이미지는 닥터 켄 던 감독 하는 인디애나 대학에서 생물학 현미경에 대 한 인디애나 센터에서 실시 되었다. Stereotaxic 장치 설계 및 마크 Soonpaa, 웰 스 소아 연구 센터에 의해 만들어진 프로토 타입 이다. 이 작품은 NIH/R01DK097837-09 (NC)에 의해 지원 되었다, NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC), MPN 연구 재단 (NC)와 CTSI 공동 프로젝트 IUSM/노 틀 담 (NC).

동물의 사용을 포함 하는 모든 절차는 동물 관리 및 사용 위원회의 인디애나 대학의과의 인증 수행 했다. 확인 작업을 수행 하는 국가의 동물 실험에 법안을 준수 합니다.
1. Mx1CreRBPJ-/- 받는 사람 마우스의 준비
<ol><li>Mx1-Cre+ RBPJlox/lox 쥐10 Mx1-Cre를 얻을 마우스를 크로스 RBPJlox/lox 쥐12 양수와 Mx1-Cre 부정적인 RBPJlox/lox littermates 컨트롤로 사용 하. PCR10유전자 형을 확인 합니다.</li>
	<li>6-8 주를 사용 하 여-오래 된 Mx1Cre+/RBPJlox/lox 및 Mx1Cre-/RBPJlox/lox 마우스 polyI:C 유도 수행 하려면.</li>
	<li>
PolyI:C 200 µ g i.p. Cre+ 및 Cre- 마우스에 주사. 한 polyI:C 주사 3 일 첫 주 동안 매일 제공 합니다. 한 polyI:C 주사 두 번째 주, 이전 주입 (총에서 4 개의 주사) 후 7 일 제공 합니다.
	<ol>
<li>RBPJKO를 사용 하 여 (Mx1Cre 유도+/RBPJlox/lox)와 RBPJWT (유도 Mx1Cre-/RBPJlox/lox) 받는 마지막 polyI:C 주입 후 3 주 사람으로 쥐. 참고: 그것은 주입 후 3 주 pI: pC에 의해 유도 된 마우스를 사용 하 여 권장. PolyI:C에 의해 발생 하는 IFNα 응답 BM, HSC의 immunophenotypic 확장 결과에 큰 변화를 유도 하 고 주변 혈액16,17에 성숙한 창시자의 출력을 감소. 조 혈 하위 집합의 표현은 정규화 된 3 주 후 주입 및 쥐 염증의 혼란 효과 없이 이용 될 수 있다. 이 유도 프로토콜은 RBPJ에 대 한 최적화 되었습니다. 유도 프로토콜 구문, 따라 달라질 수 있습니다 다른 유전자를 삭제 하 고 삭제를 확인 합니다. 우리는 총 4 개의 polyI:C 주사 후 RT-PCR에 의해 loxP 사이트 사이 RBPJ 영역의 ~ 100% 삭제 확인.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 리스 EGFP 기증자의 골 수 세포 이식에 대 한 준비
<ol><li>한 리스 EGFP 마우스 (이산화탄소 뒤에 자 궁 경부 전위)를 안락사 1 또는 2에 이식 하기 전에 h.</li>
	<li>70% 에탄올과 동물 몸 표면 스프레이.</li>
	<li>수술가 위를 사용 하 여 두 다리 발목 주위에 피부 절 개 하 고 수술 집게로 당겨 떨어져 피부와 함께 깨끗 한 근육 조직을 노출 하는 모피.</li>
	<li>수술가 위를 사용 하 여 가능한 많은 근육 다리에서 제거. 한가 위를 사용 하 여 (무릎과 발목 관절)에서 뼈를 잘라 하 고 화관에서 tibias 거 즈 스폰지를 사용 하 여 모든 나머지 근육 조직의 청소. (2 개의 화관과 두 tibias) 뼈 포함 된 DMEM 10 %6 잘 플레이트에 배치 FBS.</li>
	<li>10 mL 감기 2 mM EDTA PBS와 피펫으로 박격포에 뼈 골 셀을 단일 셀 서 스 펜 션으로 셀을가지고 크 러시. 또는, 1 mL 주사기 각 측에서 2 mM EDTA PBS 3 시간 뼈를 플러시.</li>
	<li>15 mL 원심 분리기 관으로 70 µ m 필터를 사용 하 여 골 수 세포를 필터링 합니다. 2-3 mL PBS의 필터를 씻어. 460 x g에서 10 분 아래로 셀 회전, resuspend 10 ml 신선한 DMEM의 셀 10 %FBS.</li>
	<li>hemocytometer에 골 셀을 1.5 x 107 셀/mL IMDM에 없이 혈 청 농도 조정 합니다. 200 µ L의 양으로 동물 당 3 x 106 셀을 사용 합니다. 총 BM의 약 1/3 세포는 골수성 GFP + 셀. 주입에 대 한 준비까지 얼음에 셀을 둡니다. 105 셀 x 0.5를 사용 하 여 GFP 식을 FACS9에 의해 결정.</li>
</ol>3. RBPJKO 쥐로 리스 GFP 셀 골 수 이식
<ol><li>받는 사람 마우스 원형에 제 지. 감마 방사선의 치명적인 복용량을 가진 쥐를 비추는 (1200 Rad) Cs 137 irradiator에. 분할 복용 프로토콜을 사용 하 여: 저녁에 900 래 드 300 래 드 뒤 다음날 아침 (16 h 떨어져).</li>
	<li>치명적 방사능된 RBPJWT 및 RBPJKO 받는 사람 마우스 이식 방사선의 두 번째 투여 후 5-6 h. BM 주사 셀 리스 EGFP 쥐 꼬리 정 맥 주입 (수확 제 2에 있는 셀에 대 한 세부 정보 참조) 동물 을 통해 당 3 x 106 세포의 농도에서에서 수확.</li>
	<li>다른 시간 지점에서 IVFM에 의해 이식된 생쥐의 독립적인 동료 이미지: 24 h, 그리고 2, 4, 6, 설명 대로 아래 주 (4 & 5 vivo에서 이미징 절차에 대 한 섹션 참조).</li>
</ol>4. 수술 준비 Intravital 이미징
<ol><li>수술 기구를 소독. 두 집게 (한 직선, 각도 하나), 좋은 좋은 위과 바늘의 한 쌍의 한 쌍. 모든 공급 절차에 필요한 요원 영역을 준비 합니다.</li>
	<li>마우스에 게 케 타 민 칵테일 마 취의 IP 주사 (Xylazine 2.5-5 m g/k g + acepromazine 1.0-2.5 m g/k g + 케 타 민 90-100 mg/kg) 26-28 G 바늘 주사기를 사용 하 여.  동물은 매 15 분 절차 동안 모니터링 될 것 이다 하 고 마 취 원래 복용량의 ¼에 필요에 따라 보완 될 것입니다.</li>
	<li>적절 한 열 소스 (37 ° C가 열 패드가 열 패드와 직접적인 접촉에서 보호 동물)에 마우스를 놓고 시각적으로 호흡 속도 모니터링 합니다.</li>
	<li>발가락을 사용 하 여 반사 꼬집어 응답을 확인 합니다. 동물 인지 확인 완전히 마 취 수술 절차를 시작 하기 전에.</li>
	<li>26-28를 사용 하 여 주고 쥐 형광 혈관 마커 (Dextran, 20 mg/mL 해결책의 100 μ)의 꼬리 정 맥 주입 바늘 주사기 게이지.</li>
	<li>두 눈에 수 의사 눈 연 고를 적용 합니다. 클립을 작은 전기 면도기와 동물의 머리의 등 쪽 표면. 제 모 크림을 제거 하 여 다음 식 염 수로 씻어 5 분 사용 거 즈 스폰지에 크림을 적용 합니다. 70% 알코올 면봉을 사용 하 여 깨끗 한 두 피를 준비.</li>
	<li>기본 등 두개골 표면 노출로 두 피에 작은 중간 피부 절 개 (10-20 m m)을 잘 집게와가 위를 사용 합니다. 5-0 수술 실크를 사용 하 여 피부 절 개를 만드는 영상에 대 한 calvarium를 노출 하는 플랩의 각 측면에 두 개의 숙박 봉합 배치.</li>
	<li>그들의 뒤에 쥐를 놓고 현미경 기름을 가득 유리 하단 접시에 노출 된 두 피를 잠수함. Mutiphoton 룸 이미징에 동물을 전송 합니다.</li>
	<li>동물에 현미경 단계 목표 위에 유리 접시에 위치 하는 calvarium와 놓고는 37 다음 커버° C가 열 패드 (동물 열와 직접적인 접촉에서 보호 되어야 합니다).</li>
</ol>5. Vivo에서 마우스 Calvarium의 고해상도 영상
<ol><li>Multiphoton 이미징에 대 한 수정 하는 거꾸로 confocal 시스템을 사용 하 여 ( 자료 표참조). 다음 제조업체의 지침 조정 830에 2 광자 레이저 nm, 20 장소 X W, 나 0.95 렌즈 현미경 코 조각에 레이저 빔 정렬 확인. 참고: 똑바로 현미경 시스템은 가장 일반적으로 이러한 연구에 대 한 사용 하지만 거꾸로 multiphoton 시스템 또한 활용 될 수 있습니다. 본이 연구에서는 사용자 지정 설계 된 atraumatic stereotaxic 장치 사용 되었다. 똑바로 현미경 시스템에 대 한 몇 가지 상용 stereotaxic 장치 있지만 마우스 두개골 확보 겨냥 하는 거꾸로 한 현미경 시스템에 대 한 아무 상업적으로 이용 가능한 stereotaxic 장치가입니다. 사용자 지정 stereotaxic 장치에 대 안으로, 두개골 위의 안정성에 대 한 다양 한 테이프 또는 접착제 방법을 활용 하 고 목표 위치에 보안 수 있습니다.</li>
	<li>이미지 수집 소프트웨어를 엽니다. "수집 설정"에서 패널 한 방향 스캐닝 모드 선택 됩니다 확인 합니다. 4 μ/픽셀, 512 x 512 픽셀 프레임 속도 스캔 속도를 설정 하 고 1.5로 확대. 20 X W 나 0.95 목표는 nosepiece에서 렌즈에 맞게 사용할 수 있는 렌즈의 목록에서 선택 합니다.</li>
	<li>"이미지 수집" 제어판에서 "염료" 목록에 액세스 하 고 "두 광자"를 선택 합니다. "빛 경로 & 염료" 창 열고 레이저 단위 2에서에서 확인란을 선택 하 여 DM690-980 여기 DM. 2 P 레이저 셔터 열기를 선택 합니다. "현미경 컨트롤러" 창에서 RDM690 미러를 선택 합니다.</li>
	<li>"피 램프"를 선택, B/G 피 필터 큐브를 선택 하 고 목표 혈관 흐름을 사용 하 여 참조로 중앙 정 맥 (a)와 (b) (그림 2A) 관상 봉합의 분기 calvarium 골 틈새를 시각화 하는 표본에 집중.</li>
	<li>
비 descanned 모드를 사용 하 여 이미지를 수집 합니다. 3 외부 감지기 선택: PMT detector1 콜라겐의 SHG 신호 수집 하 (방출 필터-430/100 nm), GaAsP detector2 수집 GFP 신호 (방출 필터-525/50) 및 GaAsP detector3 TRITC-dextran의 신호를 수집 하 (방출 필터-605/90 nm).
	<ol>
<li>스캔 속도 4μs/phototoxicity를 최소화 하기 위해 아무 평균 픽셀에서 이미지를 수행 합니다. 최소한의 채도와 검출기의 전체 동적 범위를 사용 하도록 조정 일정 레이저 파워 및 검출기 이득에서 이미지를 수집 합니다.</li>
		<li>Calvarium 골 수의 6 지역에서 조직 (60 x 1 μ m Z-스택)의 깊이 통해 섹션의 시리즈를 수집 합니다. 1 μ m의 단계 크기 설정을 사용 하 여, 확대/축소 1.5 및 512 x 512 픽셀 프레임 크기 (423 µ m x 423 µ m). 참고: 전체 한 마우스를 이미지 하는 데 필요한 총 시간 1-1.5 h입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6입니다. 정량 분석
<ol><li>제조업체의 지침에 따라 전용된 3D/4d 이미지 정량 및 시각화 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 정량 및 3D 개조를 수행 ( 자료 표참조). Z-스택 최대 강렬 투 상 (MIP), 활용 하는 차원에서 알파 혼합 또는 그림자 투영 볼륨 렌더링 알고리즘을 대화식으로 시각화.</li>
	<li>사용 하 여 GFP 셀 세그먼트는 "자리 개체 세그먼트화 모듈". 스택 산술 처리 (채널 빼기) 거짓 긍정적인 수 GFP 셀 (녹색 및 빨강 채널에서 강한 형광을 표시 하는 뼈 세포의 신호 제거)를 제거 하기 위해 적용 됩니다.</li>
	<li>맥 관 구조와 뼈 표면 표면 세그먼트화 모듈을 사용 하 여의 세분화를 수행 합니다. 필요한 경우, "표면에 반점의 거리" 라고 하는 X-긴장 알고리즘을 적용 하 여 위의 표면에 세포의 거리를 계산 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Carlesso, N., Cardoso, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+regulatory+niches+and+their+role+in+normal+and+malignant+hematopoiesis.">Stem cell regulatory niches and their role in normal and malignant hematopoiesis.</a> Curr Opin Hematol. 17 (4), 281-286 (2010).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+haematopoietic+stem+cell+niche+at+a+glance.">The haematopoietic stem cell niche at a glance.</a> J Cell Sci. 124 (PT 21), 3529-3535 (2011).</li><li>Calvi, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche.">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).</li><li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells.">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+haematopoietic+stem+cell+niche+and+control+of+the+niche+size.">Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size.</a> Nature. 425 (6960), 836-841 (2003).</li><li>Mendez-Ferrer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+and+haematopoietic+stem+cells+form+a+unique+bone+marrow+niche.">Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche.</a> Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).</li><li>Naveiras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone-marrow+adipocytes+as+negative+regulators+of+the+haematopoietic+microenvironment.">Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment.</a> Nature. 460 (7252), 259-263 (2009).</li><li>Scheiermann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenergic+nerves+govern+circadian+leukocyte+recruitment+to+tissues.">Adrenergic nerves govern circadian leukocyte recruitment to tissues.</a> Immunity. 37 (2), 290-301 (2012).</li><li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+fluorescent+granulocytes+and+macrophages.">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 716-726 (2000).</li><li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+knockout+of+transcription+factor+recombination+signal+binding+protein-J+reveals+its+essential+role+in+T+versus+B+lineage+decision.">Inducible gene knockout of transcription factor recombination signal binding protein-J reveals its essential role in T versus B lineage decision.</a> Int Immunol. 14 (6), 637-645 (2002).</li><li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem/progenitor+cells+in+their+niche.">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-dependent+repression+of+miR-155+in+the+bone+marrow+niche+regulates+hematopoiesis+in+an+NF-kappaB-dependent+manner.">Notch-dependent repression of miR-155 in the bone marrow niche regulates hematopoiesis in an NF-kappaB-dependent manner.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 51-65 (2014).</li><li>Miyamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+or+lymphoid+promiscuity+as+a+critical+step+in+hematopoietic+lineage+commitment.">Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment.</a> Dev Cell. 3 (1), 137-147 (2002).</li><li>Luc, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down+Regulation+of+Mpl+marks+the+transition+to+lymphoid-primed+multipotent+progenitors+with+gradual+loss+of+granulocyte-monocyte+potential.">Down Regulation of Mpl marks the transition to lymphoid-primed multipotent progenitors with gradual loss of granulocyte-monocyte potential.</a> Blood. 111 (7), 3424-3434 (2008).</li><li>Suzuki, M., Moriguchi, T., Ohneda, K., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+the+Gata1+gene+hematopoietic+enhancer+to+erythroid+differentiation.">Differential contribution of the Gata1 gene hematopoietic enhancer to erythroid differentiation.</a> Mol Cell Biol. 29 (5), 1163-1175 (2009).</li><li>Essers, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFNalpha+activates+dormant+haematopoietic+stem+cells+in+vivo.">IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo.</a> Nature. 458 (7240), 904-908 (2009).</li><li>Pietras, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-entry+into+quiescence+protects+hematopoietic+stem+cells+from+the+killing+effect+of+chronic+exposure+to+type+I+interferons.">Re-entry into quiescence protects hematopoietic stem cells from the killing effect of chronic exposure to type I interferons.</a> J Exp Med. 211 (2), 245-262 (2014).</li><li>Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+4-dimensional+tracking+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+adult+mouse+calvarial+bone+marrow.">In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow.</a> J Vis Exp. (91), e51683 (2014).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜 Intravital 형광 현미경 검사 법에 의해 최적화 engraftment 조 혈 모 세포의 활동을 연구 하는 실험 설계를 설명 합니다. 이 연구에서는 골수성 조상 세포 WT BM 또는 노치 신호 결함이 있는 BM의 확장 했다 추적 뼈 calvarium에서 다음 리스 GFP 긍정적인 골수성 세포 BMT 후 받는 사람 RBPJWT 또는 RBPJKO로. 이 접근은 주소 비슷한 질문에 예를 들면 적용 될 수 있는 모델로 제안: 나) 확장과 다른 계보의 ...

Intravital multiphoton 형광 현미경 검사 법 (IVFM)는 강력한 이미징 기술을 고해상도, 실시간 이미징 조직 깊이의 최대 허용 하는 조직에 따라 1 mm. 마우스 calvarium에 적용 하면, 그것은 60-100 μ m11을 비-침략 적 방법으로 BM 내의 조 혈 모 세포의 행동을 관찰을 허용. 이 방법은 여기 engraftment 정식 노치 신호 부족 BM의 RBPJ 녹아웃 쥐에 있는 정상적인 골수성 창시자의의 활동을 결정 하기 위해 사용 됩니다.
우리 그룹에서 최근 작품 그 결함이 정식 노치 신호 myeloproliferative 같은 질병12BM microenvironment 리드에서 설명 했다. 노치 신호 손실 RBPJ, 하류 신호, 재결합10유도 Mx1-Cre를 사용 하 여 정식 노치의 중요 한 녹음 방송 요인의 DNA 묶는 도메인의 조건부 삭제에 의해 얻은. 이 연구에서는 Mx1-Cre/RBPJlox/lox 마우스 모델 사용 되었다. RBPJ의 DNA 묶는 주제의 조건부 삭제에서 모든 노치 수용 체 신호 손실 발생 합니다. Mx1-Cre 모델, Cre 식 polyI:C 여러 기관의 stromal 구성 요소에서 뿐만 아니라 혈액 세포에서 타겟된 유전자 삭제의 유도에 결과의 관리에 따라 활성화 Mx1 발기인에 의해 구동 됩니다 포함 한 BM, 비장 및 간.
Mx1-Cre+/RBPJlox/lox ,lox/lox 마우스 Mx1-Cre-/RBPJ polyI:C (hereon 표시 된 RBPJKO와 RBPJWT, 각각)와 유도 방사능 치명적 이었고 정상, 야생 타입 조 혈 모 세포 이식. 이식 후 4 주부터 시작 해 서, RBPJKO 받는 사람 상당한 leukocytosis로 선행 개발. RBPJKO 마우스 골수성 창시자의 증가 비율에에서 제시는 BM 주 8에서 이식 후 고 나중 시간 지점에서 비록 4-6 주에 BM의 분석 그들의 골수성 세포 콘텐츠 제어 RBPJWT에 비해 눈에 띄는 차이 공개 하지 않았다 받는 사람. BM microenvironment myeloproliferative 표현 형의 개시에 직접적인 영향을 미쳤다 Mx1-Cre 다른 조 혈 기관, 표현 된다 사실 함께이 관찰, 질문을 발생 합니다.
BM 질병 개발의 중요 한 초기 사이트 였는 지 여부를 확인 하려면 마우스 calvarium의 IVFM와 BM 이식 (BMT), RBPJ 노크 아웃 모델 계보 추적 시스템 조합에 사용 되었다. 유전자 변형 마우스 특정 lysozyme 발기인 (리스-GFP)9 의 통제 EGFP 표현 BM BMT 후 이미징 동안 구상 될 수 있는 기증자 세포를 얻기 위해 사용 되었다. Lysozyme 식이 골수성 세포 특정 고 리스-GFP 성숙한 granulocyte13일반적인 골수성 조상 (CMP)에서 셀을 표시 합니다.
다른 시간 지점에서 BM의 IVFM는 리스 GFP 셀 BM의 RBPJWT 및 RBPJKO 받는 사람에 게 마찬가지로 홈 하지만 확장 및 BM의 RBPJKO 받는 사람에서 빨리 engrafted 시연 했다. 이 차이 이전 시간 시점 (주 2) 극적인 되었고 시간이 지남에 따라 감소 (주 4 및 6). 그러나, 이러한 나중 시간 지점에서 동일한 받는 사람에 조 혈 구획의 평가 골수성 세포는 샌드위치에 순환 수에 꾸준히 증가 보였다 고 셀의 증가 출력을 나타내는 RBPJKO 마우스의 비장에 순환에 BM. 리스-GFP 셀 지역화는 BM에 이식된 생쥐의 6 주에의 분석 컨트롤에서 보다 RBPJKO microenvironment에 골수성 세포는 맥 관 구조에서 거주 했다 밝혔다.
샨 다, 이러한 특정 동물 모델 IVFM의 조합 RBPJKO BM microenvironment 골수성 세포의 engraftment 역학에서 통찰력 제공. 실험 설계 및 여기서 설명 하는 양적 접근 비슷한 질문을 해결 하기 위해 적용할 수 있는 패러다임으로 제시 된다. 예를 들어 모델, RAG1 GFP14 또는 Gata1 GFP15 마우스 추적 다른 셀 특정 계보를 사용 하 여 림프의 동작에 따라 수 또는 erythroid 창시자는 BM에 각각.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1033">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ketamine cocktail</td>
			<td style="width:167px;">IU School of Medicine</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:511px;">Ketamine 90-100mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TRITC dextran</td>
			<td style="width:167px;">Tdb Consultancy</td>
			<td style="width:139px;">TD150-100mg</td>
			<td>Other color dextran may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Andis hair trimmer</td>
			<td style="width:167px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:139px;">CLP-323 75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gauze sponge</td>
			<td style="width:167px;">Med Vet International</td>
			<td style="width:139px;">PK224</td>
			<td>4-ply, 2X2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nair depilatory cream</td>
			<td style="width:167px;">Commercial store</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Saline</td>
			<td style="width:167px;">Med Vet International</td>
			<td style="width:139px;">RXSAL-POD1LT</td>
			<td>0.9% Sodium Chloride poly bottle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insulin syringe</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">14-826-79</td>
			<td>28g, 1/2cc</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:139px;">00108-11, 00109-11</td>
			<td>straight forcep, angled forcep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scissor</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:139px;">15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Needle holder</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:139px;">12002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5-0 silk suture</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">MV-682</td>
			<td>Other non-absorbable suture may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">WillCo- glass bottom dish</td>
			<td style="width:167px;">WillCo</td>
			<td style="width:139px;">GWSt-5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Optical microscope oil</td>
			<td style="width:167px;">Leica</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stereotaxic stage insert&#160;</td>
			<td style="width:167px;">IU School of Medicine</td>
			<td style="width:139px;">Custom design</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Olympus FV1000 confocal microscope system&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Olympus</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Olympus XLUMPLFL 20xW, NA 0.95 objective&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Olympus</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Small heating pad</td>
			<td style="width:167px;">Commercial store</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>Zoo Med reptile heating pad</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Imaris 8.1 imaging software</td>
			<td style="width:167px;">Bitplane</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>3/4 D Image Visualization and Analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining intravital fluorescent microscopy (ivfm) with genetic models to study engraftment dynamics of hematopoietic cells to bone marrow niches

증거를 증가 일반 조 전문된 세포 벽 중요 한 조 혈 줄기 세포 (HSC) 기능1,2변조를 포함 하는 BM, 뚜렷한 microenvironmental 신호에 의해 규제 됩니다 나타냅니다. 실제로, 조 혈 microenvironment의 더 상세한 그림은 이제 신흥에 endosteal와 내 피 틈새 형성 정상 HSC와 그들의 자손3,4,5의 규칙에 대 한 기능 단위 . 새로운 연구는 adipocytes, 유지 하 고 HSC 기능6,,78조절에 신경 세포, 혈관 주위 세포의 중요성을 계시 했다. 또한, 다른 계보, 즉 골수성과 림프 성 세포, 가정에서 세포 및 BM microenvironment 내의 특정 틈새에 있는 증거가 있다. 그러나, BM microenvironment 및 그것의 거주자의 완전 한 매핑 진행 중에서입니다.
계보 특정 형광 표식 또는 부족 BM 틈새의 특정 셀에 선택한 분자 유전자 조작 생쥐를 표현 하는 유전자 변형 마우스 긴장 지금 사용할 수 있습니다. 노크 아웃 및 혈통 추적 모델, 이식 방법, 함께에서 제공 기회 "틈새" 특정의 역할에 대 한 지식을 구체화를 세포 HSC, 같은 정의 된 조 혈 인구에 대 한 B-세포, T 세포, 골수성 세포와 erythroid 셀입니다. 이 전략은 calvarium의 2 광자 현미경의 사용을 병합 하 여 더 potentiated 될 수 있습니다. 제공 함으로써 고해상도 이미징 vivo에서 및 BM calvarium의 3 차원 렌더링, 우리가 지금 정확 하 게 위치 특정 조 혈 하위 집합은 BM에 가정과 평가 시간이 지남에 그들의 확장의 활동을 확인할 수 있습니다. 여기, 리스-GFP 유전자 변형 마우스 (골수성 세포 표시)9 , RBPJ (정식 노치 신호 부족 한) 녹아웃 쥐10 사용 됩니다 IVFM와 함께에서 노치 결함이 BM microenvironment 골수성 세포 engraftment 결정 하.

2 RBPJKO 및 2 RBPJWT 받는 사람의 동료 다른 시간 지점에서 개별 이미징 세션에 몇 군데 있었다: 24 h와 2, 4 및 6 주 (워크플로 그림 1A일러스트) BM 리스-GFP 세포의 이식 후.
각 마우스에서 이미지 (그림 2A,)중앙 정 맥 그리고 관상 봉합 (그림 2A, b)의 분기점에 관하여 그들의 위치에 의?...

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Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)는 calvarium의 유도 및 조 혈 모 세포의 골 수 (BM) 틈새로 engraftment 연구 유전 동물 모델에 적용 됩니다.

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)를 결합 하 여 유전자 모델 골 틈새에 조 혈 모 세포의 Engraftment 역학을 공부 하

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

combining-intravital-fluorescent-microscopy-ivfm-with-genetic-models

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

7.9K 조회수.  Indiana University School of Medicine. Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)는 calvarium의 유도 및 조 혈 모 세포의 골 수 (BM) 틈새로 engraftment 연구 유전 동물 모델에 적용 됩니다.

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Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. However, the analysis and quantification of cellular localization is difficult, as in many cases it relies on manual counting, thus bearing the risk of introducing a rater-dependent bias and reducing interrater reliability. Moreover, it is often difficult to judge whether the co-localization between two cells results from random positioning, especially when cell types differ strongly in the frequency of their occurrence. Here, a method for unbiased quantification of cellular co-localization in the bone marrow is introduced. The protocol describes the sample preparation used to obtain histological sections of whole murine long bones including the bone marrow, as well as the staining protocol and the acquisition of high-resolution images. An analysis workflow spanning from the recognition of hematopoietic and non-hematopoietic cell types in 2-dimensional (2D) bone marrow images to the quantification of the direct contacts between those cells is presented. This also includes a neighborhood analysis, to obtain information about the cellular microenvironment surrounding a certain cell type. In order to evaluate whether co-localization of two cell types is the mere result of random cell positioning or reflects preferential associations between the cells, a simulation tool which is suitable for testing this hypothesis in the case of hematopoietic as well as stromal cells, is used. This approach is not limited to the bone marrow, and can be extended to other tissues to permit reproducible, quantitative analysis of histological data.

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

조혈 세포의 자동화 된 정량화 - Undecalcified 뼈의 조직 학적 이미지에서 기질 세포 상호 작용

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

연구

발생학

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase - a clinically approved and readily available thrombolytic drug &#8211; clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.

Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.

효소 방법은 응고 골수 샘플에서 중간 엽 줄기 세포를 구출

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel cell population specifically selected for growth in human serum supplemented medium. These cells are characterized by morphological, phenotypic, and molecular features distinct from MSCs and we named them Mesodermal Progenitor Cells (MPCs). MPCs are round, with a thick highly refringent core region; they show strong, trypsin resistant adherence to plastic. Failure to expand MPCs directly revealed that they are slow in cycling. This is as also suggested by Ki-67 negativity. On the other hand, culturing MPCs in standard medium designed for MSC expansion, gave rise to a population of exponentially growing MSC-like cells. Besides showing mesenchymal differentiation capacity MPCs retained angiogenic potential, confirming their multiple lineage progenitor nature. Here we describe an optimized highly reproducible protocol to isolate and characterize hBM-MPCs by flow cytometry (CD73, CD90, CD31, and CD45), nestin expression, and F-actin organization. Protocols for mesengenic and angiogenic differentiation of MPCs are also provided. Here we also suggest a more appropriate nomenclature for these cells, which has been re-named as "Mesangiogenic Progenitor Cells".

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

Here we describe an optimized, highly reproducible protocol to isolate Mesodermal Progenitor Cells (MPCs) from human bone marrow (hBM). MPCs were characterized by flow cytometry and nestin expression. They showed the ability to give rise to exponentially growing MSC-like cell cultures while retaining their angiogenic potential.

사람 골수에서 분리 Mesangiogenic 전구 세포 (MPC와)

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema and diminished visual acuity. However, human CECs are prone to compromised proliferative potential. Furthermore, stimulation of cell growth is often complicated by gradual endothelial-mesenchymal transition (EnMT). Therefore, understanding the mechanism of EnMT is necessary for facilitating the regeneration of CECs with competent function. In this study, we prepared a primary culture of bovine CECs by peeling the CECs with Descemet's membrane from the corneal button and demonstrated that bovine CECs exhibited the EnMT process, including phenotypic change, nuclear translocation of &#946;-catenin, and EMT regulators snail and slug, in the in vitro culture. Furthermore, we used a rat corneal endothelium cryoinjury model to demonstrate the EnMT process in vivo. Collectively, the in vitro primary culture of bovine CECs and in vivo rat corneal endothelium cryoinjury models offers useful platforms for investigating the mechanism of EnMT.

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

A primary culture of bovine corneal endothelial cells was used to investigate the mechanism of corneal endothelial-mesenchymal transition. Furthermore, a rat corneal endothelium cryoinjury model was used to demonstrate corneal endothelial-mesenchymal transition in vivo.

생체 외 및 생체 내 모델에서 각막 내피 세포 - 중간 엽 전이를 공부하기

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy

We have previously reported on the generation of plasma membrane vesicles (PMVs) through the mechanical extrusion of mammalian cells. The fusion of PMVs with mitochondrial deficient Rho0 cells restored mitotic activity under normal culture conditions. Atherosclerosis, type 2 diabetes, Alzheimer&#39;s disease, and cancer are age-related diseases that have been reported to be associated with multiple mechanical and functional defects in the cytosol and organelles of a variety of cell types. Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) represent a unique cell population from the bone marrow that possess self-renewal capabilities while maintaining their multipotency. The supplementation of senescence cells with young cytoplasm from autologous BMSCs via the fusion of PMVs provides a promising approach to ameliorate or even reverse age-associated phenotypes. This protocol describes how to prepare PMVs from BMSCs via extrusion through a polycarbonate membrane with 3 &#181;m pores, determine the existence of mitochondria and examine the maintenance of membrane potential within PMVs using a confocal microscope, concentrate PMVs by centrifugation, and carry out the in vivo injection of PMVs into the gastrocnemius muscle of mice.

Age-related diseases are associated with multiple defects in components of the cytoplasm. Here, we present a protocol to prepare plasma membrane vesicles from bone marrow mesenchymal stem cells. This technique could potentially be used as a means of cytoplasm replacement therapy to ameliorate or even reverse age-associated phenotypes.

잠재적 인 세포질 대체 요법을위한 골수 간엽 줄기 세포로부터의 혈장 막 소포의 제조

We have previously reported on the generation of plasma membrane vesicles (PMVs) through the mechanical extrusion of mammalian cells. The fusion of PMVs ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result in a series of bone metabolic diseases, including osteoporosis. To develop pharmaceutical targets for the prevention of pathological bone mass loss, the mechanisms by which osteoclasts differentiate from precursors must be understood. The ability to isolate and culture a large number of osteoclasts in vitro is critical in order to determine the role of specific genes in osteoclast differentiation. Inactivation of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 (TORC1) in osteoclasts can decrease osteoclast number and increase bone mass; however, the underlying mechanisms require further study. In the present study, a RANKL-based protocol to isolate and culture osteoclasts from mouse bone marrow and to study the influence of mTORC1 inactivation on osteoclast formation is described. This protocol successfully resulted in a large number of giant osteoclasts, typically within one week. Deletion of Raptor impaired osteoclast formation and decreased the activity of secretory tartrate-resistant acid phosphatase, indicating that mTORC1 is critical for osteoclast formation.

This manuscript describes a protocol to isolate and culture osteoclasts in vitro from mouse bone marrow, and to study the role of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 in osteoclast formation.

RANKL 기반 Osteoclast 문화 분석 결과의 마우스 골 수 mTORC1 Osteoclast 형성에의 역할을 조사 하

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

절연, 문화, 및 골 수 기질 세포와 생쥐에서 Osteoclast 창시자의 차별화

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

성인 Zebrafish 부상 모델 뼈 조직 재생에 Prednisolone의 효과 연구

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

자외선-C (UV-C) 손상에 응하여 1 차 마우스 안구 표면 세포/줄기 세포에 있는 산화 손상의 평가

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...