우리는 토론 및 원고의 비판적 읽기를 위해 밀러는 실험실의 구성원 감사드립니다. 이 작품은 DLM과 DLM에 건강 상을 R00 AG030550의 국립 연구소로 노화의 기본적인 생물의 우수의 네이선 충격 센터에서 새로운 탐정 수상에 의해 지원되었다.

1. 환경 챔버 구축 <ol><li> 프로젝트의 범위에 필요한 챔버의 작은 합리적인 볼륨을 선택합니다. 상공 회의소는 (O 2) 기름이 스며들지 않는 재료를하셔야합니다. Pyrex의 결정화 요리 Anaeropack 상자, 또는 대형 주물 - 아크릴 상자 (Ellard 계장)은 사용하실 수 있습니다. 우리는 9 개의 50mm 접시는 100 X 50 Kimex의 결정화 접시에 들어갈 수있는 것으로 나타났습니다. 유리 접시는 Pyrex의 결정화 요리 뚜껑으로 사용할 수 있습니다. </li><li> 선택한 챔버에 구멍을 드릴과 호스 미늘 피팅 (콜 Parmer)에 Luer 플라스틱 남성과 잘 맞습니다. 피팅은 파이프 피팅이나 에폭시로 확보할 수 있습니다. 가스 챔버로의 흐름과 아웃 할 수 있도록 컨테이너의 반대쪽에 유사한 피팅을 설치합니다. 가능하면 난류 혼합을 향상시킬 구멍을 상쇄. </li><li> O이 공동을위한 표준을 인증하고 정의한 O 2 농도 (N 2와 함께 균형)로 압축된 가스 탱크를 구합니다anoxic 조건 ntent이나, 순수 N 2 (&lt;10 PPM O 2). 야근에 산소 레벨을 방해하지 않도록 장기적인 연구를위한 자동 스위치 오버 레귤레이터를 사용합니다. </li><li> hypoxia에 대한 Organismal 반응은 온도 의존 15로 표시되었습니다. 인큐베이터에 챔버를 배치함으로써 서로 다른 온도 유지하실 수 있습니다. 인큐베이터 내의 온도가 고르지과 같은 수, 비가 계속 챔버 내부 온도를 측정하는 온도 데이터 로거를 이용하기 위해 신중한 것입니다. </li></ol> 2. 환경 상공 회의소에 가스 연결 <ol><li> 모든 연결의 경우 스냅 커넥터 또는 압축 피팅 중으로 연결되어 하나 여덟째 인치 바깥 지​​름 튜브를 사용합니다. 튜빙은 플루오르 에틸렌 프로필렌 등 O 2 (FEP) 또는 나일론 (콜 Parmer)로 스며들지 및 unreactive 있어야합니다. 완성된 설정의 도식 들어, 그림 1을 참조하십시오. </li><li> co.kr 사이트를 연결합니다같은 질량 유량 제어기 (시에라 인 스트 루먼트) 또는 rotameter (알보그)와 같은 흐름 제어 장치에 누를 가스 탱크. 탱크의 상류 압력이 유동 장치의 범위와 호스 미늘 피팅 내에 있는지 확인하십시오. 2 단계 규제는 일반적으로 원하는 압력으로 설정 두 번째 단계로, 사용하는 [적절한 유량를 선택 3 번 섹션을 참조] </li><li> (그림 1 참조) 가스 배기를위한 두 번째 피팅을 개방하고 나서 환경 챔버에 피팅 중 하나에 나서 직접 fritted 실린더와 가스 세척 병을 사용하여 증류수를 통해 기포에 의한 하이드 레이트 가스,. 단기 과정의 경우 가스 수화는 플레이트 dessication 방지하지만, 습도 모니터링은 장기간 연구해야 할 수도 있습니다. </li><li> 다우 코닝 진공 그리스는 챔버를 봉인하는 데 사용할 수 있습니다. 챔버의 뚜껑에있는 장소의 가중치는 완벽한 밀봉을 보장합니다. 단단히 밀봉하고 적절한 흐름을 확인하려면 Y의 손바닥에 물이 작은 수영장을 보유우리가 장갑 낀 챔버에 나가 피팅까지 손, 거품이 있는지 확인합니다. </li></ol> 3. 유속 선택 <ol><li> 혼합 완벽한 가정, 기체 분위기의 90 %의 가스 교환 챔버 볼륨 (Fick의 법칙) 교체 때마다 있습니다. 예를 들어, 100 CC / 분의 유량과 100 CC 챔버에서 챔버에서 원래 집안 공기는 1 분 후에 원하는 가스의 90 %로 대체되고 asymptotically 90% 매 순간으로 완전한 교환을 접근합니다 그 이후. </li><li> 높은 유동 속도와 작은 용기가 더 빨리 원하는 산소 농도에 도달합니다. 100 X 50 Kimex 용기 (400 CC), 120 CC / 분의 유량 10 분 (3 교류)의 99.9 % 교환에 도달합니다. 이 유량은 대부분의 산소 조건에 적합합니다. 우리의 지식에 O 2 농도의 변화의 속도는 C에서 반응에 미치는 영향의 체계적인 조사를 한번도 못 봤는데요 elegans. </li></ol><ol><li> hypoxic 조건에 노출 웜은 일반적으로 한천 플레이트의 표면을 탈출. 이것을 방지하기 위해 접시 가장자리 주위 팔미트산 (에탄올 10 밀리그램 / ML)의 반지를 넣습니다. 팔미트산은 물리적인 장벽을 형성 에탄올 증발로 용액 중에 올 것이다. 팔미트산 장벽은 달걀 누워 생산력 혹은 C.의 수명의 속도에 영향을 미치지 않습니다 elegans 16,17. 내는가 hypoxic 조건에서 더 자주 발생하지 않으므로 추가적인 예방 조치는 일반적으로 필요하지 않습니다. </li><li><ol><li> unseeded 선충류 성장 매체 (NGM) 접시 18 알칼리 표백 솔루션의 작은 방울로 gravid 성인 표백하여 동기화된 인구를 생성합니다. 표준 대규모 배치 염소산 표백 프로토콜와는 달리, NGM 플레이트의 표면에 표백제 용액 한 방울에 1-100 동물을 선택 후 표백 솔루션 판으로 흡수하도록 <suP&gt; 18. 최소한 12 시간이 흐른 라이브 OP50 박테리아 놓는 접시로 동기 L1의 유충을 전송. 또한, 한 2-3 시간 동안 접시에 알을 낳기 위해 gravid 어른 혼합 인구에서 L4 유충을 동기적으로 개발하거나 선택할 것이다 벌레의 그룹을 생성할 수 있습니다. </li><li> 이것은 생존 13 줄일 수 있으므로, hypoxia로 표백된 배아를 노출하지 마십시오. 젊은 배아 (2-4 세포)를 수집하려면 gravid 성인은 hypoxia에 대한 후속 노출에 대해 입을 pipet으로 접시로 옮겨 면도날과 배아와 물을 작은 볼륨으로 썰어 수 있습니다. </li></ol></li><li> 환경 챔버에서 번호판을 밀봉합니다. 컨트롤 동물 취급 웜 같은 온도에서 normoxia (집안 공기)에 보관한다. 집안 공기에 남은 샘플 및 하우스 공기가 그들 위에 흐르는과 동일 챔버 유지 이들 사이 띄는 차이가 없다. 가스 흐름을 개시하고 원하는 시간에 대한 노출을 유지합니다. 램프의 균일성을 확보하기 위해 반드시노출하기 전에 가스 세척 병으로 물을 교체하십시오. </li><li> 배아의 분석 생존에, 벌레가 실내 공기에 반환 후 48 H 위해 개발 수있는 시점에서 그들은 네번째 단계 애벌레 / 하루에 한 성인이어야합니다. 생존, 검열 집결 수없는 벌레를위한 점수. </li><li> , hypoxia에 노출된 동물을 시각화 22mm 2 coverslip에 M9 한 방울로 벌레를 이동하고, M9 18 년 2퍼센트 아가로 오스의 패드로 바꾸란합니다. 필요한 경우, levamisole (25 ㎜)이나 나트륨 azide가 (10 ㎜) 마취제로 사용될 수있다면. 나트륨 azide와 levamisole은 독성으로 인해 일부 관측을 먹이고 수 있고 분별있게 19 사용해야합니다. </li></ol> 5. Hypoxia-노출된 웜 (HIF-1 양식 분석을위한 샘플의 작성 예)의 급속한 수확 많은 hypoxia - 유발 효과는 즉시 달걀 생산 12, mitotic의 epitopes의 인산화의 재개를 포함한 실내 공기에 대한 반품시 반전됩니다embryogenesis 13 HIF-1 단백질 9,20의 저하 인치 hypoxia에 노출된 동물의 신속한 격리는 이러한 조건에서 재현할 효과를 얻기 위해 필요합니다. 채 2 분 안에 설치로는, 동물 수확 수 있으며 액체 질소에 냉동. 글러브 박스 hypoxia의 챔버 anoxic 조건에서 시료의 조작을 허용하는 동안 산소 결핍 이외의 조건에 대한 자신의 비용과 실용성들의 유용성을 제한할 수 있습니다. <ol><li> 벌레의 과반수가 18 gravid 성인 때까지 네 10cm 고도 성장 (HG) 접시에 브리스톨 N2 벌레를 성장. 1시 5분 알칼리 표백 솔루션을 포함하는 15 ML 원뿔 튜브로 벌레를 씻어 및 웜은 5 분 이상에게, 9를하지 디졸브 시작할 때까지 회전 알을 품다. 노 제동 각 세차 사이 1,500 XG에서 다운 방적, M9와 웜 세 번 씻는다. </li><li> 플레이트 표백 8 150mm NGM 플레이트쪽으로 배아 및 L4 유충 (22시 브리스톨 N2 용 ~ 48시간 ° C)로 개발하기 위해 수 있습니다.환경 방으로 번호판을 이동 hypoxic (1,000 PPM, 5,000 PPM)과 4 시간 동안 anoxic (N2) 조건에 노출. 노출 시간은 실험 설계에 따라 달라집니다. hypoxia에 대한 노출이 누워 계란의 속도에 직접적인 영향을 가지고 있지만, 두 세포 배아가 노출 12 16-18시간 후에 죽어. 이 hypoxia 챔버 설정으로 노출의 낮은 한도는 평형에 도달하는 데 필요한 분위기를 교환 비율에 의해 제약된다. </li><li> 분류 하나 1.5 ML의 microfuge 관과 각 실험 시료에 대해 하나 15 ML 원뿔 튜브. hypoxia에 노출된 벌레는 수확 기간 동안 튜브의 측면에 집중 가능성이 더 높습니다. 이것을 방지하기 위해 장소 각 15 ML 원뿔 튜브의 1 % 나트륨 dodecyl 황산 (SDS) 100 μL. SDS는 다운 스트림 애플 리케이션을 억제하면 소 혈청 알부민은 (BSA) 집어 넣는 것을 방지하는 데 사용할 수 있습니다. SDS 또는 BSA의 일상적인 사용은 명백한 차이를 가지고있다 고는 보지 않습니다. 2X 단백질 로딩 염료 (4 % SDS, 10 % 2 - 메르 캅 토 에탄올과 50 μl를 추가하십시오1.5 ML의 microfuge 튜브에 30 % 글리세롤 (W / V))에서 bromphenol 파란색으로 추적. 준비가 액체 질소의 Dewar 되세요. </li><li> hypoxia와 기록에서 벌레를 제거 후 시간 단계를. , hypoxic 회의소로 뚜껑을 제거 한 샘플 접시를하고, 챔버를 다시 봉인. 15 ML 원뿔 튜브에 붓는다 후 나일론 필터에 벌레를 씻어하고 증류수를 사용합니다. 브레이크가있는 15-20초 1500 XG에 바탕 원심 분리기에 벌레를 내려 봐. </li><li> 웜은 펠렛은 온전히 떠나, 튜브에서 뜨는의 대부분을 제거하는 진공을 사용하십시오. </li><li> 피펫 사용하여, 1.5 ML의 microfuge 관 ~ 50 μL에 벌레 펠릿 이동합니다. 액체 질소의 튜브와 잠그다을 봉쇄해. </li><li> 모든 샘플은 고립 때까지 반복합니다. 일관성을 위해 집안 공기 제어 샘플에 대해 다음 절차를 따르십시오. 샘플은 -20 ° C.에 저장될 수 </li></ol> 6. 대표 결과 hypoxia의 Organismal 효과를 볼 수 있습니다C의 성체로 생존을 조사하여 elegans (그림 2). 야생 형 브리스톨 (N2)와 hif-1 (ia04) 삭제 돌연변이에 의해 마련 태아는 모든 집안 공기 O 2 농도 (210,000 PPM O 2)에서 생존하고 있습니다. hif-1 배아는 결혼은 안하는 동안 N이 웜은, 5,000 PPM O 2의 성인기에 적응하고 살아남을 수 있습니다. 이것은 HIF-1 환경 10에서 사용할 수있는 산소의 변화 수준에 적응을 위해 필수적임을 보여줍니다. N2도 hif-1 동물들도 1,000 PPM O 2로 노출을 살아남을 수 있습니다. hypoxia에 직접 벌레를 떠올리 것은 해부 범위와 맑은 컨테이너 (그림 3)의 사용과 가능한 것입니다. 직접 해부 범위에서 hypoxia 챔버를 배치함으로써 organismal 반응을 관찰하는 hypoxia에서 웜을 제거 할 필요가 없습니다. 범위는 (그림 3에서와 같이 형광 illumation 들으며 수 </stronG&gt;) 추가 가능 hypoxia에서 관찰의 유형을 확대. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig1.jpg" /> 1 그림. 가스 유동의 Hypoxia 회의소. 방향의 예는 화살표로 표시됩니다. 가스가 정의 O 2 농도 (1) 및 두 단계 레귤레이터가 (2) 첨부되어있는 압축 가스 탱크에 저장됩니다. 가스는 정확한 유량 상단을 종료, 유동 튜브 (3)의 하단에 들어갑니다. 가스 그러면 가스 (기포를 관찰하여 버블 플라스크의 올바른 연결을 보장) 과도한 수분, 버블 플라스크 (4)으로 흐르고있다. 수산화 가스 그러면 hypoxia에 샘플을 노출, 유입 밸브 (5)에서 hypoxia 챔버로 전달합니다. 챔버에 뚫고 배기 구멍을 통해 방 안으로 가스가 드디어 통풍구. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig2.jpg" /> 그림 2. 1,000 PPM O 2, 5000 PPM O에 노출된 태아의 생존 능력 <sub&gt; 2 normoxia (~ 210,000 PPM O 2). 태아도 지속적인 흐름 산소 실에서 24 시간 동안 배아 각 산소 조건에 노출되었다. 웜은 48 시간 동안 성체로 개발할 수 normoxic 조건,로 이동 후 성체로 생존을 위해 득점했다. N&gt; 50, N = 5. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig3.jpg" /> 그림 3. C의 시각화 현미경과 hypoxia에 elegans. 벌레가 설명한 방법을 사용하여 hypoxia에 노출됩니다. 투명한 환경 챔버가 (pyrex의 결정화 접시와 유리 플레이트와 함께 건설) 해부 범위의 무대에 직접 배치됩니다. 두 의견은 전체 가스 유량을 포함 하나가 현미경의 무대에서 그냥 챔버와, 다른 설정, 표시됩니다.

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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

이 방법은 실험실에서 유지되는 산소의 정확한 농도가있는 환경을 허용 hypoxic 환경을 구축을위한 전략을 제시합니다. 이러한 챔버 스는 O 2의 구체적인 낮은 농도로 유기체를 노출하고 분자 및 생리 출력을 모니터링하는 간단한 방법을 제공합니다. 설명된 환경 챔버 실험실 대신 상업적으로 구입하여 조립되고 따라서 실험의 필요에 맞게 수정할 수 있습니다. 이 방?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 튜빙 (FEP와 PTFE) </td><td> 콜 Parmer Tygon </td><td> 요 - 95821-00 (1 / 8 &quot;FEP) 06605-27 (16분의 1 X 1 / 8 &quot;PTFE) &#39;R-3603 </td></tr><tr><td> 압축 피팅 </td><td> 시애틀 유체 시스템 </td><td> 06363-58 (M. 커플러 16분의 1 &quot;) 06363-62 (F. 커플러 16분의 1 &quot;) 06363-60 (M. 커플러 1 / 8 &quot;) 06363-61 (F. 커플러 1 / 8 &quot;) </td></tr><tr><td> 유동관 </td><td> 알보그 </td><td> PMR3-010073 (3 출력) PMR1-013520 (1 출력) </td></tr><tr><td> 질량 유량 제어기 </td><td> 시에라 인 스트 루먼트 </td><td> 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (질량 Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (스마트 Trak 2) </td></tr><tr><td> 압축 가스 탱크 </td><td> AirGas </td><td> 주문 제작 &lt;/ TD&gt; </tr><tr><td> 호스 미늘 이음쇠에 플라스틱 남성 Luer </td><td> 콜 Parmer </td><td> 45505-41 (500 시리즈 16분의 1 &quot;) </td></tr><tr><td> 아크릴 상자를 던져 </td><td> Ellard 계측 </td><td> 주문 받아 만든 </td></tr><tr><td> 파이프 피팅 (브래스 또는 스테인리스 스틸) </td><td> 시애틀 유체 시스템 </td><td> B-402-1 (1 / 4 &quot;너트) B-200-3 (1 / 8 &quot;유니온 티) B-400 세트 (1 / 4 &quot;ferrules) B-QM2-B1-200 (QM 바디 QC) B-200-1-2 (팔분의 일 X 1 / 8 &quot;남성 conn) </td></tr><tr><td> 다우 코닝 진공 그리스 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> Z273554 </td></tr><tr><td> AnaeroPack 상자 </td><td> Misubishi 가스 화학 회사 </td><td> R684004 (0.4 리터) R685025 (2.5 리터) R685070 (7.0 리터) </td></tr><tr><td> Pyrex 가스 세척 병 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> CLS31770500C (500 ML) CLS31770250C (250 ML) CLS31770125C (125 ML) &lt;/ TD&gt; </tr><tr><td> 팔미트산 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P0500 </td></tr><tr><td> 염소 안티 - 마우스 IgG-양고추냉이 퍼옥시데이즈 </td><td> 남부 바이오 어소 시에이츠 </td><td> 1032-05 </td></tr><tr><td> SuperSignal 웨스트 피코의 Chemiluminsecent 기판 </td><td> 피어스 화학 </td><td> 34,077 </td></tr><tr><td> 100 X 50 유리 결정화 요리 </td><td> Kimax 킴블의 </td><td> 23,000 </td></tr></tbody></table>

creating defined gaseous environments to study the effects of hypoxia on c. elegans

모든 metazoans 하나 알려진 예외 1, 생존하기 위해 산소가 필수적입니다. 감소 O 2 용성 (hypoxia)는 질병, 일반 개발 또는 환경 조건 2-5의 변화 상태 동안에 발생할 수 있습니다. hypoxia에 대한 응답에 관여하는 세포 신호 전달 경로를 이해하는 것은 뇌졸중의 암으로, 다양한 인간 pathologies에 대한 치료 전략에 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 목표는 유전자 의무 모델 생물의 제어 hypoxic 노출과 관련된 기술적인 문제에 의해 최소한 부분적으로 장애가되었습니다. 선충류의 Caenorhabditis elegans를 이상적으로 그것이 문화에 쉽게이며, 유전자 조작으로, hypoxic 응답의 연구를위한 모델 생물로 적합합니다. 또한, 그것은 C. 이후 혼란함을 주죠 효과없이 특정 hypoxic O 2 농도에 대한 세포 반응을 연구하는 것이 가능 elegans는 O 2 (을 얻을및 확산 다른 건가)는 등의 촉진 호흡기 시스템 6으로 반대했습니다. hypoxia에 대한 응답에 참여하는 것으로 알려진 요인은 C로 보존된다 elegans. hypoxia에 대한 실제 응답을 사용할 수 있습니다 O 2의 특정 농도에 따라 달라집니다. C로 elegans은 hypoxia를 운영하는 노출 hif-1에 의해 주로 매개 transcriptional 응답을 elicits, 고도로 보존되어 hypoxia-inducible의 전사 인자 6-9. C #. elegans의 배아는 O 2 7,10 5,000-20,000 PPM에서 생존하기 위해 hif-1이 필요합니다 . Hypoxia는 &quot;정상적인 O 2보다 적은&quot;에 대한 일반적인 용어입니다. Normoxia (일반 O 2) 또한 정의하기 어려울 수 있습니다. 우리는 일반적으로 normoxia 될 수 210,000 PPM O, 2 실내 공기를 고려하십시오. 그러나, 그것은 표시되었습니다 C. elegans은 5~12%에서 O 2 농도 (50,000-120,000 PPM O 2) 11 행동 선호하고 있습니다. 리터에서arvae와 어른, 5,000 PPM O 2 12 년 hypoxia 유발 diapause을 방지하기 위해 hif-1 행위. 그러나 hif-1 O 2의 낮은 농도 (산소 결핍, 운영 정의 &lt;10 PPM O 2) 13 응답으로 역할을하지 않습니다. 산소 결핍, C로 elegans은 모든 미세 띄는 활동이 10을 중단하는 정지 애니메이션의 가역 상태로 들어갑니다. 서로 다른 조건에서 다른 생리적 반응이 발생한다는 사실은 O 2의 hypoxic 농도 이상의 실험적인 통제를 할 수의 중요성을 강조 표시합니다. 여기서는 O 2의 농도로 정의된 신뢰할 수 있고 재현성 hypoxic 조건을 만들어 환경 챔버의 건설 및 구현을위한 방법을 제시한다. 지속적인 흐름 방식은 챔버의 급속한 평균을 보장하고 시스템의 안정성을 증가시킵니다. 또한, 투명성과실을 접근 hypoxia에 노출되는 동물의 직접적인 시각화를 가능하게합니다. 우리는 더 이상 C를 수확의 효과적인 방법을 설명 elegans 샘플 빠르게 hypoxia에 노출된 후, 어느 hypoxia 10,14에서 발생 급속히-반대로 많은 변화를 관찰해야합니다. 이 방법은 쉽게 다른 모델 시스템 및 건가 다양한 포함한 개인 실험실 요구에 대해 수정할 수 있습니다 기본적인 기반을 제공합니다.

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Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

O의 정의 농도와 대기를 생성하는 지속적인 흐름 hypoxia 챔버를 사용하는 방법을 본 논문 세부 정보<sub&gt; 2</sub&gt; 생물 학적 반응을 이해하는 O를 감소하는 방법<sub&gt; 2</sub&gt;. 이 시스템은 설정 및 유지 관리가 쉬우며, O 다양한 맞게 충분히 유연<sub&gt; 2</sub&gt; 농도 및 모델 시스템

에서 Hypoxia의 효과를 연구하기 위해 정의된 기체 환경 만들기<em&gt; C. elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

12.0K 조회수.  University of Washington. O의 정의 농도와 대기를 생성하는 지속적인 흐름 hypoxia 챔버를 사용하는 방법을 본 논문 세부 정보 2 생물 학적 반응을 이해하는 O를 감소하는 방법 2. 이 시스템은 설정 및 유지 관리가 쉬우며, O 다양한 맞게 충분히 유연 2 농도 및 모델 시스템

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Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

도마뱀의 운동의 속도와 방향에 시각 민감도 테스트

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

연구

생물학

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

든 샘플 준비 : 울트라 씬 레이어 방법

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Microinjection을 사용하여 안정적인 트렌스​​ 제닉 C. 엘레간스의 생성

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

해부 및 C. 엘레간스 신경근육학 융티온에서 레코딩

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

안녕하세요 - C : Genomes의 3 차원 구조를 공부하는 방법.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

생산 C. 엘레간스</em함께 Recombineering 통해> Transgenes galK 선택 마커

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

선충류의 바디 크기 규정에 참여 유전자에 대한 화면으로 RNA로 인한 간섭 수유 전략을 사용하여<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans의 주 화성 분석

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

에 박테리아의 효과를 측정<em&gt; C. 엘레</em계란 보존 분석을 사용하여&gt; 행동

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...