저자는 기술 지원을 위해 브라이언 Muntean, Shao 소호, 마키 다카하시와 블레어 MELL 감사드립니다. 이 작품은 NIH (DK080640) 및 박사 Surya Nauli로 톨레도 &amp; ProMedica Translational 연구 자극 수상의 대학에서 수상에 의해 지원되었다.

1. 세포 전처리와 metaphase 준비 <ol><li> 그들이 70~80%가 confluency 도달할 때까지 세포는 5 % CO 2 배양기로 37 10-15% 태아 소 혈청 (FBS) 및 1퍼센트 페니실린 / 스트렙토 마이신 ° C를 포함하는 이글 배지 (DMEM)의 Dulbecco의 변경 재배하고 있습니다. </li><li> 0.05 μg / 30-60 분 ML에 colcemid 솔루션 세포를 드셔보세요. </li><li> 50-ML 멸균 매의 원심 튜브에 어떤 떠다니는 세포를 포함하는 매체를 수집합니다. sterile1X-PBS로 접시에 세포를 씻어. 1-2 분, 추수와 같은 튜브에 남아있는 세포를 수집을 위해 멸균 트립신과 잠복기 후에. </li><li> 5 분, 1,000 rpm으로 튜브 던가, 뜨는 떠나는 0.5 ML을 대기음 오직 손가락으로 flicking하여 펠렛을 푸세요. </li><li> 펠렛의 크기에 따라, DH 2 O에서 0.56 %의 KCl의 hypotonic 솔루션의 5-10 ML을 추가하고 30-45 분 동안 37 ° C에서 정학을 품어. </li><li> 메탄올 / 초산 한 방울 추가(3시 1분 권 / 권) 당 ML hypotonic 세포 현탁액과 믹싱을 위해 부드럽게 튜브를 바꾸란. </li><li> continously 펠렛을 flicking 동안 5 분 동안 1,200 rpm으로 원심과 스텝 1.4으로 펠렛을 수집 후 신선한 메탄올 / 초산 (3시 1분 권 / 권) 정착액 솔루션 dropwise 5 ML에 추가합니다. 이 절차는 metaphase 확산이 실험에 해가 될 세포 &#39;대단히 짧은 시간에 갇혀되지 않도록 중요합니다. </li><li> 5 분을위한 1,200 rpm으로 다시 원심 분리기와 튜브 벽을 따라 얼음처럼 차가운 메탄올 / 아세트산 정착액의 5-10 ML을 추가합니다. 필요한 경우이 단계에서는, 세포는 단기 또는 -80 용 -20 ° C에서 강화하고 밀폐 튜브에 고정력있는 용액에 저장할 수 ° C에서 나중에 사용할 장기 (년)입니다. </li><li> 절대 에탄올의 클린 슬라이드 다음 슬라이드의 표면에 물을 칼집을 형성하기 위해 approximately10X 대한 DH 2 O의 슬라이드를 찍어. (단계 1.8에서 세포 현탁액의 유리 접시 놓기 15-20μl에 슬라이드를 놓으십시오) &quot;에서 10 슬라이드 위에. 1-2 분 65-70에서 설정 물 목욕 ° C에서 슬라이드를 삽입하고 건조 수 있습니다. </li><li> metaphase의 염색체와 확산이 균등하게 게재됩니다이 확인하는 10X 및 40X 건조 목표를 사용하여 가벼운 현미경 슬라이드를 확인합니다. 염색체를 둘러싼 세포질에 존재를 확인합니다. 세포질은 현재 슬라이드 전처리 (펩신의 소화)을 진행하는 경우에는 세포질이 존재하지 않고 염색체가 좋은 형태가있다면 다음 슬라이드 전처리를위한 필요가 없습니다. </li></ol> 2. 슬라이드 전처리 (펩신 처리) <ol><li> X 60mm 현미경의 coverglass 24mm에 2X-SSC에 녹아있는 1:200 RNase 용액 (20 밀리그램 / ML) 120 μl를 적용하고 metaphase 슬라이드 얼굴 반전을 부드럽게 coverglass에 metaphase 슬라이드 얼굴을 아래로 반전과에서 부화 37 ° C 45 분입니다. </li><li> 조심스럽게 15 분 때마다 5 분 슬라이드를 긁적없이 coverglass를 제거하고 coplin 항아리에 2X-SSC 버퍼에 씻어떨고있는. </li><li> 깨끗한 비커에 펩신 주식 솔루션의 5-15 μl (DH 2 O 100 밀리그램 / ML)를 추가하고 prewarmed 100 ML 추가 (를 37 ° C) 0.01M HCL. 그것은 펩신이 깨끗한로 추가되는 것이 중요합니다 직접 HCL 용액으로 먼저하지 비커가, 그렇지 않으면 그것은 용액에 용해되지 것입니다. 37 HCL / 펩신 용액을 포함 coplin 항아리에 슬라이드를 품어 3-5 분 ° C에서. 너무 많은 소화가 염색체가 overdigested되는 원인이되며 너무 적게 소화는 프로브가 아닌 특정 바인딩으로 이어질과 하이브리드화 신호를 방해할 수있는 세포질은 소화되지 않은 떠날하므로이 단계는 매우 중요합니다. </li><li> 상온에서 두 번 5 분 동안 100 ML-1X PBS를 포함 coplin 항아리에 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 실온 (1X-PBS은 950 ML에 1M MgCl 2의 50 ML)에서 5 분 동안 100 ML 1X-PBS/MgCl 2를 포함하는 coplin 항아리에 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> coplin 항아리 containin에있는 슬라이드를 삽입실온 (1X-PBS/MgCl 2의 100 ML 37 %의 포름 알데히드의 1.7 ML)에서 10 분 g 100 ML 1 %의 포름 알데히드. </li><li> 5 분 동안 100 ML-1X PBS를 포함 coplin 항아리에 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 슬라이드가 제대로 소화되며 세포질이 존재하지 않고 염색체 형태가 보존되도록 40X 건조한 렌즈를 사용하여 가벼운 현미경 슬라이드를 관찰. 다이아몬드 펜을 사용하여 하이브 리다이 제이션을위한 영역을 선택합니다. </li></ol> 3. 염색체와 프로브 변성과 하이브리드화 <ol><li> 신선한 denaturing 용액 (70 % formamide/2X SSC, 산도 7.0) 및 70-80까지 prewarm ° C ~ 70 물 목욕에 denaturing 솔루션을 포함하는 coplin 항아리에 슬라이드 물 목욕 장소에 배치 coplin 항아리에 ° 준비 마우스 염색체 80에 해당하는 C ° C ~ 30 대 - 1.5 분 인간의 염색체를위한. </li><li> 바로 3 분 각각의 공기 건조 3 80 % 다음 분 및 100 % 에탄올에 대해 얼음처럼 차가운 70 % 에탄올에 슬라이드를 넣습니다. 슬라이드를 검사염색체 형태입니다. 좋은 염색체 형태는 어두운 염색체가 아닌 &quot;위상 빛&quot;또는 후광 염색체으로 표시됩니다. </li><li> 몇 초 동안 1,000 rpm으로 짧게 20 분, 와동 및 원심 젖는와 37 ° C에서, SkyPaint 프로브 (유리병 # 1 스카이 페인트 키트)를 따뜻하게. </li><li> preannealing 위해 라벨 - 프로브 DNA를 허용하는 60 분 동안 37 ° C이어서 5 분주기 위해 85 ° C에서 두 단계의주기 위해 프로그래밍 thermocycler에 프로브를 변성. </li><li> 22mm와 하이브리드화 및 커버 영역에 변성 프로브의 10μl를 적용 기포를 잡을수 않도록하는 X 40mm의 coverglass. 48-72 시간 동안 37 ° C에서 humidified 챔버의 고무 시멘트와 부화와 coverglass의 가장자리를 밀봉합니다. </li></ol> 4. 형광 프로브 감지 <ol><li> 신중 coverglass를 제거하고 포함된 coplin 항아리에 슬라이드를 배치 prewarmed (45 ° C) 솔루션을 씻는 I (2X SSC의 신선한 50 % 포름 아미드). 5 분 동안 씻으45 세 번이나 45 rpm으로 흔들어 물을 욕조에 ° C </li><li> 떨고로 5 분 대한 ° C ~ 두번 45 용액 II (1X SSC)를 세척에서 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 45시 5 분에 대한 해결책 III을 (4X SSC/0.1 % 십대 초반 20) 세정 ° C를 흔들어으로 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 차단 시약의 80 μl (스카이 페인트 키트, 유리병 # 2)를 적용, 30 분 동안 37 ° C에서 coverslip과 부화를 놓습니다. </li><li> 슬라이드를 제거하고 액체 드레인 수 있습니다. Cy5 염색법 시약 (고농도 항체 검출 CAD 키트, 유리병 # 3)의 80 μl를 적용, 40 분 동안 37 ° C에서 coverglass과 부화를 적용합니다. </li><li> 떨고으로 5 분 동안 45 ° C에서 세 번 용액 III을 세척과 함께 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> Cy5.5 염색법 시약 (고농도 항체 검출 CAD 키트, 유리병 # 4) 80 μl를 적용, 40 분 동안 37 ° C에서 coverglass과 부화를 놓습니다. </li><li> 떨고으로 5 분 동안 45 ° C에서 세 번 용액 III을 세척과 함께 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 슬라이드를 기울이고 유체에 허용<html> 배수. 안티 페이드 DAPI 시약 (스카이 페인트 키트, 유리병 # 5) 20 μl를 적용하고 X 60mm 현미경의 coverglass 24mm 넣으십시오. 조심스럽게 형성했을 수도 기포를 제거합니다. 슬라이드 바로 몇 군데 또는 4에 저장할 수 일주보다 더 이상의 어둠 속에서 ° C에서. </li></ol> 5. 이미지 수집 및 분석 <ol><li> 이미지 취득 60X 기름 침지 렌즈, CCD 카메라와 스펙트럼 큐브 (사용자 정의 설계된 트리플 밴드 패스 필터), DAPI 필터 sagnac 간섭계 모듈을 갖춘 올림푸스 현미경을 사용하여 metaphase 슬라이드를 보는하여 수행됩니다. </li><li> 스펙트럼-Karyotypes은 사용자의 설명서에 따라 스카이 뷰 소프트웨어 (응용 스펙트럼 이미징 버전 1.62)를 사용하여 수행되었다. </li><li> 이미지를 분석 후, 염색체는 컬러 이미지 (특정 형광 색상), 의사 컬러 이미지 (구분을위한 색상)과 거꾸로 DAPI 이미지 (특정 banding 패턴)로 볼 수 있습니다. </li></ol>e_title &quot;&gt; 6. 대표 결과 전체 SKY 절차는 일반적으로 일주일에 하루는 시간 (그림 1) 소요됩니다. 이것은 metaphase 세포가 적절한 공급에 한해 이미지 수집 및 분석을 포함합니다. Karyotyping 분석은 야생 형 마우스 (그림 2A)에서 세포의 정상적인 마우스 핵형을 (40, XY) 밝힌다. 반대로, Pkd1의 세포는 - / - 마우스 (PKD 마우스 모델) 염색체 번호와 같은 염색체 삭제 (염색체 # 8)과 translocations (염색체 # 11, 19) (그림 2B)와 같은 구조적 이상에서 상당한 증가를 보여줍니다. 우리는 또한 ADPKD 환자에서 혈관 조직을 분석했다. 염색체 숫자를 계산하여 간단한 연구는 비 ADPKD와 일부 ADPKD 혈관 샘플 23쌍 정상 염색체 숫자 (그림 2C)을 가지고 있다고 지적했다. 그러나 일반적으로, 우리는에서 염색체 46 쌍으로 결과, 염색체 분리의 실패를 관찰DPKD 샘플 대신 23 쌍 (그림 2D). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3887/3887fig1.jpg" /> 1 그림. SKY 프로토콜 순서도 있습니다. 스카이 프로토콜의 흐름 차트는 이미지 수집 및 분석으로 세포 전처리와 metaphase의 준비부터 실험을 완료하는 단계를 보여줍니다. 대략 1 주일 스케줄은 매일 매일 단계별 절차는 왼쪽에 표시됩니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3887/3887fig2.jpg" /> 그림 2. 불후의 마우스 세포 라인과 갓 고립된 인간의 일차 세포에 대한 분광 karyotyping가. 색상 및 개별 염색체의 거꾸로 DAPI 이미지는 염색체 정렬하기 전에 표시됩니다. 정렬 후, 염색체는 &quot;분류&quot;테이블에 표시됩니다. 야생 형 마우스 metaphase 확산의) 스카이 이미지 (40, XY) 정상 핵형을 설명합니다. B)이 </st스카이 마우스가 비정상적 염색체 번호 (68 대신 40) 등 염색체 삭제 (염색체 # 8)과 염색체 translocations (염색체 # 11 및 19)과 같은 염색체 이상을 보여줍 C) - / -. Pkd1에서 metaphase의 소문의 주인 공인 국영&gt; 스카이 이미지 비 ADPKD 환자의 혈관 조직에서 metaphase의 전파의 이미지는 정상 핵형 (46, XX). d)에 ADPKD 환자의 혈관 조직에서 metaphase 확산의 스카이 이미지 (92, XXXX) 비정상 핵형이 포함되어 있습니다. 데이터의 일부는 이전에보고하고 허가를 14으로 재사용되었습니다.

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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

스펙트럼 Karyotyping (SKY)는 게놈 및 염색체 작곡을 공부에 사용 cytogenetics의 기술이다. 이 기술은 염색체 페인팅 프로브 활용, 이러한 프로브 감지 sagnac 간섭계를 통해 찾았습니다. 전체 SKY 과정은 보통 일주일에 하루는 걸립니다, 그리고 몇 가지 주요 단계 (그림 1)을 포함한다. SKY 먼저 빠디야-내시 외 3 설명한 표준 프로토콜을 사용합니다. 프로토콜은 이후 우리를 포함?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro Mediatech 주식 회사 </td><td> 10-013 - 이력서 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 (FBS) </td><td> Hyclone </td><td> SH30088-03 </td><td></td></tr><tr><td> Penecillin / 스트렙토 마이신 </td><td> 써모 과학 </td><td> SV30010 </td><td></td></tr><tr><td> Colcemid </td><td> 로슈 진단 </td><td> 10 295 892 001 </td><td> 10 μg / ML </td></tr><tr><td> HCL </td><td> 피셔 과학 </td><td> A144-500 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> 피셔 과학 </td><td> S77375-1 </td><td></td></tr><tr><td> 인산염은 염분 버퍼 </td><td> 써모 과학 </td><td> SH30256-01 </td><td></td></tr> &lt;TR&gt; <td> 스카이 페인트 프로브 키트 (인간) </td><td> 응용 스펙트럼 이미징 </td><td> SKY000028 </td><td></td></tr><tr><td> 스카이 페인트 프로브 키트 (마우스) </td><td> 응용 스펙트럼 이미징 </td><td> SKY000030 </td><td></td></tr><tr><td> 농축 항체 검출 키트 </td><td> 응용 스펙트럼 이미징 </td><td> SKY000033 </td><td></td></tr><tr><td> 트립신 </td><td> 써모 과학 </td><td> SH30236.01 </td><td></td></tr><tr><td> 메탄올 </td><td> 피셔 과학 </td><td> A433P-4 </td><td></td></tr><tr><td> 초산 </td><td> 피셔 과학 </td><td> A38-212 </td><td></td></tr><tr><td> RNase </td><td> 로슈 진단 </td><td> 10 109 169 001 </td><td></td></tr><tr><td> 펩신 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P6887-5G </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Fluka </td><td> 63069-500ML </td><td></td></tr><tr><td> 37%의 포름 알데히드 </td><td> Mallinckrodt 베이커 </td><td> 2106-02 </td><td></td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> Promega </td><td> V4261 </td><td></td></tr><tr><td> 포름 아미드 </td><td> Fluka </td><td> 47,671 </td><td> 사용하기 전에 그냥 준비 </td></tr><tr><td> 십대 초반-20 </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP337-500 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경의 유리 슬라이드 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 12-549 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 덮개 유리 24x60mm </td><td> VWR 비스타 비전 </td><td> 16004-312 </td><td></td></tr><tr><td> 고무 시멘트 </td><td> 엘머 (현지 소매점) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 하이브리드화 / humidifiedchamber / 트레이 </td><td> Simport </td><td> M920-2 </td><td> 하단에 젖은 종이 수건을 넣어 </td></tr><tr><td> 써모자전거 타는 사람 </td><td> Eppendorf </td><td> Epgradient S </td><td></td></tr><tr><td> 플랫폼을 떨고 / 궤도 흔드는 </td><td> Bellco 생명 공학 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 흔들어봐 / 물 목욕 </td><td> 정밀 과학 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DAPI 필터 큐브 </td><td> 채도 기술 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SKY 필터 큐브 </td><td> 채도 기술 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SpectraCube </td><td> 응용 스펙트럼 이미징 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 거꾸로 세포 배양 현미경 </td><td> 니콘 </td><td> 니콘 이클립스 TS100 </td><td></td></tr><tr><td> 형광 현미경 </td><td> 올림포스 산 </td><td> IX70 </td><td> 60X 오일 </td></tr></tbody></table>

spectral karyotyping to study chromosome abnormalities in humans and mice with polycystic kidney disease

식별하고 각각의 염색체를 분류하는 종래의 방법은 1, 2를 분석중인 특정 종족의 각 염색체의 독특한 banding 패턴에 따라 달라집니다. 이것은 고전 banding 기술은 그러나, 그러한 암과 연관된 것과 같은 복잡한 염색체 aberrations을 확인하는 신뢰할 수 없습니다. banding 기술의 한계를 극복하기 위해 스펙트럼 Karyotyping (SKY)는 염색체 이상에 대한 많은 신뢰할 수있는 정보를 제공하기 위해 도입된다. 하늘은 여러 가지 빛깔의의 형광에 원위치 하이브리드화 (물고기) 분광 현미경 3, 4 metaphase 염색체를 감지하는 기술입니다. 하늘이 유전 질환과 malignancies 5, 6의 큰 번호와 연관된 염색체 이상의 광범위한 범위의 cytogenetic 분석에 유용한 도구로 입증되었습니다. 하늘은 타락한 oligonucle에서 준비한 여러 가지 빛깔의 fluorescently-라벨의 DNA 프로브의 사용과 관련된PCR에 의한 otide primers. 따라서, 모든 염색체는 differentially 형광 염료의 혼합물 (Rhodamine, 텍사스 빨강, Cy5, FITC와 Cy5.5)으로 표시되는 프로브와 원위치 하이브리드화 후 독특한 스펙트럼 색상을 가지고 있습니다. SKY에 사용되는 프로브는 7-10 55 번 염색체 특정 프로브에로를 구성됩니다. SKY에 대한 절차는 여러 단계 (그림 1)을 포함한다. 스카이는 정상이나 병에 걸린 조직이나 혈액에서 높은 mitotic 지수와 세포의 가용성을 필요로합니다. 갓 격리 기본 셀 또는 셀 라인 중 하나에서 단일 세포의 염색체는 유리 슬라이드에 전파됩니다. 이 염색체 확산은 각 염색체의 특정 형광 염료의 다른 조합으로 표시됩니다. 프로브 감지 및 이미지 수집의 경우 스펙트럼 이미징 시스템 sagnac 간섭계와 CCD 카메라로 구성되어 있습니다. 이것은 시료로부터 방출되는 가시 광선 스펙트럼의 측정이 가능하며 오가는 스펙트럼 이미지를 얻기 위해m 각 염색체. HiSKY, 촬영된 이미지의 결과를 분석하는 데 사용되는 소프트웨어는 염색체 이상 현상의 쉬운 식별을 제공합니다. 최종 결과는 metaphase와 염색체의 각 페어는 독특한 컬러 (그림 2)를 가지고있는 핵형 분류 이미지입니다. 이것은 염색체 정체성과 translocations을 쉽게 식별할 수 있습니다. 자세한 내용은 응용 스펙트럼 이미징 홈페이지를 (참조하십시오 <a href="http://www.spectral-imaging.com/" target="_blank">http://www.spectral-imaging.com/</a> ). 스카이는 최근 염색체 분리 결함 및 Autosomal 지배 Polycystic 신장 질환 (ADPKD), 기본 속눈썹 11-13의 장애가 특징 유전 질환과 인간과 생쥐의 염색체 이상의 식별을 위해 사용되었다. 이 기법을 사용하여, 우리는 ADPKD 환자와 마우스 모델 14 비정상적인 염색체 분리 및 염색체 결함의 존재를 증명. SKY를 사용하여 더 자세한 분석은 우리가 염색체 번호와 ID를 식별하는 것이 아니라 정확하게 같은 염색체 삭제 및 translocations (그림 2)와 같은 매우 복잡한 염색체 aberrations를 검색할 수 없습니다 전용.

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Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

스펙트럼 Karyotyping (SKY)는 게놈 및 염색체 aberrations를 식별하기위한 고급 cytogenetics의 기술이다. 이 기술은 모든 염색체의 분류를 허용하는 염색체 페인팅 프로브를 이용 걸립니다. 스카이는 또한 polycystic 신장병 등 각종 질병을 가진 생쥐와 인간의 복잡한 염색체 aberrations 및 분리 결함을 식별할 수 있습니다.

Polycystic 신장 질환과 함께 인간과 마우스의 염색체 이상을 공부하는 스펙트럼 Karyotyping

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

38.2K 조회수.  University of Toledo, College of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 스펙트럼 Karyotyping (SKY)는 게놈 및 염색체 aberrations를 식별하기위한 고급 cytogenetics의 기술이다. 이 기술은 모든 염색체의 분류를 허용하는 염색체 페인팅 프로브를 이용 걸립니다. 스카이는 또한 polycystic 신장병 등 각종 질병을 가진 생쥐와 인간의 복잡한 염색체 aberrations 및 분리 결함을 식별할 수 있습니다.

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Orthotopic Aortic Transplantation in Mice for the Study of Vascular Disease

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. This is largely true, but there are a number of important principles that can reduce the difficulty of these procedures and enhance reproducibility. Orthotopic aortic transplantation is an excellent procedure in which to learn these principles because it involves only two end-to-end anastomoses, but requires good suturing technique and handling of the vessels for consistent success. This procedure begins with the procurement of a length of abdominal aorta from a donor animal, followed by division of the native aorta in the recipient. The procured aorta is then placed between the divided ends of the recipient aorta and sutured into place using end-to-end anastomoses. To accomplish this objective successfully requires a high degree of concentration, good tools, a steady hand, and an appreciation of how easily the vasculature of a mouse can be damaged, resulting in thrombosis. Learning these important principles is what occupies most of the beginner's time when learning microsurgery in small rodents. Throughout this protocol, we refer to these important points. This model can be used to study vascular disease in a variety of different experimental systems1-8. In the context shown here, it is most often used for the study of post-transplant vascular disease, a common long-term complication of solid organ transplantation in which intimal hyperplasia occurs within the allograft. The primary advantage of the model is that it facilitates quantitative morphometric analyses and the transplanted vessel lies contiguous to the endogenous vessel, which can serve as an additional control9. The technique shown here is most often used for mice weighing 18-25 grams. We have accumulated most of our experience using the C57BL/6J, BALB/cJ, and C3H/HeJ strains.

We describe a technique in which a section of the abdominal aorta from a mouse is transplanted orthotopically to just below the renal arteries in an allogeneic or syngeneic recipient. This technique can be useful in studies in which transplantation of large arteries of uniform size is deemed advantageous.

혈관 질병의 연구에 대한 마우스의 Orthotopic 대동맥 이식

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. ...

연구

의학

5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements of homeostasis, integrative animal models are necessary to study development and progression of CKD. To study development of CKD and novel therapeutic interventions in CKD, we use the 5/6th nephrectomy ablation model, a well known experimental model of progressive renal disease, resembling several aspects of human CKD. The gross reduction in renal mass causes progressive glomerular and tubulo-interstitial injury, loss of remnant nephrons and development of systemic and glomerular hypertension. It is also associated with progressive intrarenal capillary loss, inflammation and glomerulosclerosis. Risk factors for CKD invariably impact on endothelial function. To mimic this, we combine removal of 5/6th of renal mass with nitric oxide (NO) depletion and a high salt diet. After arrival and acclimatization, animals receive a NO synthase inhibitor (NG-nitro-L-Arginine) (L-NNA) supplemented to drinking water (20 mg/L) for a period of 4 weeks, followed by right sided uninephrectomy. One week later, a subtotal nephrectomy (SNX) is performed on the left side. After SNX, animals are allowed to recover for two days followed by LNNA in drinking water (20 mg/L) for a further period of 4 weeks. A high salt diet (6%), supplemented in ground chow (see time line Figure 1), is continued throughout the experiment. Progression of renal failure is followed over time by measuring plasma urea, systolic blood pressure and proteinuria. By six weeks after SNX, renal failure has developed. Renal function is measured using 'gold standard' inulin and para-amino hippuric acid (PAH) clearance technology. This model of CKD is characterized by a reduction in glomerular filtration rate (GFR) and effective renal plasma flow (ERPF), hypertension (systolic blood pressure&gt;150 mmHg), proteinuria (&gt; 50 mg/24 hr) and mild uremia (&gt;10 mM). Histological features include tubulo-interstitial damage reflected by inflammation, tubular atrophy and fibrosis and focal glomerulosclerosis leading to massive reduction of healthy glomeruli within the remnant population (&lt;10%). Follow-up until 12 weeks after SNX shows further progression of CKD.

A two-stage method to establish chronic kidney disease (CKD) in the Lewis rat by surgically removing 5/6th of renal mass is described. Combination of the surgical procedure, NOS-inhibition and a high-salt diet leads to a model resembling human CKD, allowing study of causal mechanisms and development of novel therapeutic interventions.

높은 소금 다이어트와 루이스 쥐에서 만성 신장 질환을 유발하는 산화 질소 합성 효소 억제와 함께 5/6th의 절제

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this is only partially explained by traditional CVD risk factors. Vascular dysfunction is an important non-traditional risk factor, characterized by vascular endothelial dysfunction (most commonly assessed as impaired endothelium-dependent dilation [EDD]) and stiffening of the large elastic arteries. While various techniques exist to assess EDD and large elastic artery stiffness, the most commonly used are brachial artery flow-mediated dilation (FMDBA) and aortic pulse-wave velocity (aPWV), respectively. Both of these noninvasive measures of vascular dysfunction are independent predictors of future cardiovascular events in patients with and without kidney disease. Patients with CKD demonstrate both impaired FMDBA, and increased aPWV. While the exact mechanisms by which vascular dysfunction develops in CKD are incompletely understood, increased oxidative stress and a subsequent reduction in nitric oxide (NO) bioavailability are important contributors. Cellular changes in oxidative stress can be assessed by collecting vascular endothelial cells from the antecubital vein and measuring protein expression of markers of oxidative stress using immunofluorescence. We provide here a discussion of these methods to measure FMDBA, aPWV, and vascular endothelial cell protein expression.

The degree of vascular dysfunction and contributing physiological mechanisms can be assessed in patients with chronic kidney disease by measuring brachial artery flow-mediated dilation, aortic pulse-wave velocity, and vascular endothelial cell protein expression.

만성 신장 질환 환자에서 혈관 기능의 평가

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to &#8220;off-target&#8221; effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

다낭성 신장 질환의 가능한 제브라 피쉬 모델 :의 넉다운<em&gt; wnt5a</em&gt; Zebrafish의 신장의 낭종 원인

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular mechanisms responsible for the disease, and are very convenient for rapid drug screening and testing of promising therapies. A limiting factor in these studies is often the lack of efficient non-invasive methods for sequentially analyzing the anatomical and functional changes in the kidney. Magnetic resonance imaging (MRI) is the current gold standard imaging technique to follow autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients, providing excellent soft tissue contrast and anatomic detail and allowing Total Kidney Volume (TKV) measurements.A major advantage of MRI in rodent models of PKD is the possibility for in vivo imaging allowing for longitudinal studies that use the same animal and therefore reducing the total number of animals required. In this manuscript, we will focus on using Ultra-high field (UHF) MRI to non-invasively acquire in vivo images of rodent models for PKD. The main goal of this work is to introduce the use of MRI as a tool for in vivo phenotypical characterization and drug monitoring in rodent models for PKD.

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

The use of ultra-high field MRI as a non-invasive way to obtain phenotypic information of rodent models for polycystic kidney disease and to monitor interventions is described. Compared with the traditional histological approach, MRI images can be acquired in vivo, allowing for longitudinal follow-up.

대한 다낭성 신장 질환의 작은 설치류 모델에서 매우 높은 필드 MRI의 사용<em&gt; 생체</em&gt; 표현형 의약품 모니터링

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

Symmetric Bihemispheric Postmortem Brain Cutting to Study Healthy and Pathological Brain Conditions in Humans

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena described in those patients for whom a brain autopsy has been requested. Although the advancements of biomedical sciences and neuroimaging have revolutionized the neuropsychiatric field, they have also generated the misleading idea that brain autopsies have only a confirmatory value. This false idea created a drastic reduction of autopsy rates and, consequently, a reduced possibility to perform more detailed and extensive neuropathological investigations, which are necessary to comprehend numerous normal and pathological aspects yet unknown of the human brain. The traditional inferential method of correlation between observed neuropsychiatric phenomena and corresponding localization/characterization of their possible neurohistological correlates continues to have an undeniable value. In the context of neuropsychiatric diseases, the traditional clinicopathological method is still the best possible methodology (and often the only available) to link unique neuropsychiatric features to their corresponding neuropathological substrates, since it relies specifically upon the direct physical assessment of brain tissues. The assessment of postmortem brains is based on brain cutting procedures that vary across different neuropathology centers. Brain cuttings are performed in a relatively extensive and systematic way based on the various clinical and academic contingencies present in each institution. A more anatomically inclusive and symmetric bi-hemispheric brain cutting methodology should at least be used for research purposes in human neuropathology to coherently investigate, in depth, normal and pathological conditions with the peculiarities of the human brain (i.e., hemispheric specialization and lateralization for specific functions). Such a method would provide a more comprehensive collection of neuropathologically well-characterized brains available for current and future biotechnological and neuroimaging techniques. We describe a symmetric bi-hemispheric brain cutting procedure for the investigation of hemispheric differences in human brain pathologies and for use with current as well as future biomolecular/neuroimaging techniques.

Organized brain cutting procedures are necessary to correlate specific neuropsychiatric phenomena with definitive neuropathologic diagnoses. Brain cuttings are performed differently based on various clinico-academic contingencies. This protocol describes a symmetric bihemispheric brain cutting procedure to investigate hemispheric differences in human brain pathologies and to maximize current and future biomolecular/neuroimaging techniques.

인간의 건강과 병리학 적 뇌 조건을 연구에 절단 대칭 Bihemispheric 사후 뇌

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena ...

A Model to Simulate Clinically Relevant Hypoxia in Humans

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to hypoxia sensitive organs such as the brain, compensatory circulatory mechanisms help to maintain an adequate oxygen supply. This is mainly achieved by increased cerebral blood flow. Intermittent hypoxia is a commonly seen phenomenon in patients with obstructive sleep apnea. Acute airway obstruction can also result in hypoxia and hypercapnia. Until now, no adequate model has been established to simulate these dynamics in humans. Previous investigations focusing on human hypoxia used inhaled hypoxic gas mixtures. However, the resulting hypoxia was combined with hyperventilation and is therefore more representative of high altitude environments than of apnea. Furthermore, the transferability of previously performed animal experiments to humans is limited and the pathophysiological background of apnea induced physiological changes is poorly understood. In this study, healthy human apneic divers were utilized to mimic clinically relevant hypoxia and hypercapnia during apnea. Additionally, pulse-oximetry and Near Infrared Spectroscopy (NIRS) were used to evaluate changes in cerebral and peripheral oxygen saturation before, during, and after apnea.

Hypoxia simulation in humans has usually been performed by inhaling hypoxic gas mixtures. For this study, apneic divers were used to simulate dynamic hypoxia in humans. Additionally, physiological changes in desaturation and re-saturation kinetics were evaluated with non-invasive tools such as Near-Infrared-Spectroscopy (NIRS) and peripheral oxygenation saturation (SpO2).

A 모델은 인간의 임상 관련 저산소증을 시뮬레이션하기

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to ...

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the present protocol, mice expressing green fluorescent protein (gfp) under the promoter of Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) were used to image microglia cells in vivo in the retina. Microglia are resident macrophages of the retina and have been implicated in several retinal diseases1,2,3,4,5,6. This protocol provides a detailed approach for generation of retinal B-scans, with SD-OCT, and imaging of microglia cell distribution in Cx3cr1gfp/gfp mice with SLO in vivo, using an ophthalmic imaging platform system. The protocol can be used in several reporter mouse lines. However, there are some limitations to the protocol presented here. First, both SLO and SD-OCT, when used in the high-resolution mode, collect data with high axial resolution but the lateral resolution is lower (3.5 &#181;m and 6 &#181;m, respectively). Moreover, the focus and saturation level in SLO is highly dependent on parameter selection and correct alignment of the eye. Additionally, using devices designed for human patients in mice is challenging due to the higher total optical power of the mouse eye compared to the human eye; this can lead to lateral magnification inaccuracies7, which are also dependent on the magnification by the mouse lens among others. However, despite that the axial scan position is dependent upon lateral magnification, the axial SD-OCT measurements are accurate8.

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

This protocol describes how high-resolution imaging techniques such as spectral domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy can be utilized in small rodents, using an ophthalmic imaging platform system, to obtain information on retinal thickness and microglial cell distribution, respectively.

Vivo에서 스펙트럼-도메인 광학 일관성 단층 촬영 스캐닝 레이저 Ophthalmoscopy와 Cx3cr1gfp/gfp 기자 쥐의 이미징

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function in diabetic nephropathy and podocyte-specific VEGF-A knock-out mice; therefore, this protocol describes the full kidney work-up used in our lab to assess these mouse models of glomerular disease, enabling a vast amount of information regarding kidney and glomerular function to be obtained from a single mouse. In comparison to alternative methods presented in the literature to assess glomerular function, the use of the method outlined in this paper enables the glomerular phenotype to be fully evaluated from multiple aspects. By using this method, the researcher can determine the kidney phenotype of the model and assess the mechanism as to why the phenotype develops. This vital information on the mechanism of disease is required when examining potential therapeutic avenues in these models. The methods allow for detailed functional assessment of the glomerular filtration barrier through measurement of the urinary albumin creatinine ratio and individual glomerular water permeability, as well as both structural and ultra-structural examination using the Periodic Acid Schiff stain and electron microscopy. Furthermore, analysis of the genes dysregulated at the mRNA and protein level enables mechanistic analysis of glomerular function. This protocol outlines the generic but adaptable methods that can be applied to all mouse models of glomerular disease.

This protocol describes a full kidney work-up that should be carried out in mouse models of glomerular disease. The methods allow for detailed functional, structural, and mechanistic analysis of glomerular function, which can be applied to all mouse models of glomerular disease.

신장 기능 사 질병 마우스 모델에서의 평가

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney Using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models

microRNAs&#160;(miRNAs), small noncoding RNAs (21-25 bases) that are not translated into proteins, inhibit lots of target messenger RNAs (mRNAs) by destabilizing and inhibiting their translation in various kidney diseases. Therefore, alternation of miRNA expression by exogenous artificially synthesized miRNA mimics is a potentially useful treatment option for inhibiting the development of many kidney diseases. However, because serum RNAase immediately degrades systematically administered exogenous miRNA mimics in vivo, delivery of miRNA to the kidney remains a challenge. Therefore, vectors that can protect exogenous miRNA mimics from degradation by RNAase and significantly deliver them to the kidney are necessary. Many studies have used viral vectors to deliver exogenous miRNA mimics or inhibitors to the kidney. However, viral vectors may cause an interferon response and/or genetic instability. Therefore, the development of viral vectors is also a hurdle for the clinical use of exogenous miRNA mimics or inhibitors. To overcome these concerns regarding viral vectors, we developed a nonviral vector method to deliver miRNA mimics to the kidney using tail vein injection of polyethylenimine nanoparticles (PEI-NPs), which led to significant overexpression of target miRNAs in several mouse models of kidney disease.

Here, we deliver exogenous artificially synthesized miRNA mimics to the kidney via tail vein injection of a nonviral vector and polyethylenimine nanoparticles in several kidney disease mouse models. This led to significant overexpression of target miRNA in the kidney, resulting in inhibited progression of kidney disease in several mouse models.

여러 신장 질환 마우스 모델에서 폴리에틸레니민 나노입자를 사용하여 신장에 외인성 인공 합성 miRNA 모방체의 전달

microRNAs&#160;(miRNAs), small noncoding RNAs (21-25 bases) that are not translated into proteins, inhibit lots of target messenger RNAs (mRNAs) by ...