이 연구는 국립 보건원, NINDS의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다. 저자는 편집을 돕기 위해 현미경과 파멜라 C.의 체질을 돕기 위해 분자 의학 및 신경 과학, 릭 Dreyfuss의 연구소의 모든 구성원을 감사드립니다.

참고 : 신경 전구와 oligodendrocytic 계보 (Lineage) 세포의 일상 배양를 들어, 부화는 37 번 ° C humidified 5 % CO 2 분위기에서 이루어집니다. 모든 2 일, 매체는 문화가 40~70%의 합류 경우 신선한 매체의 50~100%를 사용하여 대체됩니다. 근처 confluency의 시간에서, 문화는 보통 주간 일정에 2-2.5e6/T75 플라스크에 passaged 있습니다. 1. 코팅 휴대용 술병을 준비 <ol><li> 코팅 플라스크 그런 다음 탈 이온수 (DI 물)와 코트 T75 플라스크를 100 ML에 폴리-D-리신 (PDL)의 5 밀리그램을 희석 준비 50 μg / 어둠 속에서 실온 (RT)에서 PDL의 ML. 1 ½ 시간 후, PDL을 기음과 DI-물에 한 번 플라스크를 씻어. 세포를 (표 1) 퍼 뜨리고 전에 건조 플라스크합시다. </li></ol> 2. 전구 - 파생 Oligodendrocytes (PDO)로 신경 전구 세포의 차별화를 시작 에 대한 프로토콜입니다인간 CNS의 전구 세포를 olate 것은 이전 발행물에서 설명하고이 프로토콜 1의 일부가 아닙니다. 인간 CNS의 전구 세포는 NIH 지침에 따라 취득 8 주 회임 태아 뇌의 telencephalon에서 고립되었다. <ol><li> 25 NG / ML bFGF의 20 NG / ML 표피 성장 인자 (EGF) (그림 1A)를 보충 neurobasal 중간에 PDL 코팅 플라스크에 신경 전구 세포의 multipotential 인구 성장. 통로 11 (p11)보다 높은 경우를 사용하지 마십시오. </li><li> 문화가 약​​ 70 % 합류 할 때 신경 전구 세포를 차별화 할 시작합니다. </li><li> 소 혈청 알부민, L-글루타민, gentamicin, N2 부품, T3, 쉬, NT-3, bFGF, 그리고 PDGF-AA (표 1) 보충 혈청이없는 DMEM / 햄 F12 1:1 매체를 사용하여 완벽한 차별화 oligodendrocyte 미디어를 확인 . 이 매체는 성장 요인 (oligo 중간 + GF)와 oligo 매체로 정의됩니다. </li><li> progen를 제거플라스크에서 itor 미디어와 한 번 세포를 씻어 인산염 버퍼 생리 (PBS)가 다음 oligo 매체를 추가 + GF oligodendrocyte 차별화를 시작합니다 (2.3에서 설명 내용). oligodendrocytic 혈통 위해 최선을 다하고 만 셀 (그림 1B) 성장합니다. 3 주 동안은이 매체의 문화 셀을. </li><li> 매주, 전지 90-95%의 합류, 통로들이 트립신 (0.05 %) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (0.1 %) (T75 플라스크 4 ML)을 사용하여에있을 때. 50 ML 원뿔 튜브에 passaged 할 셀에서 전체 미디어를 전송,이 완비 된 매체는 트립신을 해소하는 데 사용됩니다. 세포를 건조하지 있는지 확인하십시오. 그런 다음 트립신을 추가합니다. </li><li> 부드럽게 셀 부대를 지원하기 위해 플라스크를 여러 번 도청, RT에서 5 분에 트립신의 세포를 배양. </li><li> 분리 된 세포와 병에 설치된 매체의 4-5 ML을 추가하여 트립신을 해소. </li><li> 같은 50 ML 원뿔 튜브로 매체와 세포를 전송합니다. 1200 RPM (~에서 매체와 세포를 원심 분리기300 XG) RT에서 5 분을위한. </li><li> 표면에 뜨는을 대기음, 부드럽게 튜브를 팁, 세포 펠렛을 resuspend하고 신선한 oligo 매체 + GF를 추가합니다. 부드럽게 피펫 매체와 세포 위아래로는 단일 세포 현탁액을 확인합니다. </li><li> 각각의 새로운 PDL 코팅 T75 플라스크에 세포, 및 전송 2.5e6를 계산합니다. </li></ol> 3. Oligodendrocytes의 차별화에 마지막 단계 <ol><li> oligo 중간 + GF, 세포가 70~80%의 합류에 있습니다의 문화 3 주 후, 차별화의 마지막 과정 (그림 1C)를 시작합니다. </li><li> oligo 매체 + GF과 같은 방식으로하지만, 네 개의 GF를 추가하지 않고 미디어를 준비 : 쉿, NT-3, bFGF와 PDGF-AA. GF - 네 개의 GF없이 해당 매체는 oligo 매체로 정의됩니다. </li><li> 술병에서 oligo 매체 + GF를 대기음, PBS로 한 번 씻어하고 매체 16 ML의 총 볼륨을 추가 oligo 매체입니다 ¾ (12 ML)의 - GF와 ¼ (4 ML) PDN이 설치된 매체입니다에 대해 6-10 일). PDN에서 설치된 매체의 사용은 차별화 과정이나 세포의 생존에 중요한되지 않습니다. 우리는 실제로 공동 문화 실험에서 PDN 세포와 PDO 만 직접 접촉 PDO의 생존의 길이에 영향이 있다고 관찰했다. oligo 매체의 생존 시간 - PDO 세포가 PDN 세포와 공동 배양하는 경우 GF는 2 ~ 3 주에 연장 할 수있다. PDN에 인간의 신경 전구 세포를 차별화 할 수있는 프로토콜은 이전 발행물에서 설명하고이 프로토콜 1의 일부가 아닙니다. 여러 프로세스 (그림 1D)와 세포의 점진적 차별화 된 문화의 문화 중간 결과에서 성장 인자의 탈퇴. </li></ol> 4. 유동 세포 계측법 분석 유동 세포 계측법 분석은 부모 인구의 사람들과의 관계에서 차별화가 진행되는 동안 oligodendrocyte 마커의 인수를 비교합니다. <ol><li> 신경 프로를 사용컨트롤로 genitors. oligo 중간 + GF의 폴리-D-라이신과 코팅이 T75 플라스크에 2.5x10 6 셀의 씨앗 PDO 세포. </li><li> GF - 다른 플라스크는 oligo 매체가 있었을 때 일주일 후, 세포 생존을위한 제어 문화 플라스크에 신선한 oligo 매체 + GF와 매체를 교체하십시오. </li><li> 두 미디어에서 PDO 세포를 떼어 놓다하려면 20 U / papain의 ML과 트립신하지를 사용합니다. papain은 세포 형태를 보존 해리 동안 세포에 gentler 효과가 있기 때문입니다. </li><li> papain의 유리 병에 얼의 균형 소금 솔루션 (EBSS)의 5 ML을 추가합니다. 10 분 또는 papain이 완전히 용해 및 솔루션을 분명히 나타납니다 때까지 37 ° C에서 약을 놓으십시오. 이 세포를 떼어 놓다하는 데 사용되는 papain 솔루션입니다. </li><li> Deoxyribonuclease I (DNase) 유리 병 (표 1)에 EBSS의 0.5 ML를 추가합니다. 부드럽게 섞는다. 용해 papain의 약병이 솔루션의 0.25 ML을 추가합니다. 이 준비는 약 20 U / ML papain과 0의 최종 농도를 포함0.005 % DNase. </li><li> 15-30 분을위한 37 ° C에서 세포와 배양에 장소 papain 솔루션 (위에서 설명), 현미경을 사용하여 세포의 부대를 모니터링 할 수 있습니다. 와 함께 또는 7 분에 1,200 RPM의 GF와 원심 분리기가없는 매체의 5 ML로 반응을 중지합니다. </li><li> 두 개의 서로 다른 5 ML의 폴리 프로필렌 튜브에 두 플라스크에서 세포 알약을 전송하고 정상 생리 매체 (NPM : 145 MM NaCl, 5 MM KCl, 1.8 MM CaCl 2, 10 밀리미터 Hepes 10 MM 포도당)로 씻어 1 MG / ML로 보충 소 혈청 알부민 (NPM + BSA). </li><li> 표면이 4에 immunostaining 수행 ° GalC (표 2), A2B5, O4에 대한 구체적이고 적절하게 titrated 차 항체를 사용하여 20 분에 C. </li><li> 5 분에 대해 4 ° C에서 NPM + BSA와 세포를 깨끗이 씻어 20 분 (표 2)에 대해 4 ° C에서 특정 보조 항체로를 품다. </li><li> nestin, glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP), 클래스 III 및 수 등의 세포 항원을 착색하기타, - tubulin과 myelin 기본 단백질 (MBP) (표 2), RT 20 분 동안 2 % paraformaldehyde (PFA)에 셀을 수정하고 -20 ° C. 15 분 동안 차가운 70 % 에탄올로 permeabilize </li><li> 1X PBS로 세포를 씻어하고 특정 보조 항체 (표 2)에 품다. </li><li> 유동 세포 계측법 분석하는 동안 그대로 세포와 subcellular 부스러기 사이에 차별하기 위해 4,6-diamidino-2-phenyllindole, dihydrochloride (DAPI) (생명 기술, 그랜드 아일랜드, NY)으로 세포를 얼룩. </li><li> 위의 프로토콜을 최적화에서, 우리는 각 immunoreagent의 특이성을 확인하기 위해 모든 적절한 제어 실험을 수행했습니다. 간단히 직접 레이블 항체를 들어, 적절한 대조군은 기본 항체 (즉, isotype 제어)와 같은 면역 글로불린 isotype 클래스 (또는 서브 클래스)와 fluorochrome 켤레의 직접 복합 항체했다. 차 항체의 간접 immunostaining, 적절한 대조군 w에 대한특히 차 항체가 생성 된에서 호스트의 면역 글로불린 클래스 (또는 서브 클래스)를 목표로 관심 fluorochrome에 복합 보조 항체 있습니다. 여러 호스트 (마우스, 토끼, 닭)의 기본 항체를 함께 사용되었을 때, 우리는 일반적으로 최소화하기 위해 상호를 다른 호스트에서 면역 글로불린에 대한 교차 adsorbed 된 사용되는 각 호스트 및 각 보조 항체의 주요 항체을 대상으로 보조 항체를 사용 immunoreactivity를 개최했습니다. 긍정적 인 컨트롤이 항원에 대한 특정의 기본 항체를 직접 또는 간접적으로 immunoreactions을 사용하여 관심있는 항원을 표현하는 것으로 알려진 세포 준비를 직접 또는 간접적으로 immunostaining이 포함되어 있습니다. 위의 최적화 방법은 실험을 immunostaining의 각 유형에 대해 한 번 수행되었습니다. 제어 immunoreactions는 기본 및 보조 항체 중에서 더 큰 크로스 에피토프 immunoreactivity을 공개하지 않습니다. 유동 세포 계측법은 균일하게 수행되었다488 나노 미터, 647 나노 미터로 조정 여기 파장을 제공 세 레이저가 장착 FACVantage SE 셀 정렬 (BD Biosciences, 산호세, CA), 그리고 폭 넓은 UV (351-364 nm 정도) (그림 2)를 사용하여 정지 휘황 표시 셀 . </li></ol> 5. Immunofluorescence 분석 참고 : immunofluorescence 실험 PDO는 oligo 중간 + GF 또는 oligo 매체에 도금 있습니다 - PDL으로 코팅 6 잘 접시에 2.5e5에서 GF. 세포는 성장 요인의 탈퇴 후 여러 시간 지점에서 2퍼센트 PFA에서 수정되어 있습니다. 얼룩 항체는 플라스틱 6 잘 접시 대신 유리 coverslips에 수행됩니다. <ol><li> 미디어를 제거하고 2% PFA를 추가합니다. RT 10 분에 품다. PFA 폐기하십시오. PBS, 5 분마다 시간을 세포에게 3 번 씻으십시오. 세포를 건조하지 않도록주의하십시오. </li><li> RT에서 10 분 동안 PBS에 0.​​25 % 트리톤의 솔루션을 사용 세포 마커에 대한 세포를 Permeabilize. </li><li> 비 특정 바인딩, 블록 세포를 방지하기 위해 F또는 HHG (1 밀리미터 HEPES 버퍼, 2 % 말 혈청, 그리고 행크스 &#39;균형 소금 솔루션 10 % 염소 혈청)와 10 분. HHG에 미리 정해진 농도에 따라 특정 기본 항체 (표 2) 희석. 세포에 희석 항체를 놓습니다. 셰이커에 또는 4 ° C 하룻밤에 RT에서 1 시간을 품다. </li><li> 5 분마다 시간, PBS로 세포에게 3 번 씻으십시오. HHG에 미리 정해진 농도에 fluorochrome와 커플 링 적절한 보조 항체 (표 2) 희석. 세포에 희석 차 항체의 혼합물를 놓습니다. 어둠 속에서 흔드는에 RT에 품다 1 시간. </li><li> 5 분마다 시간, PBS로 세포에게 3 번 씻으십시오. </li><li> photobleaching 피하기 위해 셀에 DAPI와 골드을 연장하고 위에 유리 coverslip을 배치의 10 μl를 추가합니다. Axiovert 200M 형광 현미경 (Zeiss, Thornwood, NY) (그림 3)을 사용하여 라벨이 셀을 표시합니다. </li></ol>

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

이 프로토콜은 기본 인간 신경 전구 세포에서 태아 oligodendrocytes을 유도하고 유동 세포 계측법과 immunofluorescence 얼룩을 모두 사용하여 표현형을 특징하는 방법에 대해 설명합니다. 태아 CNS에서 신경 progenitors의 확장과 성장은 잘 1-4에 설명되어 있습니다. 이 성인의 흰색 물질 5-13에서 glial 전구체를 식별하고 분리 할 수 있습니다에도 불구 그러나, 체외 실험에서 충분한 인간?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> DME / 햄 F12 1시 1분 </td><td> 오메가 과학자 </td><td> DM-251 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> 알부민 소 </td><td> 시그마 </td><td> A9418 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> Gentamicin </td><td> 품질 체액 </td><td> 120-098-031 </td><td> 50 μg / ML </td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> 품질 체액 </td><td> 118-084-061 </td><td> 이 MM </td></tr><tr><td> T3 </td><td> 시그마 </td><td> T2877 </td><td> 3 NM </td></tr><tr><td> N2 구성 요소 </td><td> Gibco BRL </td><td> 17,502 </td><td> 1:100 </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> PeproTech 주식회사 </td><td> 450-03 </td><td> 이 NG / ML </td></tr><tr><td> 쉬 </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 1314-SH/CF </td><td> 이 NG / ML </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> PeproTech 주식회사 </td><td> 100-18B </td><td> 20 NG / ML </td></tr><tr><td> PDGF-AA </td><td> PeproTech 주식회사 </td><td> 100-13A </td><td> 10 NG / ML </td></tr><tr><td> PDL </td><td> 시그마 </td><td> P6407 </td><td> 50 μg / m </td></tr><tr><td> PFA </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 15,712 </td><td> 2퍼센트 </td></tr><tr><td> 트립신 </td><td> 품질 체액 </td><td> 118-087-721 </td><td></td></tr><tr><td> Papain </td><td> 워싱턴 </td><td> LK003178 </td><td> 20 U / ML </td></tr><tr><td> DNase 튜브 </td><td> 워싱턴 </td><td> LK003172 </td><td> 0.005 % </td></tr><tr><td> EBSS </td><td> 워싱턴 </td><td> LK003188 </td><td></td></tr><tr><td> 골드을 연장 과DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 1. 시약. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> 기본 애비 (모든 1 μg / ML에서) </td><td></td><td> 종 Isotype </td><td> 출처 </td><td> 차 애비 </td></tr><tr><td colspan="5"> 유동 세포 계측법 </td></tr><tr><td> A2B5-비오틴 </td><td> 마우스 </td><td> IgM </td><td> 선물 J. Nielson </td><td> Streptavidin 페트로, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> O4FITC </td><td> 마우스 </td><td> IgM </td><td> J. Nielson의 선물 </td><td></td></tr><tr><td> A2B5 </td><td> 마우스 </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> O4 </td><td> 마우스 </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> GalC </td><td> 마우스 </td><td> IgG 3 </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgG 3 PE, 남부 생명 공학, AL </td></tr><tr><td> MBP </td><td> 닭 </td><td> IgY </td><td> Millipore, MA </td><td> dαck IgY-AMCA, 잭슨 Immu., PA </td></tr><tr><td> Nestin </td><td> 마우스 </td><td> IgG 1 </td><td> Messam 외. 2000 28 </td><td> gαm IgG 1-PECy5, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> 토끼 </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαrb IgG-PE, 잭슨 Immu, PA </td></tr><tr><td> βIII의 tubulin </td><td> 마우스 </td><td> IgG 2 </td><td> Covance, CA </td><td> gαm IgG 2 - 페트로, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td colspan="6"> Immunocytochemistry </td></tr><tr><td> βIII의 tubulin (1:1,500) </td><td> 마우스 </td><td> IgG 2A </td><td> Covance, CA </td><td> gαm IgG 2A-FITC, Invitrogen, CA (1:1,000) </td></tr><tr><td> GFAP (1:1,000) </td><td> 토끼 </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαrb IgG-FITC, 잭슨 Immu, PA (1:500) </td></tr><tr><td> MBP (1시 50분) </td><td> 닭 </td><td> IgY </td><td> Millipore, MA </td><td> dαck IgY-FITC, 잭슨 Immu, PA (1:100) </td></tr><tr><td> O4 (1:100) </td><td> 마우스 </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-AF546, Invitrogen, CA (1: 100) </td></tr><tr><td> GalC (1시 10분) </td><td> 토끼 </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-AF750, Invitrogen, CA (1:100) </td></tr></tbody></table> . 유동 세포 계측법 및 immunocytochemistry의 assays에 사용되는 표 2 항체 (ABS) 항체 conjugates : PE, phycoerythrin, 페트로, phycoerythrin 텍사스 레드, AMCA, 아미노 메틸 coumarin - 아세테이트, 싸이, cyanine, FITC, fluorescein의 isothiocyanate IG :. 면역 글로불린. . AF : 알렉사 형석, gαm : 염소 안티 - 마우스, gαrb : 염소 안티 - 토끼, dαck : 당나귀 방지 닭. </td></tr></tbody></table>

progenitor-derived oligodendrocyte culture system from human fetal brain

neuronal와 glial 세포 유형으로 인간의 신경 progenitors의 차별화 신경 세포 계보 (Lineage) 개발의 분자 규정을 연구하고 비교하는 모델을 제공합니다. 태아 CNS 조직에서 신경 progenitors의 체외 확장에 잘 특징되었습니다. 체외 실험에서 충분한 인간의 oligodendrocytes을 획득 myelin 생산 oligodendrocytes에 태아 신경 progenitors의 직접 분화에 다양한 문화 조건 성인의 하위 대뇌 피질의 흰색 물질과 개발에서 glial progenitors의 식별 및 격리에도 불구하고 어려운 남아있다. galactocerebroside + (GalC)와 O4의 차별화가 + oligodendrocyte 전구체 또는 신경 전구체 세포의 전구 세포는 (OPC) 둘째 임신 태아 뇌를 사용하는 것으로보고되었습니다. 그러나, 이러한 전지는 astrocytes 뉴런 등의 지원 세포의 부재에서 세포 분열 따위에 의해 번식하지 않으며, 문화에 시간이 지남에 따라 빠르게 사라집니다. 필요가 체외 실험에서 적합 oligodendrocyte 혈통의 세포를 생산하는 문화 시스템 남아 있습니다. 기본 인간 oligodendrocytes의 문화 예를 들어, 생체에 그 세포를 감염 인간의 polyomavirus, JCV 같은 neurotropic 전염성 대리인의 pathogenesis을 연구 할 수있는 유용한 모델이 될 수 있습니다. 이러한 배양 세포는 중추 신경계 (CNS)의 다른 demyelinating 질병의 모델을 제공 할 수 있습니다. 뉴런 (전구 - 파생 뉴런, PDN)와 astrocytes (전구 파생 astrocytes, PDA)이 연구는 신경 progenitors을 유도 할 수 있다는 표시로 차별화 할 수있는 능력을 유지하면서 기본, 인간 태아 뇌 유래, multipotential 신경 전구 세포는 체외에서 세포 분열 따위에 의해 번식 oligodendrocytic 계보 (Lineage) 개발의 단계 (전구 파생 oligodendrocytes, PDO)의 많은을 통해 차별화합니다. DMEM-F12 혈청이없는 미디어의 우리 문화 신경 전구 세포는 저녁을 먹다기본 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF-AA), 소닉 고슴도치 (쉬), neurotrophic 요인 3 (NT-3), N-2 및 triiodothyronine (T3)로 plemented. 배양 세포는 대략 칠일 75cm 플라스크 당 2.5e6 세포에 passaged 있습니다. 이러한 조건에 사용 문화의 세포의 대부분이 몇 프로세스 및 A2B5 및 O-4 같은 사전 oligodendrocyte 세포의 명시 적 마커 특징으로 형태를 유지하고 있습니다. 우리가 네 가지 성장 요인 (GF) (bFGF, P​​DGF-AA, 쉬, NT-3)을 제거하고 PDN에서 설치된 미디어를 추가하면 세포는 GalC 및 myelin 등 oligodendrocyte 차별화의 특정 더 많은 프로세스와 명시 적 마커를 획득하기 시작 기본 단백질 (MBP). 우리는 oligodendrocyte의 독특한 마커를 식별 할 수 다색의 유동 세포 계측법을 사용하여 phenotypic 특성을 선보였습니다.

이 70 % -80 % 합류 신경 전구 세포 배양 (그림 1A)에서 차별화 프로세스를 시작하는 것은 매우 중요합니다. 많은 세포는 특정 성장 요인을 포함 있기 때문에 전구에서 oligo 매체에 문화 매체를 변경 한 후에는 죽을 것이다. 이 oligodendrocytic 표현형에 커밋되지 신경 전구 세포의 성장이 새로운 매체 (그림 1b)에 의해 지원되지 않습니다 나타냅니다. 일주일 동안 oligo 중간 + GF의 ?...

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Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

기본, 인간 태아 뇌 유래, multipotential 전구 세포는 세포 분열 따위에 의해 번식<em&gt; 체외에서</em&gt; 뉴런과 astrocytes로 차별화 할 수있는 능력을 유지하면서. 이 작품은 신경 progenitors은 선택의 성장 요인과 에어컨하여 oligodendrocytic 계보 (Lineage)의 단계를 통해 차별화하도록 유도 될 수 것으로 나타났습니다.

인간 태아 뇌에서 전구 - 파생 Oligodendrocyte 문화 시스템

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

progenitor-derived-oligodendrocyte-culture-system-from-human-fetal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.8K 조회수.  National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health. 기본, 인간 태아 뇌 유래, multipotential 전구 세포는 세포 분열 따위에 의해 번식 체외에서 뉴런과 astrocytes로 차별화 할 수있는 능력을 유지하면서. 이 작품은 신경 progenitors은 선택의 성장 요인과 에어컨하여 oligodendrocytic 계보 (Lineage)의 단계를 통해 차별화하도록 유도 될 수 것으로 나타났습니다.

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Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

폐기 인간 태아 두피 조직에서 신경 줄기 세포의 생성

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

연구

신경과학

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications for understanding the pathogenesis of demyelinating diseases such as Multiple Sclerosis (MS). Cellular development is commonly studied with primary cell culture models. Primary cell culture facilitates the evaluation of a given cell type by providing a controlled environment, free of the extraneous variables that are present in vivo. While OL cultures derived from rats have provided a vast amount of insight into OL biology, similar efforts at establishing OL cultures from mice has been met with major obstacles. Developing methods to culture murine primary OLs is imperative in order to take advantage of the available transgenic mouse lines. 
Multiple methods for extraction of OPCs from rodent tissue have been described, ranging from neurosphere derivation, differential adhesion purification and immunopurification 1-3. While many methods offer success, most require extensive culture times and/or costly equipment/reagents. To circumvent this, purifying OPCs from murine tissue with an adaptation of the method originally described by McCarthy &amp; 
de Vellis 2 is preferred. This method involves physically separating OPCs from a mixed glial culture derived from neonatal rodent cortices. The result is a purified OPC population that can be differentiated into an OL-enriched culture. This approach is appealing due to its relatively short culture time and the unnecessary requirement for growth factors or immunopanning antibodies. 
While exploring the mechanisms of OL development in a purified culture is informative, it does not provide the most physiologically relevant environment for assessing myelin sheath formation. Co-culturing OLs with neurons would lend insight into the molecular underpinnings regulating OL-mediated myelination of axons. For many OL/neuron co-culture studies, dorsal root ganglion neurons (DRGNs) have proven to be the neuron type of choice. They are ideal for co-culture with OLs due to their ease of extraction, minimal amount of contaminating cells, and formation of dense neurite beds. While studies using rat/mouse myelinating xenocultures have been published 4-6, a method for the derivation of such OL/DRGN myelinating co-cultures from post-natal murine tissue has not been described. Here we present detailed methods on how to effectively produce such cultures, along with examples of expected results. These methods are useful for addressing questions relevant to OL development/myelinating function, and are useful tools in the field of neuroscience.

This article describes methods to derive enriched populations of murine oligodendrocyte precursor cells (OPCs) in primary culture, which differentiate to produce mature oligodendrocytes (OLs). In addition, this report describes techniques to produce murine myelinating co-cultures by seeding mouse OPCs onto a neurite bed of mouse dorsal root ganglion neurons (DRGNs).

포스트 - 나탈 Murine 조직의 공동 문화를 Myelinating 풍부한 Oligodendrocyte 문화와 Oligodendrocyte / 신경 세포의 유도

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

배아 전뇌에서 내피 세포의 분리 및 문화

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

인간의 신경의 집계의 cGMP-해당 확장 방법은 줄기 및 전구 세포는 다 능성 줄기 세포 또는 태아 뇌 조직에서 파생 된

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

2D 문화 시스템을 사용 하 여 기본 대뇌 피 질 세포의 영상 라이브

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily accessible. Through this route, mature neurons can be obtained in a matter of a few weeks. Here, we describe a straightforward and rapid one-step protocol to obtain iNs from dermal fibroblasts obtained through biopsy samples from adult human donors. We explain each step of the process, including the maintenance of the dermal fibroblasts, the freezing procedure to build a stock of the cell line, seeding of the cells for reprogramming, as well as the culture conditions during the conversion process. In addition, we describe the preparation of glass coverslips for electrophysiological recordings, long-term coating conditions, and fluorescence activated cell sorting (FACS). We also illustrate examples of the results to be expected. The protocol described here is easy to perform and can be applied to human fibroblasts derived from human skin biopsies from patients with various different diagnoses and ages. This protocol generates a sufficient amount of iNs which can be used for a wide array of biomedical applications, including disease modeling, drug screening, and target validation.

Direct neuronal reprogramming generates neurons that maintain the age of the starting somatic cell. Here, we describe a single vector-based method to generate induced neurons from dermal fibroblasts obtained from adult human donors.

성인 인간 피부 섬유 아 세포에서 유도 된 신경의 고수익 문화의 간단한 세대

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials through saltatory conduction. Moreover, an increasing number of reports suggest that oligodendrocytes interact with neurons beyond myelination, notably through the secretion of soluble factors. Here, we present a detailed protocol allowing purification of oligodendroglial lineage cells from glial cell cultures also containing astrocytes and microglial cells. The method relies on overnight shaking at 37 &#176;C, which allows selective detachment of the overlying oligodendroglial cells and microglial cells, and the elimination of microglia by differential adhesion. We then describe the culture of oligodendrocytes and production of oligodendrocyte-conditioned medium (OCM). We also provide the kinetics of OCM treatment or oligodendrocytes addition to purified hippocampal neurons in co-culture experiments, studying oligodendrocyte-neuron interactions.

Herein, we display an efficient method for the purification of oligodendrocytes and production of oligodendrocyte-conditioned medium that can be used for co-culture experiments.

공동 문화 실험을 위한 올리고엔드로시테 및 올리고엔드로시테-컨디셔닝 배지 생성

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

여러 중추 신경계 영역에서 쥐 아교 세포의 해부 및 분리

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining homeostasis, and during infection or injury. Several independent research groups have highlighted the central role that microglia play in autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes and cancers. The activation of microglia in some neurological diseases may directly participate in pathogenic processes. Primary microglia are a powerful tool to understand the immune responses in the brain, cell-cell interactions and dysregulated microglia phenotypes in disease. Primary microglia mimic in vivo microglial properties better than immortalized microglial cell lines. Human adult microglia exhibit distinct properties as compared to human fetal and rodent microglia. This protocol provides an efficient method for isolation of primary microglia from adult human brain. Studying these microglia can provide critical insights into cell-cell interactions between microglia and other resident cellular populations in the CNS including, oligodendrocytes, neurons and astrocytes. Additionally, microglia from different human brains may be cultured for characterization of unique immune responses for personalized medicine and a myriad of therapeutic applications.

This protocol is an efficient, cost effective and robust method of isolating primary microglia from live, adult, human brain tissue. Isolated primary human microglia can serve as a tool for studying cellular processes in homeostasis and disease.

성인 인간 뇌 조직에서 인간 마이크로글리아 획득

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it contributes to disease development and progression, particularly in the gray matter of the brain, remains largely unknown. The dysfunction of oligodendrocyte lineage cells is hallmarked by deficiencies in myelination and impaired self-renewal of oligodendrocyte precursor cells (OPCs). These two defects are caused at least in part by the disruption of interactions between neuron and oligodendrocytes along the buildup of pathology. OPCs give rise to myelinating oligodendrocytes during CNS development. In the mature brain cortex, OPCs are the major proliferative cells (comprising ~5% of total brain cells) and control new myelin formation in a neural activity-dependent manner. Such neuron-to-oligodendrocyte communications are significantly understudied, especially in the context of neurodegenerative conditions such as AD, due to the lack of appropriate tools. In recent years, our group and others have made significant progress to improve currently available protocols to generate functional neurons and oligodendrocytes individually from human pluripotent stem cells. In this manuscript, we describe our optimized procedures, including the establishment of a co-culture system to model the neuron-oligodendrocyte connections. Our illustrative results suggest an unexpected contribution from OPCs/oligodendrocytes to the brain amyloidosis and synapse integrity and highlight the utility of this methodology for AD research. This reductionist approach is a powerful tool to dissect the specific hetero-cellular interactions out of the inherent complexity inside the brain. The protocols we describe here are expected to facilitate future studies on oligodendroglial defects in the pathogenesis of neurodegeneration.

The neuron-glial interactions in neurodegeneration are not well understood due to inadequate tools and methods. Here, we describe optimized protocols to obtain induced neurons, oligodendrocyte precursor cells, and oligodendrocytes from human pluripotent stem cells and provide examples of the values of these methods in understanding cell-type-specific contributions in Alzheimer&#8217;s disease.

뉴런-희소돌기아교세포 상호작용 모델링을 위한 만능줄기세포로부터 인간 뉴런 및 희소돌기아교세포 생성

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...