이 작품은 Overstreet 재단에서 기금에 의해 지원되었다.

1. Basic은 세포 배양을하기 전에 설정 <ol><li> NeuroCult NSC 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 중간 및 NeuroCult NSC 확산 보충제는 전체 NSC 매체를 만들기 위해, 각각 9시 1분 비율로 섞여있다. </li><li> 37 ° C의 물 목욕은 매체를 워밍업하는 데 사용됩니다. </li><li> 더위 inactivated 소태아 혈청 (FCS)의 적절한 금액은 해동됩니다. </li><li> 표피 성장 인자 (10 μg / ML에서 EGF), 기본 fibroblastic 성장 인자 (10 μg / ML에서 B-FGF)와 인산의 0.2 % 헤파린 용액을 포함하여 주식 성장 인자 솔루션의 적절한 양은 염분이 (PBS) 해동되는 버퍼. </li><li> 조직 문화 flasks (T25, T75 또는 &amp; T175)은 NSC 확장과 분화를 위해 필요합니다. </li><li> 조직 문화는 96와 24도 접시를 취급하고 유리 coverslips는 정렬된 세포를 도금을 위해 필요합니다. </li></ol> 2. NSCs의 분리 및 확장 (Passaging) <ol><li> 신경 줄기와 progenitors은 생쥐 B로부터 격리되고 확장되는별도의 프로토콜을 1, 2, 3에서 설명된대로 비가. </li><li> neurospheres이 (중 기본 또는 passaged neurospheres) subculture (직경 150-200 μm의)에 대한 준비가되면, 매체 포함된 분야는 적당한 크기로 무균 조직 배양 튜브에 양도하고, 5 분 800 RPM (110g)에 centrifuged합니다 상온에서. </li><li> 뜨는 매체가 제거되고 분야는 미리 예열 0.05 % 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 중 1 ML에서 다시 정지됩니다. </li><li> 2-3 분 37 ° C 물 목욕의 인큐베이션 후, 대두 트립신 억제제의 동일한 볼륨은 트립신 활동을 중지 세포 현탁액에 추가됩니다. </li><li> 트립신 완전히 inactivated되었는지 확인하려면 세포 현탁액이 부드럽게 내려 3-5 시간을 pipetted하고있다. </li><li> 5 분, 800 RPM (110g)에서 원심 분리 후, 표면에 뜨는이 제거되고 세포는 전체 NSC 매체의 1 ML에서 다시 정지됩니다. </li><li> 세포 현탁액의 10μl는 trypa 90 μl와 혼합되어N 파란색은 셀 카운트를 수행합니다. 참고 : 기타 적절한 셀 dilutions도 사용할 수 있습니다. </li><li> 아래 설명된 바와 같이 세포 그때 subculture 1, 2 또는 차별 화를 위해 사용됩니다. </li></ol> 3. 신경 줄기 및 전구 세포의 분화, Neuroblast 분석 (NBA) <ol><li> dissociated neurospheres에서 발생하는 세포는 20 NG / ML EGF, 10 NG / ML bFGF, 0.2 % 헤파린의 1 μl / ML 및 5 %로 보완 완료 NSC 매체에서 2-3 × 10 5 세포 / ML의 농도에 도금되어 더위가 적절한 크기의 조직 배양 플라스크에 FCS를 inactivated. 5 ML 매체는 T75을위한 T25, 20 ML 및 T175 flasks 40 ML에 사용됩니다. 참고 : FCS는 세포가 단단히 기판에 부착시킬 수 있으며 NBA 문화를위한 코팅 flasks을위한 필요가 없습니다. </li><li> 예찬우레의 flasks 그러면 3-4일을위한 5 % CO 2와 37 ° C humidified 인큐베이터에 incubated됩니다. 이 기간은 NSC의 자손이 기판에 부착하고 세포 단일층로 분아 따위에 의해 번식하는 동안은 증식 단계라고합니다. </li><li> 문화 90-95%에 합류, 각 플라스크의 중간이되면 어떤 성장 요인없이 5% FCS와 보완 완료 NSC 매체로 전환됩니다. </li><li> 문화 flasks 다시 다른 3~4일을위한 5 % CO 2와 37 ° C humidified 인큐베이터에 incubated됩니다. 이 기간의 연결을 progenitors은 astrocytic 단일층 상단에 표시하고 미숙의 연결을 세포의 콜로니를 만들기 위해 분아 따위에 의해 번식하는 동안, 분화 단계라고합니다. 분화 단계의 날이 4-5 일, 문화 유동세포계측법 기술을 사용하여 neuroblast 전지의 절연을위한 준비가되었습니다. </li></ol> 4. 유동세포계측법위한 셀 준비 Trypsinization <ol><li> 분화 단계의 날이 4-5에서 NSC의 자손을 차별 문화는 문화에서 FCS를 제거하는 PBS의 적절한 금액 (T25 2 ML, T75 4 ML과 T175 플라스크 8 ML)으로 한번 씻어있다. 참고 : FCS 블록 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 활동. </li><li> 그런 다음 미리 예열 0.05 % 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (T25 2 ML, T75 4 ML과 T175 플라스크 8 ML)의 충분한 양의는 세포 단일층을 충당하기 위해 각 플라스크에 추가에서 1-2 분 동안 incubated합니다 37 ° C humidified 인큐베이터. </li><li> 플라스크는 문화에 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 효과를 평가하기 위해 현미경으로 검사합니다. 플라스크 그런 다음 한손으로 개최하고 플라스크의 바닥으로부터 세포를 꺼내려 다른 손으로 단단히 빠진있다. </li><li> 대두 트립신 억제제의 평등 볼륨은 트립신 활동을 끄지하기 플라스크에 추가됩니다. 세포 현탁액은 부드럽게 트립신 불활 성화를 보장하고 동질적인 하나의 세포를 달성하기 위해 아래로 pipetted되고정지. 참고 : 또는 5 % FCS와 보완 매체가 트립신 활동을 끄지하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 비 dissociated 대단히 짧은 시간을 제거하려면 세포 현탁액은 40 μm의 크기의 메쉬 필터를 통해 전달됩니다. </li><li> 세포 현탁액 그때 5 분, 800 RPM (110g)에 centrifuged 있으며, 표면에 뜨는이 제거되고 세포는 전체 NSC 매체의 적절한 볼륨으로 다시 정지됩니다. </li><li> 세포 현탁액의 최종 볼륨은 세포 밀도가 2-3x10 6 -cells/ml를 초과하지 않도록 조정됩니다. 높은 세포 밀도는 유동세포계측법 기계에서 스트림 차단을 일으킬 수 있습니다. </li><li> 방금 그들의 물리적 특성에 기초의 연결 세포를 분리하고자 할 경우, 이제는 4 부의 설명에 따라 분류 FACS로 진행할 수 있습니다. </li><li> 정렬하기 전에 Propidium의 요오드화물은 (PI, 시그마, PBS 500 μg / ML) 1 μl / 죽은 세포를 제외할 세포 현탁액의 ML의 농도에 추가됩니다. </li></ol> cel 라이브리터 immunolabeling 높은 프로 농구 (NBA)의 문화에서 하나의 세포를 수확의 연결을 세포의 순도, PSA-NCAM (초기 미숙의 연결을 progenitors의 마커) 다음의 연결 인구에서 긍정적인 세포에 대한 물들일 수를 달성하기 위해서는 FACS 기계를 사용하여 격리 수 있습니다. <ol><li> 셀 카운트를 수행한 후에는 NBA 문화에서 단일 세포 현탁액은 네 그룹으로 나뉘어져 있습니다 : <ul><li> 혼자 셀 그룹은, 매개 변수 및 성문 (0.5-1 X 10 6 셀)를 조정하는 제어 역할을합니다. </li><li> 셀 플러스 PI는 매개 변수 및 성문 (0.5-10 × 10 6 셀)를 조정하는 제어 역할을합니다. 이 그룹의 PI 부정적인 세포는 세포가 물리적 특성에 따라도 정렬할 수 있습니다. </li><li> 또한, 매개 변수 및 성문 (1-2 X 10 6 셀)를 조정하는 제어 역할을 보조 혼자 (Isotype 제어) 그룹. </li><li> 달성하기 위해 PSA-NCAM에 대한 물들어있는 Immunolabeling 그룹 (8-10 X 10 6 셀)미숙 세포의 연결을 더욱 정화. 정렬시 죽은 세포를 제외하려면 PI는뿐만 아니라이 그룹에 추가됩니다. </li></ul></li><li> immunolabeling를 시작하려면 전지는 5 분, 800 RPM (110g)에 centrifuged됩니다. 표면에 뜨는이 제거되고 세포는 전체 NSC 매체의 100 μl에 다시 정지됩니다. </li><li> Phycoerythrin (PE) 복합 백신 PSA-NCAM 항체는 PSA-NCAM에 대한 물들일 수있는 세포 현탁액에 10월 5일부터 10일까지 / μl X 10 6 세포의 비율에 추가됩니다. 마찬가지로 PE 복합 마우스 IgG1 isotype 제어 항체는 isotype 제어 세포 현탁액에 추가됩니다. 사용되는 항체의 농도에 관한 항체 사양서에 지시를 따릅니다. 세포 현탁액 그런 다음 부드럽게 섞어 어둠 속에서 10-15 분 동안 상온에서 incubated합니다. </li><li> 세포 현탁액 (PSA-NCAM 및 Isotype 제어 튜브)이 후 5 분 800 RPM (110g)에 centrifuged하고 뜨는이 제거되고 세포가 다시 suspe 수있다는전체 NSC 매체의 1 ML에 nded. </li><li> 샘플에서 과잉 취소 묶여 항체를 제거하려면 단계 4는 3 배 더 반복한다. </li><li> 후 다시 정지 Propidium의 요오드화물은 (PI, 시그마, PBS 500 μg / ml) 쇼핑 세포 현탁액 1 μl / ML (세포 플러스 PI, isotype 제어 및 농도에 추가됩니다 매체의 적절한 볼륨으로 세포를 PSA- 유동세포계측법에 의해 분석하면 NCAM 묻은 샘플)는 죽은 세포를 제외합니다. </li><li> 전체 매체 중 1 ML을 포함하는 15 ML 멸균 팔콘 튜브는 다른 세포 집단에서 정렬된 세포를 수집할 준비가되어 있습니다. </li></ol> 5. 미숙 뉴런의 형광 - 활성 셀 정렬 (FACS) <ol><li> FACS 기계는 유동세포계측법 시설 전문 기술자를 통해 자사의 사용자 설명서 지침을 기반으로 설정됩니다. </li><li> 인산염은 식염수 (PBS) 또는 다른 적절한 솔루션 dependin 버퍼제조 업체 지침에 g는 90 μm의 노즐을 통해 28 PSI에 칼집 유체로 사용할 수 있습니다. </li><li> 시스템의 차동 압력이 정렬 트리거 속도가 2500 이벤트 / 초를 초과하지 않는 등 조정됩니다. </li><li> 혼자 세포의 세포 현탁액이 그룹은 FACS 기계를 통해 실행됩니다. </li><li> 첫째, 세포가 (이벤트)의 크기 (전방 산포도 (FSC) 빛) 대 다른 세포 집단을 구분하기 위해 내부 복잡도 (사이드 산포도 (SSC) 빛)을 기반으로 꾸몄다됩니다. 이렇게하려면 FSC와 SSC를위한 전압 매개 변수가 세포 유동세포계측법 계획에서 볼 수 있도록 조정되어야한다. </li><li> 세포 대단히 짧은 시간과 doublets를 제외하려면 세포가 먼저 앞으로 분산형 지역 (FSC-) 대 순방향 산란 펄스 폭 (FSC-W) 및 단일 세포 인구가 인구 1 (P1)와 같은 문이있다 토대로 꾸몄다됩니다. 그렇다면 P1 전지 사이드 분산형 지역 (SSC-) 대 사이드 분산형 펄스 폭 (FSC-W) 및 단일 세포 gat있는이 시간을 기준으로 꾸몄다있다인구 2 (P2)로 에드. 이 두 연속 게이트, 대단히 짧은 시간 또는 doublets을 (높은 FSC 펄스 폭 및 높은 SSC 펄스 폭) 설립하는 것이 배제되고있다. </li><li> 죽거나 손상된 세포를 제외하려면 하나의 세포는 (P2) FSC-A와 하나의 살아있는 세포 인구 문이입니다 대 PI의 반응을 바탕으로 꾸몄다됩니다. </li><li> 싱글 라이브 세포는 세포의 크기와 내부 단위에 따라 서로 다른 세포 집단을 구분하는 FSC 대 SSC를 기반으로 꾸몄다됩니다. 이 단계에서는 두 가지 세포 인구는 FSC 낮은 SSC 낮은 (P3)와 FSC 높은 SSC 고등학교 (P4) 세포 집단과 같은 문이 있습니다. </li><li> 정렬하려면 FSC 낮은 SSC 낮은 인구에서 PSA-NCAM은 immuno-반응성 미숙의 연결을 세포, 컨트롤에서 먼저 FSC 낮은 SSC 낮은 인구 (플러스 PI 및 isotype 제어 세포) 그룹은 FSC-비해 체육 immunoreactivity을 기반으로 꾸몄다과 부정적이다 세포는 (P5) 문이 있으며, PSA-NCAM에서 다음 긍정적인 세포스테인드 그룹은 인구 6 (P6)와 같은 문이 있습니다. </li><li> 모든 필요한 성문을 조정 후 이익의 세포는 1ml NSC 매체를 포함하는 15 ML 무균 조직 배양 튜브로 정렬됩니다. </li><li> 정렬 세포 후 5 분 위해 1200 RPM (240g)에 centrifuged됩니다. </li><li> 뜨는 폐기되고 펠렛이 수행되는 중간 (펠렛의 크기에 따라)와 셀 카운트의 적절한 볼륨으로 다시 일시 중지되었습니다. </li><li> 셀 그때 5퍼센트 FCS 20 NG / ML 인간 재조합 BMP4 5 20-30 X 10 3 셀 밀도 / 잘 완전한 NSC 매체 200-250 μl시 폴리-L-Ornithine 코팅 96 - 웰 플레이트에 도금되어 . </li></ol> 참고 : 코트 96 우물, 폴리-L-Ornithine 작업 솔루션을 100 μl를로 (1.5 ML 폴리-O 및 멸균 PBS의 8.5 ML) 각도에 추가되고 판은 최소한 하나에 대해 37 ° C 배양기에서 incubated합니다 시간. 그런 다음, 멸균 PBS로 폴리-O가 제거되고 각각 아니라는 세 번 씻어있다(PBS가 10 분 동안 우물에 매번 유지하자). 폴리-L-Ornithine이 / 잘 24도 접시를 사용하는 경우 해결책을 일하고 500 μl를 사용하십시오. <ol start="14"><li> 셀 그런 다음 정렬 차가운 4 % paraformaldehyde를 사용하면 다른 시간 지점에 고정하고 다른 세포 집단에서 정렬 세포의 표현형을 평가하기 위해 적절한의 연결 및 glial 세포 마커를 위해 immunostained됩니다. </li></ol> 6. 대표 결과 neuroblast 분석 (NBA) 차별 문화에서 도금 세포는 조직 배양 기판에 연결하고 단일층로 성장. 초기 셀 도금 밀도에 따라 문화 3-4 일 후에 90~95% 합류 문화로 돌아갈 것입니다. 이 단계에서는 주로 astrocytic 세포 단일층는 최고 4,5에 작은 원형의 연결 전구 세포 (그림 1)과 시각 아래가 될 수 있습니다. 성장 인자 무료 매체 매체를 전환 후의 연결 전구 세포가 시작급속하게 나누어와 4-5일의 astrocytic 단일층 (그림 2)의 꼭대기에서 미숙 neuroblast 세포의 클러스터를 생성합니다. 셀 크기 (FSC)와 내부 단위 (SSC) (그림 3)을 기반으로 FSC 낮은 SSC 낮은 FSC 높은 SSC 높은, 분화 단계의 4~5일에 dissociated 프로 농구 (NBA) 문화의 유동세포계측법 분석은 두 가지 세포 인구를 보여줍니다. FSC 높은 SSC 높은 인구에서 정렬 세포가 주로있는 동안 정렬된 세포 Immuno-형광 분석,의 연결 세포는 주로 FSC 낮은 SSC 낮은 인구 (그 이상의 75 % β-III의 tubulin을 표현 포함)에 위치하고 있는지 보여줍니다 immunoreactive astrocytes를 (그림 4) GFAP. 최대 근처의 균질성 (97 %)로 미숙 세포의 연결을 추가 정제는 FSC 낮은 SSC 낮은 인구 (그림에서 PSA-NCAM IR 전지의 긍정적인 선택을 구현할 수3, 4). E14 마우스 ganglionic eminences 격리 NSCs에서 생성된 농축의 연결 세포는 분화시 GABAergic 표현형 표현 DARPP-32, 매체 가시의 뉴런의 마커 (그림 5)를 취득. <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig1.jpg" alt="그림 1"/> 확산 단계의 날이 4 E14 마우스 신경 줄기 세포에서 그림 1. Neuroblast 분석 문화. 이 단일층 문화는 플랫 astrocytic 세포 (화살촉) 아래와 위에 원형의 연결 전구 세포 (화살표)으로 구성되어 있습니다. 원래 배율, 20 X. <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig2.jpg" alt="그림 2"/> ) 위상 대조, B) Immunofluorescent 염색법 :. 분화 단계의 날이 4 E14 마우스 신경 줄기 세포에서 그림 2 Neuroblast 분석 문화. 미숙의 연결 세포 (의 클러스터를 적어 둡니다의 화살 (B에, GFAP의 염색법의 화살표 머리) 위에 B의&gt;와 β III의 tubulin의 염색법). 원래 배율, 20 X. <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig3.jpg" alt="그림 3"/> . 그림 3 대표 정렬 플롯 :). FSC 대 doublets과 죽은 세포를 배제하기 전에 SSC 정렬 줄거리. B, C). FSC와 SSC 펄스 폭. D를 기반으로 doublets의 제외 정렬 플롯). 죽어서 손상된 세포를 제외 Propidium 요오드화물의 immunoreactivity에 기초. E는). doublets과 죽은 세포를 배제 후 FSC 대 SSC는 플롯, FSC 낮은 SSC 낮은 FSC 높은 SSC 높은 인구로 표시된 두 가지 주요 인구를 보여주는. F, G). 정렬 플롯은 FSC 낮은 SSC 낮은 인구에서 PSA-NCAM IR 미숙 세포를 분리합니다. 세포에서 그림 4. 대표 micrographs은 도금 후 다른 집단에서 하루 정렬.) FSC 낮은 SSC 낮은 인구 (이들 세포가 뉴런있는 이상의 75 %). B) FSC 높은 SSC 높은 인구 (이들 세포의 대부분은 astrocytes 있습니다 ). C) PSA-NCAM FSC 낮은 SSC 낮은 인구 (거의 모든 정렬된 세포는 뉴런이다)에서 + 정렬 세포. 원본 확대, 20 X. <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig5.jpg" alt="그림 5"/> 그림 5. 정렬 미숙 뉴런은 GABAergic 뉴런 ()와 표현 DARPP-32 (B), 중간 가시 뉴런을위한 표지로 구분.

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	<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay.">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393 (2010).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay.">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2457 (2011).</li><li>Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Adult+Neural+Stem+Cells.">Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells.</a> Methods. Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).</li><li>Scheffler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+characterization+of+adult+brain+neuropoiesis.">Phenotypic and functional characterization of adult brain neuropoiesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9353-9358 (2005).</li><li>Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+immature+neuronal+cells+from+neural+stem+cell+progeny.">Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny.</a> PLoS One. 6, e20941-e20941 (2011).</li><li>Amariglio, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-Derived+Brain+Tumor+Following+Neural+Stem+Cell+Transplantation+in+an+Ataxia+Telangiectasia+Patient.">Donor-Derived Brain Tumor Following Neural Stem Cell Transplantation in an Ataxia Telangiectasia Patient.</a> Plos Medicine. 6, 221-231 (2009).</li></ol>

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정의된 신경 세포 인구를 분리하는 기능 (즉, 뉴런, astrocytes와 oligodendrocytes)은 신경 줄기 세포의 임상 응용 (NSCs)와 관련된 방해물의 일부를 해결할 수 있습니다. 첫째, 완전히 기증자 세포의 시작 인구 특성을 우리에게 있습니다. 둘째, 우리가 질병의 특성이나 무대 상황에 따라 특정 비율로 특정 세포 유형 또는 다른 세포 유형의 조합을 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 매우 풍부한 사전 차별화?...

<table border="1"><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 유형 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 중간 </td><td> 매질 </td><td> 셀 기술을 막기 </td><td> 05,700 </td><td></td></tr><tr><td> NeuroCult NSC 확산 보조 </td><td> 중간 보충 </td><td> 셀 기술을 막기 </td><td> 05,701 </td><td></td></tr><tr><td> 0.05 % 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 시약 </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td><td></td></tr><tr><td> 대두 트립신 억제제 </td><td> 시약 </td><td> 시그마 </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> 펜 / Strep </td><td> 시약 </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> * MEM </td><td> 시약 </td><td> Gibco </td><td> 41500-018 </td><td> 앙 구성 요소 </td></tr><tr><td> * HEPES </td><td> 시약 </td><td> 시그마 </td><td> H4034 </td><td> 앙 구성 요소 </td></tr><tr><td> * 증류수 </td><td> 시약 </td><td> Gibco </td><td> 15230-147 </td><td></td></tr><tr><td> 셀 스트레이너 </td><td> 체 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352,340 </td><td></td></tr><tr><td> T25 플라스크 </td><td> 문화 도자기 </td><td> Nalge Nunc 인터내셔널 </td><td> 136,196 </td><td></td></tr><tr><td> T80 플라스크 </td><td> 문화 도자기 </td><td> Nalge Nunc 인터내셔널 </td><td> 178,905 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ML 튜브 </td><td> 문화 도자기 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352,096 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ML 튜브 </td><td> 문화 도자기 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352,070 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> EGF </td><td> 성장 인자 </td><td> R &amp; D </td><td> 2028-EG </td><td></td></tr><tr><td> B-FGF </td><td> 성장 인자 </td><td> R &amp; D </td><td> 3139-FB </td><td></td></tr><tr><td> 헤파린 </td><td> 성장 인자 </td><td> 시그마 </td><td> H4784 </td><td> PBS로 재구성 </td></tr><tr><td> 안티 - PSA-NCAM-PE </td><td> 항독소 </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-093-274 </td><td></td></tr><tr><td> PE-복합 마우스 IgG1 </td><td> Isotype 제어 항체 </td><td> BD Pharminogen </td><td> 556,029 </td><td></td></tr><tr><td> 헤파린 </td><td> 성장 인자 </td><td> 시그마 </td><td> H4784 </td><td> PBS로 재구성 </td></tr><tr><td> HrBMP-4 </td><td> 성장 인자 </td><td> R &amp; D </td><td> 314-BP-010 </td><td></td></tr><tr><td> 폴리-L-Ornithine </td><td> 시약 </td><td> 시그마 </td><td> P4957 </td><td></td></tr><tr><td> 소태아 세럼 </td><td> 중간 보충 </td><td> Gibco </td><td> 10099-141 </td><td></td></tr><tr><td> GFAP </td><td> 항독소 </td><td> DAKO </td><td> Z0334 </td><td></td></tr><tr><td> B-III의 tubulin </td><td> 항독소 </td><td> Promega </td><td> G7121 </td><td></td></tr></table> * 앙, 믹스 1 X MEM 10 패 패킷 및 1M HEPES 160 ML을하고 증류수를 사용하여 8.75 L로 볼륨을 이끌 것이다. 7.4로 최종 PH를 설정 및 4 ° C.에 보관

the neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry

신경 줄기 세포 (NSCs)에 격리하고 확장 가능한 대규모 neurosphere 분석을 사용하고 중추 신경계 (CNS)의 세 가지 주요 세포 유형으로 차별, 즉, astrocytes, oligodendrocytes과 뉴런. 이러한 특성은 신경 줄기 및 전구 세포와 같은 약물 검사, neurotoxicology 및 전기 생리학 등의 체외 연구와 또한 많은 신경 질환에서 세포 대체 요법에 대한 대한 세포의 귀중한 재생 소스를 확인합니다. 그러나 실제로 NSC의 자손, 뉴런과 oligodendrocytes의 낮은 생산, 차별화 자신의 임상 응용 프로그램을 제한하는 다음과 같은 astrocytes의 우위의 이질. 여기서는 형광 활성 세포 정렬 (FACS) 기술을 이용한 murine NSC의 자손에서 미숙 뉴런의 생성 및 그 이후의 정화를위한 소설 방법론을 설명합니다. 이 방법론을 사용하여, 매우 풍부의 연결 전구 세포 인구는 지혜를 얻을 수어떠한 눈에 띄는 astrocyte와 타고난 NSC 오염을 슬프게도 인류. 절차는 NSC의 자손 격리 및 유동세포계측법 기술을 사용하여 물리적 (크기 및 내부 복잡성) 및 형광 특성을 바탕으로 미숙의 연결을 세포의 분리와 농축 다음 neurosphere 분석을 사용하여 E14 마우스 ganglionic eminences에서 확장의 분화를 포함합니다. 전반적으로, 그것은 NSC의 자손을 차별화하는 데 neurospheres 및 6~8일를 생성하는 5~7일 걸리며 매우 미숙의 연결 세포를 정화 분리.

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The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

이 비디오 프로토콜 유동세포계측법 기술을 사용하여 물리적 (크기 및 내부 단위) 및 형광 특성을 바탕으로 신경 줄기 세포의 재생 소스 (NSCs)에서의 연결 전구 세포의 생성과 이후의 정화를위한 소설 방법을 보여줍니다.

Neuroblast 분석 : 유동세포계측법을 사용하여 차별화 신경 줄기 세포에서 자손의 연결 전구 세포의 생성과 강화에 대한 분석

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.4K 조회수.  The University of Florida. 이 비디오 프로토콜 유동세포계측법 기술을 사용하여 물리적 (크기 및 내부 단위) 및 형광 특성을 바탕으로 신경 줄기 세포의 재생 소스 (NSCs)에서의 연결 전구 세포의 생성과 이후의 정화를위한 소설 방법을 보여줍니다.

비디오: The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

절연 및 Neurosphere 어세를 사용하여 성인 마우스 신경 줄기 세포의 확장

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

연구

신경과학

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Neurosphere 분석을 사용하여 마우스 배아 신경 줄기 세포 문화 구축

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

세포 어세를 형성 신경 콜로니 : 신경 전구 세포로부터 타고난 신경 줄기 세포를 차별 어세이

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

손상의 감각 오르간 전구체 세포 라이브 셀 이미징 Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

배아 Murine 신경 튜브에서 신경 크레스트 세포의 분리 및 문화

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

인간 다 능성에서 신경 능선 세포의 전구 세포의 공급이없는 유도는 줄기 세포

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of protocols for flow cytometric analysis of the cluster of differentiation (CD) surface antigens and intracellular antigens in neural cell types. Our step-by-step description of the methodological procedures include: the harvesting of neural in vitro cultures, an optional carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeling step, followed by surface antigen staining with conjugated CD antibodies (e.g., CD24, CD54), and subsequent intracellar antigen detection via primary/secondary antibodies or fluorescently labeled Fab fragments (Zenon labeling). The video demonstrates the most critical steps. Moreover, principles of experimental planning, the inclusion of critical controls, and fundamentals of flow cytometric analysis (identification of target population and exclusion of debris; gating strategy; compensation for spectral overlap) are briefly explained in order to enable neurobiologists with limited prior knowledge or specific training in flow cytometry to assess its utility and to better exploit this powerful methodology.

We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.

신경 세포 유형의 표면에 대한 유동 세포 계측법 프로토콜 및 세포 내 항원 분석

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

셀 성인 마우스 뇌실 영역에서 신경 줄기 및 전구 세포의 정렬과 세포주기 역학의 라이브 이미징

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. NSCs and neural progenitors (NPs) are commonly cultured in vitro as neurospheres. This protocol describes in detail how to determine the NSC frequency in a given cell population under clonal conditions. The protocol begins with the seeding of the cells at a density that allows for the generation of clonal neurospheres. The neurospheres are then transferred to chambered coverslips and differentiated under clonal conditions in conditioned medium, which maximizes the differentiation potential of the neurospheres. Finally, the NSC frequency is calculated based on neurosphere formation and multipotency capabilities. Utilities of this protocol include the evaluation of candidate NSC markers, purification of NSCs, and the ability to distinguish NSCs from NPs. This method takes 13 days to perform, which is much shorter than current methods to enumerate NSC frequency.

Neural stem cells (NSCs) refer to cells&#160;which can self-renew and differentiate into the three neural lineages. Here, we describe a protocol to determine NSC frequency in a given cell population using neurosphere formation and differentiation under clonal conditions.

신경 줄기 세포의 열거 클론 세이를 이용하여

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

Sialoglycan의 신진 대사 표지에 의하여 1 차적인 신경 줄기 및 전구 세포의 세포 표면 마커를 확인

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...