 수화는 immunostaining 전에 수행됩니다. </li><li> endogeneous 퍼옥시데이즈를 끄지하기 위해 차단하는 단계는 5 분 95 % 에탄올에 0.3 %에서 H 2 O 2를 수행하고 있습니다. </li><li> 열 유도 에피토프 불러오기 (HIER)는 125에서 4 분간 열원으로 압력 보일러 (Decloaking 챔버, Biocare 의료)를 사용 ° C., 검색 버퍼 산도 6에서 수행되는 끓는 완료 후 슬라이드 압력 보일러에 남아 있으며 90로 냉각하는 허용하는 ° C. HIER에 대한 총 처리 시간은 약 45 분입니다. </li><li> 어떤 결정적인 결과가 초기 테스트에서 얻어진하지 않으면 추가적인 테스트가 관찰된 염색법 패턴 5 6를 기반으로 이루어집니다. 파일럿 연구는 고전력 증폭기 높은 처리량 설정 내에서 보여주었습니다그 HIER 산도 6,하지만 같은 proteinase, 전자렌지, 높거나 낮은 산도와 버퍼에 끓는와 사전 인큐베이션 등 다른 검색 방법은 물론 사용할 수있는 가장 유용한 항원 검색. 항체 배양 시간, 항체 dilutions 및 Diaminobenzidine (DAB) 배양 시간을 변경 IHC 조건 등을 변경하여 염색법 패턴이 더 결정적인 결과를 줄 수 있습니다. </li></ol> 5. 염색법 프로그램, Autostainer 480 (써모 피셔 과학) 모든 incubations는 RT에서 수행되며,이 프로토콜은 또한 동일한 시약과 수동 설치로 사용할 수 있습니다. <ol><li> 세탁 버퍼에 린스. </li><li> 15 분 울트라 V 블록과 보육. </li><li> 세탁 버퍼에 린스. </li><li> 30 분 일차 항체와 인큐베이션. </li><li> 세차 버퍼 (X2)에 린스. </li><li> 30 분 분류 기다려봐 퍼옥시데이즈 폴리머와 인큐베이션. </li><li> 세차 버퍼 (X2)에 린스. </li><li> DAB 용액에서 개발10 분. </li><li> 세차 버퍼 (X2)에 린스. </li><li> 5 분 * 동안 Mayers hematoxylin에 Counterstaining. 진보 염색법 방법을 사용하는 경우 (예 : Mayers hematoxylin) 농도는 시간에 따라 어떠한 차별화도 필요하지 않습니다. 재귀 염색법 방법 예 : 해리스 hematoxylin는 구조를 강조하기 위해 조직에서 과잉 염료를 제거하는 차별이 필요합니다. </li><li> 수돗물에 * 린스. </li><li> 리튬 탄산 물에 씻어 1 분 * 동안 포화 용액에서 1시 5분을 희석. </li><li> 오분 *에 대한 수돗물로 씻어. </li><li> 슬라이드 등급 에탄올의 탈수 있으며, 슬라이드는 (PERTEX, Histolab) coverslipped있다 </li></ol> 모든 시약은 슬라이드 300 μl의 볼륨에 적용됩니다. * 단계 10-14은 histostaining 악기 (Autostainer XL, Leica)에서 수행하고 coverslipping가 추가로 coverslipper 시스템 (자동화된 유리 coverslipper CV5030, Leica)에서 이루어집니다. 6. 스캔하는 방법슬라이드 스캔 슬라이드 방식이 널리 사용되고있는 디지털 스캐너에 따라 달라집니다,이 프로토콜은 자동화된 스캐닝 시스템 Aperio XT (Aperio 기술)을 사용하여 슬라이드를 스캔하는 방법을 정의합니다. 대한 인간 단백질 아틀라스 설정 20x 배율에서는 조직과 세포에 대한 40x이 사용됩니다. 자동 스캔은 조직의 이질과 TMA에 포함된 다른 조직의 개수에 따라 초점 문제가 발생할 수 있습니다. <ol><li> 먼지, 접착제에서 유리 슬라이드를 닦고 coverslip과 섹션 사이의 기포가 생겼는 지 확인하십시오. 기포의 새말 슬라이드의 경우. </li><li> 랙에 슬라이드를 넣고 디지털 스캐너의 선반을 배치. 20x 배율에 TMA를 스캔하는 시간은 약 6 분 정도 소요됩니다. Aperio의 소프트웨어는 관심있는 영역을 선택하는 데 사용됩니다. 포커스 포인트 선택은 소프트웨어 내에서 자동으로 이루어집니다. 수동으로 스캔 영역과 초점 포인트의 선택도 가능합니다. </li><li> 이미지 H 후생성된으로 그것은 평가 및 IHC의 염색법의 주석에 사용될 수 있습니다. 이미지는 실험의 결과를 파일로 유지 및 토론을위한 동료에게 배포할 수 있으며 더 이상 데이터를 게시를 위해 사용됩니다. 이미지는 Aperio에서 자유롭게 사용 가능한 소프트웨어에서 볼 수 있습니다. </li></ol> 7. 어떻게 인간 단백질 아틀라스에서 즐겨찾기 단백질을 검색하려면 <ol><li> 로 이동합니다 <a href="http://www.proteinatlas.org." target="_blank">www.proteinatlas.org.</a> </li><li> 좋아하는 단백질, Ensembl ID, UniProt의 가입 번호 또는 HGNC 이름 예 : 인슐린의 이름을 입력합니다. </li><li> 요약 페이지를 입력하고 정상적인 조직과 장기 요약 아래로 스크롤합니다. 개요 췌장의 단백질 표현을 보여줍니다. </li><li> &quot;더 많은 조직 데이터&quot;를 클릭하십시오. 당신은 모든 조직은 기관별로 분류 포함 볼 수있는 정상 조직이 볼 입력합니다. </li><li> 동일한 단백질을 향해 감독이 3 항체에 대한 IHC 결과를 보려면 췌장을 클릭합니다. 안부를 보려면이미지를 클릭 췌장의 GH-해상도 이미지입니다. </li><li> 암 조직, 세포 및 인간 단백질 아틀라스 내에서 추가로 유효성 검사 데이터의 단백질 발현에 관한 추가 정보는 인간 단백질 아틀라스 웹사이트를 검색하여 찾을 수 있습니다. </li></ol> 8. 대표 결과 애니메이션 1. 어떻게 조직 microarray 생산을위한 조직을 준비하는 방법이 있습니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_1_Web.mov" target="_blank">애니메이션 하나를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 애니메이션 2. 방법 섹션 TMAs에 있습니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_2_Web.mov" target="_blank">애니메이션 2를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 애니메이션 3. immunohistochemistry 기법이 설명되어 있습니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_3_Web.mov" target="_blank">애니메이션 3 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .<img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig1.jpg" /> 그림 1. 인간 단백질 아틀라스 웁살라 이내 프로세스의 전체 구조. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig2.jpg" /> 조직 코어의 표준 길이를 표시 그림 2. 기증자 탐침 4.5 밀리 예. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig3.jpg" /> 그림 3. 수동 조직 microarrayer. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig4.jpg" /> 그림 4. 생산 TMAs의 다양한 품질의 예. () 직선 정상적으로 행과 열을뿐만 아니라 파라핀의 가장자리 사이에 충분한 공간으로 TMA를 정렬. (B) 코어의 일부로 TMA가 너무 sectioning 때 상당한 어려움을 초래 가장자리로 닫습니다. (C) TMA t 동안 구운되어 그OO은 오래 올바른 서식없이 붕괴된 TMA 결과. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig5.jpg" /> 그림 5. Hematoxylin 및 eosin의 스테인드의 TMAs. 직선 및 정렬 열과 행을 가진 () 제대로 잘라 절을 참조하십시오. 잘못되었거나 더러운 칼날을 사용하여 분할 (B) 또는 압축된 부분 (C)이 발생할 수 있습니다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig6.jpg" /> 그림 6. 항체의 적정. () 림프절의 반응 중심 전지는 배경없이 특정 세포질 염색법 (갈색 표시된)에서 발생하는 최적 titrated 항체를 보여줍니다. (B) 조직 부분이 약하 염색법을 보여줍니다. 음성 또는 약한 염색법은 일차 항체의 농도가 대상 단백질이 immunostained 조직에 존재하지 너무 낮은 경우 또는 경우에 발견됩니다. (C) 조직 섹션은 일차 항체의 너무 높은 농도로 사용하기 때문에 overstained있다. D, 이상의 누설 반응과 거짓 양성을 건너 때문에 subcellular 위치를 결정하는 어려움의 방주 컬러 결과입니다.

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우리는 공개 할게 없다.

Immunohistochemistry에 의해 멀리 TMAs에 가장 일반적으로 사용되는 응용 프로그램입니다. IHC와 TMAs의 조합 11 12보다 기본 종양 생물학 대규모 환자 동료로부터 조직 샘플을 기반으로 단백질 발현 티슈 7 8에서의 패턴 및 세포 9 10, biomarker 발견 연구의 예 높은 처리량 검사, 여러 설정에 사용할 수 있습니다 다른 phenotypes / genotypes, 차별화 단계, 진행 및 전이 13를 포함한 연구. TMAs를 사용의 장점은 큰 무리의 자료가 모두 귀중한 생물 학적 물질을 절약하고 보장보다 재현성 실험, 한번에 분석할 수있다. 또한, TMA 기술의 사용 시약 비용 및 실험실 처리 시간을 절약할 수 있습니다. TMA만이 조직의 한계가 들어 있으므로 조직 이질이 문제입니다. 조직 및 문의에 대한 질문의 유형에 따라 여러 샘플은 동일한 specime에서 필요할 수 있습니다N. 그것이 전체 조직 섹션 13 14의 표현의 정확성 높은 결과를 보여줘왔다으로 종양 조직은 각 시료 2-4 코어의 사용을 권장합니다. 조직 구성에 따라 펀치 (0.6 mm에서 2mm까지)의 지름이 조정할 수 있습니다. 조직은 복잡하고 모두 여러 가지 세포 유형, 구조 및 엑스트라 셀룰러 매트릭스로 구성되어 있습니다. 지방 변수 금액을 포함한 각기 다른 조직 유형의 구성은, 혈관, 결합 조직, 연골 등은 별도의 코어를 펀칭 및 수집에 필요한 압력에 영향을 미칩니다. 그것은 의도된 실험에 대해 정의된 조직과 TMA을 제작하기 전에, 어떤 가치가 아닌 물질에 절차의 모든 단계를 연습 중요하므로입니다. 한 TMA 블록 내에서 서로 다른 조직의 다양한 sectioning 때 블록의 구성은 높은 품질의 섹션을 습득하는 능력에 영향을 미칠 수 있습니다. CErtain 조직, 예를 들어 피부, 골수, 지방, 뇌 및 유방, 섹션 물을 욕조에 스트레칭하는 방법 effecting 질감의 차이의 영향으로 인해 어려운 TMA 블록 sectioning 방법과 다른 경도 렌더링은 칼날 등에 의해 절단되어 적용 가능한 경우 이는 따라서 유사한 기능으로 그룹 조직에 추천하는 것은 한 TMA로 지방질 풍부한 조직을 예. 암 조직의 대부분이 의미에서 동질이며, 이는 암 TMAs의 sectioning 용이하게합니다. 조직의 이질적인 유형으로 TMA를 다룰 때 microarray 코어 안정화를위한 대안 sectioning 방법을 채용 할 수 있습니다. 접착 테이프의 사용은 sectioned TMA의 코어와 가을 아웃의 손실을 피하기 위해 도움이 될 수 있습니다. 테이프가 sectioned 코어의 두께에 영향을하고 이후에도 IHC 염색법의 15 결과 수 있기 때문에 접착 테이프의 사용은 신중하게 채용해야합니다. 9x8의 인간 단백질 아틀라스에서 설정 TMA 템플릿 (표지 제외) 코어 AR전자가 사용됩니다. 이 섹션의 최대한의 번호를 얻고 블록에 걸쳐 나타나 모든 조직을 유지하는 데 중요합니다. 시약 및 스캔 시간을 절약하기 위해, 2 섹션은 9x8 최대 템플릿을있게 한 유리 슬라이드에 배치됩니다. 단백질 정보는 주요 저장소는 유니버설 단백질 자원 16에서만 약 66%은 단백질 수준에서 증거를 가지고 있고 그 중 약 20.300 검토 인간의 단백질 항목을 포함합니다. 또한 단백질 수준에서 존재의 증거가있는 유전자의 대부분을 위해, 부족 또는 단백질 기능과 표현의 배포없이 정보가 있습니다. 미래를위한 중요한 과제는 유통 패턴과 인체 조직의 다양한 형태에 이러한 알려지지 않은 단백질의 상대적인 풍요로움을 분석하는 것입니다. 이러한 Uniprot, ENSEMBL, PubMed에서 게시된 데이터와 같은 데이터베이스로부터 정보 immunohistochemical 염색법 패턴에 항체를 사용하는 경우 설정하는 가이드로 사용할 수 있습니다병동 알려지지 않은 단백질은 의도한 대상 단백질의 실제 단백질 프로파일을 나타냅니다. 또한, 여러 검증 전략은 단백질 배열, 서양 얼룩, immunofluorescence, immuno-강수량과 풀다운 실험에서 예제 항체의 기능에 대해 항체 기능을 보장하기 위해 필요합니다. 아마도 항체 기능의 검증을위한 가장 중요한 도구가 결합하여 항체를 사용하는 것입니다 즉, 두 가지 항체가 분석 특정 결과 17 비교하기 위해 동일한 대상 단백질에 별도 아닌 중복 epitopes 대해 높였다. 컴파일된 내용을 바탕으로 항체는 IHC 표준과 인간 단백질 아틀라스 프로젝트에서 35.000 항체 걸쳐 테스트 및 검증에서 경험에 따라 테스트를 거쳐 titrated 있습니다. 단백질 프로파일을 가진 모든 유전자의 20 % 이상의 경우 결합하여 항체 (같은 단백질에 비 중복 epitopes에 대한 2 개 이상 항체)의 데이터가 최고 esti를 결정하는 데 사용되었습니다해당 단백질 발현 패턴의 친구. 이점 항체는 특정 immunohistochemistry 기반의 단백질 발현 패턴을 확인을위한 궁극적인 전략을 제공합니다. 기본 검진에 포함된 다양한 조직의 수많은 교차 반응의 위험을 증가하기 때문에이 전략은 가치가있다. 그것은 특정 조직은 일반적으로 예 : macrophages, 평활근, 신장의 말초 tubules 및 간장의 hepatocytes를 더럽히는 것 배경을 보여줄 것이 더 쉽게 무너지는 것을 또한 지적되어야한다. 허위 부정하거나 부적 합한 긍정 IHC 염색법의 패턴이 발생할 수 아카이브 자료에서 가져온 조직에 대한 시간에 따른 조직 처리 기술의 변화를 포함 고려해야 할 추가 문제. 이러한 현상은 또한 대형 섹션 분석에서 발생된다. 부정과 긍정적인 두 컨트롤은 매우 중요하며 가능한 사용해야합니다. 해당 TR의 기능 분석, 강제 표현과 세포 라인과 특정 똑 다운을 포함하여 깊은 연구를 위해anscripts (siRNA 기술은) 컨트롤을 만드는 데 사용할 수 있습니다. 포르말린 고정 각종 화학 수정은, 가교 항원 18 마스킹 쉬프 기지의 가수 분해를 예를 들어 유도 이후 IHC에서 최적의 결과를 위해서는, 항원 검색 시스템을 테스트하고 사용하는 것이 중요합니다. 결론적으로 TMA 기술 및 IHC를 고용하는 항체 기반 proteomics는 대규모 단백질 발현 데이터를 생성하는 강력한 전략이다. 인간 단백질 아틀라스 프로젝트는 정상적인 인간의 조직과 암에서 인간 단백질 표현의지도를 생성하도록 설정되었습니다. 이 프로젝트의 목표는 2015 년까지 종합적인 인간 단백질 아틀라스의 첫 번째 초안을 제시하는 것입니다. 정상 장기 및 조직에 단백질 프로파일을 제공할뿐만 아니라, 이러한 노력은 또한 임상 biomarker 발견 노력을 포함한 생물 의학 연구 프로젝트에 대한 시작 지점을 제공합니다. 궁극적인 목표는 인간 게놈 시퀀스의 상단에 다음 정보 레이어를 추가하는 것입니다 그 부다양한 질병 상태의 기초 생물학의 깊은 이해에 중요한되고, 소설 진단 및 치료 도구를 개발을위한 기초를 제공하겠습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 버퍼를 씻으십시오 </td><td> 써모 피셔 과학 </td><td> TA-999-TT </td></tr><tr><td> 버퍼 pH6을 구연산 </td><td> 써모 피셔 과학 </td><td> TA-250-Pm1X </td></tr><tr><td> 항체 희석액 </td><td> 써모 피셔 과학 </td><td> TA-125-UD </td></tr><tr><td> UltraVision LP HRP 폴리머 </td><td> 써모 피셔 과학 </td><td> TL-125-HL </td></tr><tr><td> DAB 플러스 기판 시스템 </td><td> 써모 피셔 과학 </td><td> TA-125-HDX </td></tr><tr><td> 울트라 V 블록 </td><td> 써모 피셔 과학 </td><td> TA-125-UB </td></tr><tr><td> 일차 항체 향상제 </td><td> 써모 피셔 과학 </td><td> TL-125-PB </td></tr><tr><td> Mayers hematoxylin </td><td> HistolAB </td><td> 01,820 </td></tr><tr><td> PERTEX </td><td> Histolab </td><td> 00871.0500 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> 장비의 명칭 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 수동 조직 마이크로 arrayer </td><td> Estigen, Beecher의 악기 </td><td> MTA-1 </td></tr><tr><td> 폭포 마이크로톰 </td><td> 써모 피셔 과학 </td><td> Microm HM 355S </td></tr><tr><td> 자동 이미지 스캐너 </td><td> Aperio 기술 </td><td> XT </td></tr><tr><td> 자동 슬라이드 염색법 시스템 </td><td> 써모 피셔 과학 </td><td> Autostainer 480S-2D </td></tr><tr><td> deparafinization 및 탈수에 대한 자동 슬라이드 염색법 시스템 </td><td> Leica Biosystems </td><td> Autostainer XL </td></tr><tr><td> 자동 유리 coverslipper </td><td> Leica 전기사ystems </td><td> CV5030 </td></tr><tr><td> Decloaking 챔버 </td><td> Biocare 의료 </td><td> DC2008INTEL </td></tr></tbody></table>

production of tissue microarrays, immunohistochemistry staining and digitalization within the human protein atlas

조직 microarray (TMA) 기술은 여러 조직과 세포의 높은 처리량 분석을위한 수단을 제공합니다. 기술은 정상적인 인간의 조직, 암 세포 라인의 단백질 발현 패턴 글로벌 분석을 위해 인간 단백질 아틀라스 프로젝트 내에서 사용됩니다. 여기 하나의 수신자 TMA 블록으로 미세 선택한 대표적인 조직에서 검색한 1mm 코어의 조립, 제시. TMA 블록의 코어의 수와 크기는 0.6 mm 코어의 수백에 약 마흔 2mm 코어에서 다양한 수 있습니다. TMA 기술을 사용의 장점은 데이터의 대량 급속하게 실험적인 다양성을 피하기 위해 단일 ​​immunostaining 프로토콜을 사용하여 얻을 수있다. 중요한 것은, 희소한 조직의 한정된 금액이 큰 환자 동료의 분석 1 2을 허용하는 필요합니다. 약 250 연속 섹션 (두께 4 μm의)은 TMA 블록에서 잘라내어 immunohistochemical staini 사용할 수 있습니다250 가지 항체에 특정 단백질 발현 패턴을 확인할 수 NG. 인간 단백질 아틀라스 프로젝트에서는 항체는 모든 인간의 단백질을 향해 생성과 인간의 암의 20 가장 일반적인 형태를 나타내는 216 다른 환자에서 144 개인과 암 조직에서 모두 정상적인 인간의 조직에 해당하는 단백질 프로파일을 취득하는 데 사용됩니다. 유리 슬라이드에 Immunohistochemically 스테인드 TMA 섹션은 병리학자가 해석하고 immunohistochemistry의 결과에 주석을 수있는 고해상도 이미지를 만들 스캔합니다. 함께 대응 병리학 기반 주석 데이터와 이미지는 인간 단백질 아틀라스 포털 (를 통해 연구 공동체를위한 공개적으로 이용할 수 있습니다 <a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a> ) (그림 1) 3 4. 인간 단백질 아틀라스는 인체의 배포 및 단백질의 상대적인 풍요로움을 보여주는지도를 제공합니다. 현재 버전시온은 인간 게놈에 의해 인코딩된 모든 단백질의 이상 61%에 해당하는 12.238 독특한 단백질을위한 단백질 발현 데이터와 만 11 이상의 이미지가 포함되어 있습니다.

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Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

조직 microarrays 티슈 다수의 동시 접속 정보를 얻을 수있는 효율적인 방법을 허용합니다. 조직의 대표적인 부분은 하나의 파라핀 블록으로 조립됩니다. 블록의 섹션은 단백질 발현 패턴 immunohistochemistry 및 분석을 위해 사용됩니다. 디지털 스캔 데이터의 유통을 위해 해당 이미지를 생성합니다.

인간 단백질 아틀라스 이내 조직 Microarrays, Immunohistochemistry의 염색법과 디지털 제작

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

55.7K 조회수.  Uppsala University. 조직 microarrays 티슈 다수의 동시 접속 정보를 얻을 수있는 효율적인 방법을 허용합니다. 조직의 대표적인 부분은 하나의 파라핀 블록으로 조립됩니다. 블록의 섹션은 단백질 발현 패턴 immunohistochemistry 및 분석을 위해 사용됩니다. 디지털 스캔 데이터의 유통을 위해 해당 이미지를 생성합니다.

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Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

굴지 공동 침강 분석, F - 굴지에 바인딩 단백질의 분석

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

연구

생물학

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

고밀도 기능성 단백질 마이크로 어레이를 프로빙하는 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하기

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

전체-마운트 얼룩을 사용 하 여 3D 백색 지방 조직 구조의 시각화

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise subcellular localization of proteins is thus important for answering many biological questions. The quest for a robust label to identify protein localization combined with adequate cellular preservation and staining has been historically challenging. Recent advances in electron microscopy (EM) imaging have led to the development of many methods and strategies to increase cellular preservation and label target proteins. A relatively new peroxidase-based genetic tag, APEX2, is a promising leader in cloneable EM-active tags. Sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) has also advanced in recent years with the advent of cryofixation by high pressure freezing (HPF) and low-temperature dehydration and staining via freeze substitution (FS). HPF and FS provide excellent preservation of cellular ultrastructure for TEM imaging, second only to direct cryo-imaging of vitreous samples. Here we present a protocol for the cryoAPEX method, which combines the use of the APEX2 tag with HPF and FS. In this protocol, a protein of interest is tagged with APEX2, followed by chemical fixation and the peroxidase reaction. In place of traditional staining and alcohol dehydration at room temperature, the sample is cryofixed and undergoes dehydration and staining at low temperature via FS. Using cryoAPEX, not only can a protein of interest be identified within subcellular compartments, but also additional information can be resolved with respect to its topology within a structurally preserved membrane. We show that this method can provide high enough resolution to decipher protein distribution patterns within an organelle lumen, and to distinguish the compartmentalization of a protein within one organelle in close proximity to other unlabeled organelles. Further, cryoAPEX is procedurally straightforward and amenable to cells grown in tissue culture. It is no more technically challenging than typical cryofixation and freeze substitution methods. CryoAPEX is widely applicable for TEM analysis of any membrane protein that can be genetically tagged.

This protocol describes the cryoAPEX method, in which an APEX2-tagged membrane protein can be localized by transmission electron microscopy within optimally-preserved cell ultrastructure.

초구조적으로 보존된 세포 내 막 단백질 국소화의 전자 현미경 분석을 위한 CryoAPEX 방법

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical applications. Isolating primary melanocytes from skin tissues by the conventional method usually takes about 3 to 4 weeks to passage sufficiently. More importantly, the tissues used are usually newborn foreskins and it is still a challenge to efficiently isolate primary melanocytes from adult tissues. We recently developed a new isolation method for melanocytes that adds Y-27632, a Rho kinase inhibitor, to the initial culture medium for 48 h. Compared with the conventional protocol, this new method dramatically increases the yield of melanocytes and shortens the time required to isolate melanocytes from foreskin tissues. We now describe this new method in more detail using adult epidermis to efficiently culture primary melanocytes. Importantly, we show that melanocytes obtained from adult tissues prepared by this new method can function normally. This new protocol will significantly benefit studies of pigmentation defects and melanomas using primary melanocytes prepared from easily accessed adult skin tissues.

This paper reports that the addition of Y-27632 to TIVA medium can significantly increase the yield of melanocytes from adult skin tissues.

Y-27632 성인 피부 조직에서 인간 멜라닌 세포의 수율을 강화

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors from somatic cells and cumulus cell-oocyte communication. Little is known about the ovarian microenvironment and how the cytokines and steroids produced in the surrounding milieu affect follicle progression or arrest. In vitro culture of ovarian cortex enables follicles to develop in a normalized environment that remains supported by adjacent stroma. Our objective was to determine the effect of nutritional Stair-Step diet on the ovarian microenvironment (follicle development, steroid, and cytokine production) through in vitro culture of bovine ovarian cortex. To accomplish this, ovarian cortical pieces were removed from heifers undergoing two different nutritionally developed schemes prior to puberty: Control (traditional nutrition development) and Stair-Step (feeding and restriction during development) that were cut into approximately 0.5-1 mm3 pieces. These pieces were subsequently passed through a series of washes and positioned on a tissue culture insert that is set into a well containing Waymouth&#39;s culture medium. Ovarian cortex was cultured for 7 days with daily culture media changes. Histological sectioning was performed to determine follicle stage changes before and after the culture to determine effects of nutrition and impact of culture without additional treatment. Cortex culture medium was pooled over days to measure steroids, steroid metabolites, and cytokines. There were tendencies for increased steroid hormones in ovarian microenvironment that allowed for follicle progression in the Stair-Step versus Control ovarian cortex cultures. The ovarian cortex culture technique allows for a better understanding of the ovarian microenvironment, and how alterations in endocrine secretion may affect follicle progression and growth from both in vivo and in vitro treatments. This culture method may also prove beneficial for testing potential therapeutics that may improve follicle progression in women to promote fertility.

In vitro culture of bovine ovarian cortex and the effect of nutritional Stair-step diet on ovarian microenvironment is presented. Ovarian cortex pieces were cultured for seven days and steroids, cytokines, and follicle stages were evaluated. The Stair-Step diet treatment had increased steroidogenesis resulting in follicle progression in culture.

소 난소 피질 조직 배양

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic bacteria of special relevance for a wide number of hosts. P. syringae enters the plant from the leaf surface and multiplies rapidly within the apoplast, forming microcolonies that occupy the intercellular space. The constitutive expression of fluorescent proteins by the bacteria allows for visualization of the microcolonies and monitoring of the development of the infection at the microscopic level. Recent advances in single-cell analysis have revealed the large complexity reached by clonal isogenic bacterial populations. This complexity, referred to as phenotypic heterogeneity, is the consequence of cell-to-cell differences in gene expression (not linked to genetic differences) among the bacterial community. To analyze the expression of individual loci at the single-cell level, transcriptional fusions to fluorescent proteins have been widely used. Under stress conditions, such as those occurring during colonization of the plant apoplast, P. syringae differentiates into distinct subpopulations based on the heterogeneous expression of key virulence genes (i.e., the Hrp type III secretion system). However, single-cell analysis of any given P. syringae population recovered from plant tissue is challenging due to the cellular debris released during the mechanical disruption intrinsic to the inoculation and bacterial extraction processes. The present report details a method developed to monitor the expression of P. syringae genes of interest at the single-cell level during the colonization of Arabidopsis and bean plants. The preparation of the plants and the bacterial suspensions used for inoculation using a vacuum chamber are described. The recovery of endophytic bacteria from infected leaves by apoplastic fluid extraction is also explained here. Both the bacterial inoculation and bacterial extraction methods are empirically optimized to minimize plant and bacterial cell damage, resulting in bacterial preparations optimal for microscopy and flow cytometry analysis.

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

The present protocol describes a method that allows single-cell gene expression analysis on Pseudomonas syringae populations grown within the plant apoplast.

식물 조직 내 Pseudomonas syringae 유전자 발현의 단일 세포 분석

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...