이 작품은 NIH / NIDCR 부여 1R01DE019796에 의해 지원되었다.

제시 LEO-워크 플로우는 단백질의 안정 동위 원소 라벨 요약 및 합성 펩티드를 위해 수 있습니다. 이 시간 코스 실험 (그림 1) 비교 및 정량 단백질 체학 연구뿐만 아니라 단백 분해 효소 연구에 적용 할 수 있습니다. 각 워크 플로우는 두 실험 단계 (그림 2)로 구성되어 있습니다 : A) 각 18 O-안정 동위 원소 인코딩 반응 (단백 분해 효소 - 촉매 펩타이드 절단의 해결 샘플링 시간, 단백 분해 효소 - 촉매 카르 복실 산소 교환 반응, 산 - 촉매 카르 복실 산소 교환 질량 분석법 18 O-정관의 속도론의 그래픽 표현에 의한 반응) 및 B) 분석. A.의 TimeCourse 실험 I. PALeO - TimeCourse : proteolytic cleavages의 단백 분해 효소 - 촉매 라벨 <ol><li> (선택 사항) 단백질 (10 μM) 및 펩티드 (250 μM)의 이황화 채권은 DTT (최종 농도 2.5 ㎜)로 감소25 MM의 NH 4 50 30 분에 부화하여 HCO 3 (모두 신선하게 조리 된) ° C. </li><li> (선택 사항) 무료 cysteines는 iodoacetamide과 alkylated합니다 (최종 농도를 10 MM) 25 MM에 NH 4 HCO 3 어둠 속에서 실온에서 30 분에 부화하여. </li><li> 관심 단백 분해 효소에 따라, 단백질 / 펩타이드 솔루션은 잔류 버퍼와 알킬화 에이전트를 제거하는 청소 업 있어야합니다. 단백질 샘플에 대한 버퍼를 교환 할 수 펩타이드 정리와 Vivaspin 원심 선기 (Sartorius)에 대한 PepClean C-18 스핀 열 (열)를 사용합니다. </li><li> / Redissolve 교환 펩티드 / 20 μl 단백 분해 효소 반응 버퍼에 단백질 (ECE-1 : 50 MM MES - ​​코, 산도 5.5, 트립신 : 25 MM NH 4 HCO 3, 산도 8.0) 1시 1분 (V / V) 마지막 H 2를 포함하는 18 O (95 %, 시그마 Isotec). </li><li> 이전 단백 분해 효소의 추가에 제로 시점 샘플을 철회 : 믹스 반응 혼합물의 0.5 μl 및 0.5 μl 알파 시아 노-4-hydroxycinnamic을산 매트릭스 (50 % 아세토 니트릴 10 MG / ML, 0.1 % TFA). Opti-TOF 384 든 대상 플레​​이트 (AB SCIEX)에 자리 샘플을하고 실온에서 용매 방울을 떠날 건조 할 때까지 (약 5 분). </li><li> 이 aliquots에 반응 솔루션을 분할. 특정 효소에 대한 실내 온도 권장 온도 :; : 첫 나누어지는이 관심의 단백 분해 효소 (0.04 NM 트립신 75 NM ECE-1) incubated 수 있습니다. 두 번째 나누어지는이 단백 분해 효소없이 incubated 수 및 제어 샘플로 제공됩니다. 첫 번째 나누어지는이 단백 분해 효소 - 촉매 18 O-라벨에 대한 표준 샘플을 나타내며 proteolytic 절단 반응의 펩타이드 및 단백질 식별, proteolytic 활동 탐지 및 모니터링에 사용할 수 있습니다. 두 번째 나누어지는 18 O-정관은 단백 분해 효소에 의해 유도되는 표시하는 데 사용됩니다, 따라서,도 라벨이나 절단이 샘플에 대한 예상된다. </li><li> 반응 aliquots를 제거하고 데로 놈들을 찾을 때까지 반응에 따라시간 간격으로 5 단계에서 cribed는 것은 적합한 것 같습니다. 위에서 설명한 반응 조건은 최대 네 일 (약 24 곳)에 대한 proteolytic 반응을 모니터링하는 데 사용됩니다. 30 분까지 매 5 분 샘플링 시작한 다음 사일 때까지 8 시간 모든 8 시간 때까지 2 시간까지 매 30 분마다 시간을 발견. 절단 제품은 처음 12 시간 내에 나타납니다과 기판은 24 시간 후에 완전히 분해해야합니다. 확장 반응 배양 시간이 더 처리 반응 중간체에서 이산 아르 안정적인 반응 제품을 정의 할 수 있습니다. 야생 시간과 배양 온도는 최적의 반응 샘플링을 보장 할 수 조절을 위해 연구 질문 및 주어진 효소 기판 쌍에 있습니다 따라. </li><li> 최종 반응 시간 지점 발견되거나 (제 B) 아래에 설명 된대로 확장 야생 간격 사이에, 든 대상 플레​​이트는 MALDI-TOF/TOF MS / MS 분석에 제출 한 후. </li></ol> II. PALeO - TimeCourse : Postdigproteolytic 테르 미니 (Termini)의 estion 라벨 <ol><li> (선택 사항) 단백질 (10 μM) 및 펩티드 (250 μM)의 이황화 채권은 50 30 분 ° C.에 부화로 25 MM NH 4 HCO 3 (모두 신선하게 조리 된)에서 DTT (최종 농도 2.5 ㎜)로 감소 </li><li> (선택 사항) 무료 cysteines는 iodoacetamide과 alkylated합니다 (최종 농도를 10 MM) 25 MM에 NH 4 HCO 3 어둠 속에서 실온에서 30 분에 부화하여. </li><li> 관심 프로테아제에 따라, 단백질 / 펩타이드 솔루션은 잔류 버퍼와 알킬화 에이전트를 제거하는 청소 업 있어야합니다. 단백질 버퍼 교환을위한 펩타이드 정리와 Vivaspin 원심 선기에 대한 PepClean C-18 스핀 열을 사용하십시오. </li><li> Redissolve / 청소 업 펩타이드 제품 / 단백질 20 μl 단백 분해 효소 반응 버퍼에 (예 트립신 : 25 MM NH 4 HCO 3, 산도 8.0) 교환 (예 : 트립신 완료의 관심 단백 분해 효소와와 다이제스트를 : 0.04 NM, 37 ° C, 12 시간). </li><li> PepClean C-18 스핀 열 정리 절단 제품. 이 단계는 잔류 단백 분해 효소 활동을 제거합니다. </li><li> Redissolve / (트립신 : 25 MM NH 4 HCO 3, 산도 8.0) 20 μl 단백 분해 효소 반응 버퍼에서 청소 업 펩타이드 제품을 교환 1시 1분 (V / V) 마지막 H 2 18 O를 포함 </li><li> 이전 효소의 추가에 제로 시점 샘플을 철회 : 반응 혼합물 및 0.5 μl 알파 시아 노-4-hydroxycinnamic 산 매트릭스 (10 MG / 50 % 아세토 니트릴의 ML, 0.1 % TFA)의 믹스 0.5 μl합니다. 든 대상 접시에 자리 샘플을과 (5 분 정도) 건조 될 때까지 실온에서 용매 방울 둡니다. </li><li> 이 aliquots에 반응 솔루션을 분할. 특정 효소에 대한 실내 온도 권장 온도 : 첫 나누어지는이 관심 단백 분해 효소 (0.04 NM 예 트립신)에 incubated 수 있습니다. 두 번째 나누어지는이 단백 분해 효소없이 incubated되고 제어 될 것입니다. 첫 번째나누어지는이 단백 분해 효소 - 촉매 18 O-postdigestion 라벨에 대한 표준 샘플을 대표하는 펩타이드 및 단백질 정량화 사용할 수 있습니다. 두 번째 나누어지는 18 O-정관은 단백 분해 효소에 의해 촉매되는 표시하는 데 사용됩니다, 따라서 어떤 라벨이 샘플에 대한 기대하지 않습니다. </li><li> 반응 aliquots을 제거하고 그들에게 7 단계에 설명 야생하여 반응을 수행합니다.) 시간 간격으로는 적합 같습니다. 예를 들어, 우리는 트립신에 의해 촉매 카르 복실 산소 교환 반응을 모니터링하기 위해 그 후 처음 30 분, 매 15 분에 매 5 분을 발견. </li><li> 최종 반응 시간 지점 발견되거나 (제 B) 아래에 설명 된대로 확장 야생 간격 사이에 든 대상 플레​​이트는 MALDI-TOF/TOF MS / MS 분석에 제출 한 후. </li></ol> III. ALeO - TimeCourse : 카르 복실 그룹의 산 - 촉매 라벨 <ol><li> 1시 1분 (V / V) t 18 O-농축 물과 개별 펩티드 (50 NM)를 품다그 존재 또는 0.1 %의 부재 (제어) (V / V) 마지막 trifluoroacetic 산성 (총 볼륨 30 μl). </li><li> 샘플로 48일에 대한 일일 반응 제품을 직접 든 대상에 알파 시아 노-4-hydroxycinnamic 산 매트릭스 (10 MG / 50 % 아세토 니트릴의 ML, 0.1 % TFA)의 0.5μl과 혼합물의 0.5 μl 나누어지는을 공동 스포팅 판. </li><li> 야생 간격 사이 제 B.에서 아래에 설명 된대로 MALDI-TOF/TOF MS / MS 분석을 위해 든 대상 플레​​이트를 제출 최종 반응 시점의 스포팅 후 </li></ol> B. MALDI-TOF/TOF는 MS / MS 데이터 수집 및 분석 <ol><li> 질량 스펙트럼은 4,800 든 TOF / TOF 분석기 (AB SCIEX)에 인수되어 있습니다. </li><li> 이전 분석에, 악기는 ± 50 PPM과 일치이 6 봉우리의 최소 수의 최대 질량 측정 오류 허용과 펩타이드 표준 혼합 (AB SCIEX TOF / TOF 악기의 보정을위한 대중 표준 키트)로 교정된다. </li><li> MS 스펙트럼 (질량 범위2000의 허용 기준 피크 강도 범위 단계 크기 50 개) - 45,000, 400 - 3800 - 4,000미터 / Z)를 조절 레이저 강도 (3400과 긍정적 인 이온 모드를 사용하여 세중의에 인수되어 있습니다. 싱글 샷은 400 총 촬영 / 스펙트럼과 하위 스펙트럼에 대한 인수 아르, 800 하위 스펙트럼 후 효력 조건을 중지 (통과 또는 실패) 획득거나 400 하위 스펙트럼 패스 승인 기준. 낮은 풍부한 샘플의 경우 나 복잡한 생물학적 배경의 존재에 MS 감지 범위의 하단 끝은 800m / z로 제기해야합니다. 또한, LC 분리 또는 앞에서 설명한대로 샘플 정리 단계로 소금 및 기타 방해 물질을 제거해야 할 수도 있습니다. </li><li> MS 데이터 파일 (. t2d 파일)은 4000 시리즈 Explorer에서 데이터 수집 소프트웨어에서 수출 및 스펙트럼 처리 및 피크 검출을위한 마스코트 증류기 소프트웨어 (매트릭스 과학)를 활용하여 자사 실험실 정보 시스템으로 가져옵니다. Isotopic 봉투deconvoluted 자동으로 메이슨 외. 12 설명 및 그룹 9 적응 하나와 유사한 알고리즘을 사용하여 결정 18 O-정관 비율입니다. 또한, 이러한 ZoomQuant 13 바이퍼 14와 같은 소프트웨어 도구뿐만 아니라 상용 소프트웨어 패키지는 BioWorks 익스프레스 (열 피셔 과학)과 마스코트 증류기 Quantitation 상자로 (매트릭스 과학) 18 O 형 데이터 15,16를 deconvolute 할 수 있습니다. 18 O-설립 비율이 (예를 들면, 16를 포함하는 펩티드 각각의 펩타이드 동위 원소 종의 상대적 기여로 표현됩니다 O, 전체 isotopic 봉투 18 O 1 또는 18 O 2). </li><li> 각 TimeCourse 실험 들어, 분자 질량 ([M + H] +) 검색된 모든 펩타이드 종은 관련 MS 데이터 파일에서 추출하고 값은 100 PPM 질량 폭에 binned하는 것입니다. </li><li>최소 t 세 [M + H] + bin을 입력해야하도록 설정되어 있습니다. 알려진 기판의 경우, 필터링 빈 목록은 ExPASy FindPept 도구 17 조 (사용 기판 펩타이드 시퀀스에서 예측 proteolytic 절단 제품의 목록과 비교됩니다 <a href="http://au.expasy.org/tools/findpept.html" target="_blank">http://au.expasy.org/tools/findpept.html</a> ) 및을 200 PPM 질량 오류 접수 허용. </li><li> MS / MS 스펙트럼은 FindPept 도구에 의해 그들과 관련된 18 O-incorporations이 빈 값에 대한 예측 절단 제품의 대량 값을 취득합니다. MS / MS 데이터가 오프 모드에서 고정 된 레이저 4,200의 강도와 CID-가스, 1kV 반사기 긍정적 인 이온 모드에서 4,800 든 TOF / TOF 분석기에 인수되어 있습니다. 50 발이 지점 40 하위 스펙트럼 (2,000 샷 / 지점의 총 항복)의 총에 하위 스펙트럼 당 무작위 패턴에 인수되어 있습니다. </li><li> MS / MS 데이터 파일 (. t2d 파일)은 4000 시리즈 Explo에서 수출 아르RER 데이터 수집 소프트웨어와 자사 실험실 정보 시스템에 수입은 봉우리가 발견되어 MS / MS 피크 목록은 해당 binned MS 데이터와 연결되어 있습니다. </li><li> 펩타이드 식별를 들어, MS / MS 피크 목록은 다음 검색 매개 변수를 사용하여 마스코트 검색 엔진을 사용하여 SwissProt 데이터베이스에 대해 검색하지 않습니다 : 더 효소 특이성, 150 PPM 전구체 이온과 0.2 다 조각 이온 질량 오차합니다. </li><li> 펩타이드 식별이 추가로 솁 첸코 외 의해 설명 된대로 Y-시리즈 조각 이온에 걸쳐 특성 18 O-결합 패턴을 확인하여 데이터 탐색기 소프트웨어 (AB SCIEX)를 사용하여 유효성을 검사 할 수 있습니다. 18. </li></ol> 스펙트럼 시간 18 O-정관 플롯의 C. 준비 스펙트럼 시간 플롯 :를 사용하여 각 반응 시간 지점에 대한 MS 데이터 파일 (. t2d 파일)로 데이터 탐색기 소프트웨어에서 내 보낸 ASCII-파일매크로와 데이터 분석 및 그래픽 소프트웨어 프로그램 (OriginLab의 예 유래)로 수입 폭포 플롯 (그림 3)으로 표시됩니다. 18 O-정관의 플롯 : 각 binned 펩타이드 절단 제품에 대한 개별 펩티드 동위 원소 종의 상대적 기여 (16 O, 18 O 1 또는 18 O 2) 모든 반응 시간 지점에서 추출하고 (그림 4) 시간이 역모를 꾸몄다.

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

안정 동위 원소 라벨과 시간이 해결 방법으로 고해상도 질량 분광법을 결합하여 PALeO-TimeCourse 방법은 펩타이드 제품의 세대의 동적 분석을 할 수 있습니다. 분석은 양적 및 질적 단백질 체학 연구를위한 안정적인 isotopically 표시 펩티드를 생성하고 proteotypic 펩티드가 생성되는이 반응 속도론을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, PALeO-TimeCourse는 특정하지 않다는 관련 조건 예를 생체에서...

<table border="1"><tbody><tr><td> 물질의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> PepClean C-18 스핀 열 </td><td> 열 </td><td> 89,870 </td></tr><tr><td> Opti-TOF 384 든 대상 판 </td><td> AB SCIEX </td><td> 1016629 </td></tr><tr><td> 4800 든 TOF / TOF </td><td> AB SCIEX </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 자료 <table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 알파 시아 노-4-hydroxycinnamic 산 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 70990-1G-F </td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 (BSA) </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> A3294-10G </td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td&gt; Acros </td><td> 16568-0050 </td></tr><tr><td> Iodoacetamide (IAM) </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 1149-5G </td></tr><tr><td> 엔도 테린은 효소-1 (ECE-1) 변환 </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 1784 - 아연 </td></tr><tr><td> 트립신 골드 </td><td> Promega </td><td> V5280 </td></tr><tr><td> 물-18 O, 97 원자 % 18 O </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 329878-1G </td></tr><tr><td> Trifluoroacetic 산 (TFA) </td><td> 열 </td><td> 28,904 </td></tr><tr><td> AB SCIEX TOF / TOF 악기의 보정을위한 대중 표준 키트 </td><td> AB SCIEX </td><td> 4333604 </td></tr></tbody></table> 표 2. 시약

protease- and acid-catalyzed labeling workflows employing 18o-enriched water

안정 동위 원소는 생물 질량 분광법에 필수적인 도구입니다. 역사적으로, 18 O-안정 동위 원소는 광범위 1-3 proteolytic 효소의 촉매 메커니즘을 연구하는 데 사용되었습니다. 대량 분석법 기반의 단백질 체학의 출현, 안정적 isotopically 풍부한 물 18 O-원자의 효소 - 촉매 결합은 양적 단백질 표현 수준을 (Fenselau 야오 4, 미야기와 라오 5 너희의 검토를 비교하는 인기있는 방법이되었다 외. 6). 18 O-라벨은 화학에 간단하고 저렴한 비용으로 대체 (예 : iTRAQ, ICAT)과 대사 (예 : SILAC) 분류 기술 7 간주됩니다. 활용 단백 분해 효소에 따라 18 O-라벨은 절단 제품 (3)의 C-터미널 카르 복실 그룹에 두 개의 18 O-원자까지의 설립 될 수 </sup&gt;. 라벨 반응은 두 개의 독립적 인 프로세스, 펩타이드 결합 절단과 카르 복실 산소 교환 반응 8로 세분화 할 수 있습니다. 우리의 PALeO (P rotease-18 O-강화 물을 mploying ssisted 난 abeling 전자) 효소 18 O-라벨의 적응, 우리는 독특한 동위 원소의 서명을 얻을을 50 % 18 O-농축 물을 활용. 고해상도와 함께 매트릭스를 이용한 레이저 탈착 이온화이 시간은 - 비행의 탠덤 질량 분석법 (MALDI-TOF/TOF MS / MS), 특성 동위 원소의 봉투 특이성의 높은 수준의 절단 제품을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 이전에 proteolytic 반응 할 10-11을 감지하고 특성화 내생 프로테아제를 9 모니터링 할 수 PALeO-방법론을 사용했습니다. PALeO는 proteolytic 절단 반응의 매우 본질을 인코딩 때문에, 실험 설정은 간단하고 생화학 enri입니다절단 제품의 chment 단계를 피할 수 있습니다. PALeO 방식을 쉽게 proteolytic 절단 반응의 역학 및 생리 조건을 나타내는 복잡한 생물 표본의 proteolysis의 (II) 분석을 모니터링은 (i) 시간 코스 실험로 확장 할 수 있습니다. PALeO - TimeCourse 실험은 복잡한 proteolytic 경로 반응의 속도 - 제한 처리 단계 및 반응 중간체를 식별하는 데 도움이됩니다. 또한, PALeO 반응은 우리가 이러한 자사의 절단 제품을 rebind 및 제 18 O-원자의 결합을 catalyze 할 수있는 세린 프로테아제 트립신과 같은 proteolytic 효소를 식별 할 수 있습니다. 이러한 &#39;이중 라벨&#39;효소 postdigestion 18 펩티드가 독점적 카르 복실 산소 교환 반응에 의해 표시되는 O-라벨, 사용할 수 있습니다. 세 번째 전략은 효소 이상 18 O-농축 물을 고용 라벨 연장 18 O-안정 동위 원소 기호를 소개 산성 pH의 조건을 사용하여펩티드에 atures.

우리는 동적으로 proteolytic 효소에 의해 생성 된 펩타이드 절단 제품에 18 O-안정 동위 원소의 결합을 모니터링 할 PALeO-TimeCourse 워크 플로를 사용했습니다. 제시 방법은 비교적 다른 기판과 단백 분해 효소의 조합에 대해 proteolytic 처리 경로를 연구 할 수있는 다양한 도구입니다. 반응의 과정을 통해 반복적으로 proteolytic 반응을 샘플링하여 PALeO-TimeCourse 실험은 기판 및 제품 abundances의 시간 ?...

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Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

채용 안정 동위 원소 라벨 작업 흐름<sup&gt; 18</sup&gt; O 강화 물 (LEO-워크 플로)는 양적 및 질적 단백질 체학 연구를위한 다양한 도구입니다. (PALeO) 단백 분해 효소를 이용한 워크 플로우에서,<sup&gt; 18</sup&gt; O-원자는 프로테아제에 의해 중재 proteolytic 절단 및 카르 복실 산소 교환 반응에 의해 소개되어 있습니다. 산 - 촉매 (ALeO) 워크 플로우에서,<sup&gt; 18</sup&gt; O-원자는 낮은 산도의 카르 복실 산소 교환에 의해 소개되어 있습니다.

도입 단백 분해 효소와 산 촉매 라벨링 워크 플로<sup&gt; 18</sup&gt; O 강화 물

Stable isotopes are essential tools in biological mass spectrometry. Historically, 18O-stable isotopes have been extensively used to study the catalytic ...

protease-acid-catalyzed-labeling-workflows-employing-18o-enriched

Research

JoVE Journal

Biology

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

11.9K 조회수.  Boston Biomedical Research Institute. 채용 안정 동위 원소 라벨 작업 흐름 18 O 강화 물 (LEO-워크 플로)는 양적 및 질적 단백질 체학 연구를위한 다양한 도구입니다. (PALeO) 단백 분해 효소를 이용한 워크 플로우에서, 18 O-원자는 프로테아제에 의해 중재 proteolytic 절단 및 카르 복실 산소 교환 반응에 의해 소개되어 있습니다. 산 - 촉매 (ALeO) 워크 플로우에서, 18 O-?...

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Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

FM 레이블을 사용하여 뉴런의 Exocytosis 측정

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

연구

생물학

Morris Water Maze Experiment

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered non-fat milk or non-toxic tempera paint, where they must swim to a hidden escape platform. Because they are in opaque water, the animals cannot see the platform, and cannot rely on scent to find the escape route. Instead, they must rely on external/extra-maze cues. As the animals become more familiar with the task, they are able to find the platform more quickly. Developed by Richard G. Morris in 1984, this paradigm has become one of the "gold standards" of behavioral neuroscience.

The Morris water maze is a well-accepted tool used to document the involvement of the hippocampus in a behavioral task.

모리스 워터 메이즈 실험

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered ...

Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases. Sigma's non-specific protease activity assay may be used as a standardized procedure to determine the activity of proteases, which is what we do during our quality control procedures. In this assay, casein acts as a substrate. When the protease we are testing digests casein, the amino acid tyrosine is liberated along with other amino acids and peptide fragments. Folin and Ciocalteus Phenol, or Folin's reagent primarily reacts with free tyrosine to produce a blue colored chromophore, which is quantifiable and measured as an absorbance value on the spectrophotometer. The more tyrosine that is released from casein, the more the chromophores are generated and the stronger the activity of the protease. Absorbance values generated by the activity of the protease are compared to a standard curve, which is generated by reacting known quantities of tyrosine with the F-C reagent to correlate changes in absorbance with the amount of tyrosine in micromoles. From the standard curve the activity of protease samples can be determined in terms of Units, which is the amount in micromoles of tyrosine equivalents released from casein per minute.
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Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases. Sigma's non-specific protease activity assay may be used as a standardized procedure to determine the activity of proteases.

시그마의 비 특정 프로 테아제의 활동 분석 - 카제인 기판으로

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases.  Sigma's non-specific protease ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells that align along each side of the heart wall, supportive alary muscles and, in adults, a layer of ventral longitudinal muscle cells. The contractile fibers house conserved constituents of the muscle cytoarchitecture including densely packed bundles of myofibrils and cytoskeletal/submembranous protein complexes, which interact with homologous components of the extracellular matrix. Here we describe a protocol for the fixation and the fluorescent labeling of particular myocardial elements from the hearts of dissected larvae and semi-intact adult Drosophila. Specifically, we demonstrate the labeling of sarcomeric F-actin and of &alpha;-actinin in larval hearts. Additionally, we perform labeling of F-actin and &alpha;-actinin in myosin-GFP expressing adult flies and of &alpha;-actinin and pericardin, a type IV extracellular matrix collagen, in wild type adult hearts. Particular attention is given to a mounting strategy for semi-intact adult hearts that minimizes handling and optimizes the opportunity for maintaining the integrity of the cardiac tubes and the associated tissues. These preparations are suitable for imaging via fluorescent and confocal microscopy. Overall, this procedure allows for careful and detailed analysis of the structural characteristics of the heart from a powerful genetically tractable model system.

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Here we describe a basic protocol for fluorescent labeling of different elements of heart tubes from larva and adult Drosophila melanogaster. These specimens are well-suited for imaging via fluorescent or confocal microscopy. This technique permits detailed structural analysis of the features of the hearts from a powerful model organism.

의 형광 라벨링 Drosophila 심장 구조

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

단백 분해 효소의 활동을 확인하는 프로 테아제 형광 검출 키트의 사용

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

항체 라벨링에 대한 Drosophila Polytene의 염색체 Squashes의 준비

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells. While fluorescent 
proteins such as green fluorescence protein (GFP) have been extensively used as fusion partners to proteins to track the properties of a protein of interest1, recent 
developments with smaller tags enable new functionalities of proteins to be examined in cells such as conformational change and protein-association 2, 3. One small 
tag system involves a tetracysteine motif (CCXXCC) genetically inserted into a target protein, which binds to biarsenical dyes, ReAsH (red fluorescent) and FlAsH 
(green fluorescent), with high specificity even in live cells 2. The TC/biarsenical dye system offers far less steric constraints to the host protein than 
fluorescent proteins which has enabled several new approaches to measure conformational change and protein-protein interactions 4-7. We recently developed 
a novel application of TC tags as sensors of oligomerization in cells expressing mutant huntingtin, which when mutated aggregates in neurons in Huntington 
disease 7. Huntingtin was tagged with two fluorescent dyes, one a fluorescent protein to track protein location, and the second a TC tag which only 
binds biarsenical dyes in monomers. Hence, changes in colocalization between protein and biarsenical dye reactivity enabled submicroscopic oligomer 
content to be spatially mapped within cells. Here, we describe how to label TC-tagged proteins fused to a fluorescent protein (Cherry, GFP or CFP) 
with FlAsH or ReAsH in live mammalian cells and how to quantify the two color fluorescence (Cherry/FlAsH, CFP/FlAsH or GFP/ReAsH combinations).

The biarsenical dyes FlAsH and ReAsH bind specifically to tetracysteine motifs in proteins and can selectively label proteins in live cells. Recently this labeling strategy has been used to develop sensors for different protein conformations or oligomeric states. We describe the labeling approach and methods to quantitatively analyze binding.

ReAsH / 플래시 라벨링 및 전지 Tetracysteine​​ 센서 단백질의 이미지 분석

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

GC-based Detection of Aldononitrile Acetate Derivatized Glucosamine and Muramic Acid for Microbial Residue Determination in Soil

Quantitative approaches to characterizing microorganisms are crucial for a broader understanding of the microbial status and function within ecosystems. Current strategies for microbial analysis include both traditional laboratory culture-dependent techniques and those based on direct extraction and determination of certain biomarkers1, 2. Few among the diversity of microbial species inhabiting soil can be cultured, so culture-dependent methods introduce significant biases, a limitation absent in biomarker analysis.
The glucosamine, mannosamine, galactosamine and muramic acid have been well served as measures of both the living and dead microbial mass, of these the glucosamine (most abundant) and muramic acid (uniquely from bacterial cell) are most important constituents in the soil systems3, 4. However, the lack of knowledge on the analysis restricts the wide popularization among scientific peers. Among all existing analytical methods, derivatization to aldononitrile acetates followed by GC-based analysis has emerged as a good option with respect to optimally balancing precision, sensitivity, simplicity, good chromatographic separation, and stability upon sample storage5.
Here, we present a detailed protocol for a reliable and relatively simple analysis of glucosamine and muramic acid from soil after their conversion to aldononitrile acetates. The protocol mainly comprises four steps: acid digestion, sample purification, derivatization and GC determination. The step-by-step procedure is modified according to former publications6, 7. In addition, we present a strategy to structurally validate the molecular ion of the derivative and its ion fragments formed upon electron ionization. We applied GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS and isotopically labeled reagents to determine the molecular weight of aldononitrile acetate derivatized glucosamine and muramic acid; we used the mass shift of isotope-labeled derivatives in the ion spectrum to investigate ion fragments of each derivatives8. In addition to the theoretical elucidation, the validation of molecular ion of the derivative and its ion fragments will be useful to researchers using &delta;13C or ion fragments of these biomarkers in biogeochemical studies9, 10.

We describe a method protocol for the GC-based analysis of the aldonitrile acetate derivatives of glucosamine and muramic acid extracted from soil. For elucidation of the chemical mechanism, we also present a strategy to confirm the structure of the derivative and the ion fragments formed upon electron ionization.

토양에 미생물 잔류 결정을위한 Aldononitrile 아세트산 Derivati​​zed 글루코사민과 Muramic 산성의 GC 기반 탐지

Quantitative approaches to characterizing microorganisms are crucial for a broader understanding of the microbial status and function within ecosystems. ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

신진 대사 레이블 및 유동세포계측법와 세포주기 진행의 동력학 측정

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines to the study of isolated rodent islets. Primary islets offer the distinct advantage that they more faithfully reflect the biology of intracellular signaling pathways and secretory responses. Whereas the method of islet isolation using tissue dissociating enzyme (TDE) preparations has been well established in many laboratories1-4, variations in the consistency of islet yield and quality from any given rodent strain limit the extent and feasibility of primary islet studies. These variations often occur as a result of the crude partially purified TDEs used in the islet isolation procedure; TDEs frequently exhibit lot-to-lot variations in activity and often require adjustments to the dose of enzyme used. A small number of reports have used purified TDEs for rodent cell isolations5, 6, but the practice is not widespread despite the routine use and advantages of purified TDEs for human islet isolations. In collaboration with VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN), we developed a modified mouse islet isolation protocol based on that described by Gotoh7, 8, in which the TDEs are perfused directly into the pancreatic duct of mice, followed by crude tissue fractionation through a Histopaque gradient9, and isolation of purified islets. A significant difference in our protocol is the use of purified collagenase (CIzyme MA) and neutral protease (CIzyme BP) combination. The collagenase was characterized by the use of a6 fluorescence collagen degrading activity (CDA) assay that utilized fluorescently labeled soluble calf skin fibrils as substrate6. This substrate is more predictive of the kinetics of collagen degradation in the tissue matrix because it relies on native collagen as the substrate. The protease was characterized with a sensitive fluorescent kinetic assay10. Utilizing these improved assays along with more traditional biochemical analysis enable the TDE to be manufactured more consistently, leading to improved performance consistency between lots. The protocol described in here was optimized for maximal islet yield and optimal islet morphology using C57BL/6 mice. During the development of this protocol, several combinations of collagenase and neutral proteases were evaluated at different concentrations, and the final ratio of collagenase:neutral protease of 35:10 represents enzyme performance comparable to Sigma Type XI. Because significant variability in average islet yields from different strains of rats and mice have been reported, additional modifications of the TDE composition should be made to improve the yield and quality of islets recovered from different species and strains.

A detailed description of mouse islet isolation is described using the technique of in situ pancreatic ductal cannulation and perfusion of a combination of purified collagenase and neutral protease.

Langerhans 절연의 마우스 작은 섬은 정화의 Collagenase와 중성 단백 분해 효소의 조합을 사용하여

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...