작은 규모의 플라즈마 멤브레인 격리 프로토콜 및 mGFPHis 이중 태그는 진핵 모델 유기체인 Saccharomyces cerevisiae에서 막 단백질을 특성화하는 경제적이고 빠르며 신뢰할 수 있으며 쉬운 방법을 제공합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 멤브레인 단백질 발현 수준, ATP의 활동 및 세제가 정화에 가장 적합한 용이성과 속도입니다. 이 기술은 매우 사용자 친화적입니다.
그러나 기억해야 할 한 가지 중요한 점은 낮은 미토콘드리아 오염과 가능한 가장 높은 ATPase 활동을 보장하는 2의 OD 600으로 세포를 수확하는 것입니다. 분당 200회전에서 7~8시간 동안 YPD 배지 의 10 밀리리터에서 단일 효모 식민지를 미리 배양하여 시작합니다. 신선한 YPD 매체의 40 밀리리터를 접종하기 위해 사전 배양 10 밀리리터를 사용합니다.
그런 다음 세포 밀도가 1~3의 OD 600에 도달할 때까지 분당 200 회전에서 하룻밤 사이에 섭씨 30도에서 세포를 배양합니다. 다음날 수확 40 광학 밀도 단위, 또는 ODU, 4섭씨에서 5 분 당 4, 200 배 G에서 원심분리에 의해 로그와스믹 얼굴 세포의. 40밀리리터의 얼음 냉간 멸균 이중 증류수로 세포를 다시 일시 중단하고 세척합니다.
세척 단계 사이에 원심화와 얼음 차가운 물의 1 밀리리터를 사용하여 세척을 반복합니다. 얼음 차가운 멸균 물의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 얼음에 미리 냉각된 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 셀 서스펜션을 옮춥니다. 섭씨 4도에서 3분간 3, 300회 G에서 셀을 수확합니다.
수퍼네티드를 흡습하고 1밀리머 펜알 메틸 설파 닐 불소 또는 PMSF로 새롭게 보충된 균질화 완충제의 500 마이크로리터에서 세포 펠릿을 다시 중단한다. 추가 사용까지 셀 서스펜션을 영하 80도에 보관하십시오. 약 1 시간 동안 얼음에 세포를 해동.
그런 다음 얼음 차가운 0.5 밀리미터 직경 실리카 구슬을 셀 서스펜션의 500 마이크로리터에 추가하여 총 1 밀리리터에 도달합니다. 세포를 분해하기 위해 세포 현탁액을 최대 흔들림 강도로 1 분 동안 6 사이클동안 각 주기다음 얼음에 3 분 냉각 기간을 제공합니다. 소용돌이 후, 가열 된 메스 블레이드와 튜브의 바닥에 얇은 구멍을 만들고 10 초 동안 저속 스핀과 다른 얼음 차가운 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브로 깨진 셀 호모게네이트를 수집합니다.
수집된 세포 균주5, 섭씨 4도에서 5분간 156회 G로 수집된 세포 균질을 원심분리하여 세포 이물질을 제거합니다. 450 마이크로리터의 상류제를 얼음 차가운 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 1밀리머 신선한 PMSF로 보충된 얼음 냉균질화 버퍼 1밀리리터를 추가합니다. 혈장 멤브레인원심을 원심분리하기 위해 세포 현탁액은 섭씨 4도에서 1시간 동안 968배 G로 세포 현탁액을 원심분리합니다.
상체를 제거하고 1 밀리머 PMSF로 새롭게 보충된 균질화 버퍼 100 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 100 마이크로리터 파이펫 끝으로 교반하여 플라즈마 멤브레인 펠릿을 풀고 위아래로 피펫을 반복하여 펠릿을 다시 중단합니다. 감소제 및 세제를 함유한 완충제와 호환되는 단백질 분석 키트를 통해 플라즈마 멤브레인 제제의 단백질 농도를 측정합니다.
플라즈마 멤브레인을 영하 80도에 보관하거나 즉시 사용할 수 있도록 얼음위에 보관하십시오. 젤을 분리하는 4~5밀리리터를 위에서 최대 2cm의 조립된 젤 장치에 붓습니다. 조심스럽게 위에 0.1 %의 SDS의 1 ~ 2 밀리리터를 층과 실온에서 60 분 동안 설정 폴리 아크릴아미드 젤을 허용합니다.
한 시간 후에 중합 분리 젤로부터 0.1% SDS 층을 제거하고 이중 증류수로 젤을 헹구어 SDS의 흔적을 제거한다. 스태킹 젤 믹스를 분리 젤에 붓습니다. 빗을 스태킹 젤에 넣고 빗 주위에서 기포를 제거합니다.
그런 다음 스태킹 젤을 실온에서 60 분 동안 설정할 수 있습니다. 빗을 제거한 다음 젤 슬롯을 물로 헹구습니다. 젤 탱크에 젤을 넣고 젤 탱크를 상단으로 채우는 버퍼를 작성합니다.
플라즈마 멤브레인 샘플의 5~10마이크로리터를 단백질 로딩 염료의 동일한 볼륨으로 혼합하고 샘플 혼합물을 개별 젤 슬롯에 즉시 적재하여 실행 버퍼에 담가 두는 다. 개별 단백질 단편의 크기 추정을 가능하게 하기 위하여 10에서 245 킬로달톤의 범위에 있는 단백질 분자량 마커를 개별적인 슬롯으로 로드합니다. 파란색 로딩 염료가 젤 의 바닥에 도달 할 때까지 200 볼트에서 젤 전기 전도를 수행합니다.
젤 이미징 시스템으로 인겔 GFP 형광젤을 검사합니다. 형광 이미징에 따라 실온에서 15 분 동안 젤을 부드럽게 교반하여 단백질 젤 고정 용액의 10 ~20 밀리리터에서 단백질을 수정합니다. 그런 다음 이중 증류수 10밀리리터로 10분간 두 번 헹구고, 실온에서 1시간 동안 부드러운 흔들림으로 10밀리리터의 콜로이드 쿠마티 얼룩용 젤을 넣어 단백질 밴드를 시각화합니다.
단백질 밴드의 향상된 시각화를 위해 젤 이미징 시스템으로 이미지를 녹화하기 전에 1시간 동안 이중 증류수 20밀리리터에 젤을 한 두 번 염색합니다. 사카로미세스 cerevisiae A D 델타 델타의 고주파는 긍정적 인 제어 플라스미드 PS2로 달성되었다. 부정적인 제어를 위해 유로셀 프로토트론 변압제는 얻어진 것이 없습니다.
약 50개의 URA 세포 프로토트로프 CDR1-mGFPHis 변압제는 3일 동안 CSM에서 변형된 AD 델타 델타 세포를 3일 동안 배양한 후 얻어졌다. YPG 한천 판에서 성장할 수 없는 몸집이 작은 변압제는 제거되었다. CDR1-mGHPHis 샘플은 다양한 농도를 가진 시료를 인겔 형광으로 정량화하였다.
mGFP 형광 강도는 최소한의 배경 형광으로 전체 농도 범위에 선형이었다. 세포 밀도를 변화시키는 것은 세포의 40 ODU를 깨는 것이 가장 높은 CDR1 ATPase 활동으로 플라즈마 막의 최고 질을 산출했다는 것을 표시했습니다. 그러나, 혈장 막의 수율은 세포 밀도 증가에 비례하여 증가하였다.
AD 델타 델타의 조혈막으로부터 CDR1-mGHPHis를 용해시키는 다양한 특성을 가진 31개의 세제의 능력은 SDS 페이지로 테스트되었습니다. 베타 및 알파 DDM 및 포스 콜린 13 CDR1-mGHPHis용용해 하는 최고의 세제 했다. 그러나, 포스 콜린(13)은 CDR1-mGHPHis의 부분 적인 가수분해를 일으킨다.
1%세제로 용용화된 조혈장 멤브레인 단백질은 슈퍼오스 6개 증가 10 300 GL 크기 배제 컬럼을 사용하여 분리하였다. 말토사이드와 LMNG 추출 단백질의 크로마토그램은 대부분의 CDR1-mGHPHis가 15.5밀리미터 CDR1-mGHPHe에서 잘 생긴 가우시안 피크로 방출되는 것을 보여주었으며, 골재 또는 광범위한 골재로 언급된 세제를 함유한 포도당으로 용용화되었다. DDM에 대한 높은 피크는 DMN G 용해성 CDR1-mGHPHis의 큰 부분이 변성 될 수 있음을 나타냈다.
Zwitterionic Fos-cholines및 2개의 비이온 세제를 위한 FSCC 크로마토그램에서는 디지토닌에만 이노닌을 주었고 DDM에 유사한 크로마토그램을 주었습니다. Fos-choline 13은 대칭날카로운 모양의 피크를 주었지만 DDM보다 용출 량이 현저히 낮습니다. 최적화된 이중 태그는 또한 정화 수율을 개선하고 멤브레인 단백질의 국소화, 인신 매매 및 열 안정성을 결정하는 데 도움이 되었습니다.
이종 발현 기술은 또한 높은 처리량 약물 스크리닝및 다른 많은 멤브레인 단백질의 상세한 특성에 사용될 수 있다.
