그림 1과 2는 이전에 유리기 생물학과 의학 (Queliconi 등. 5)에 게시 및 엘스 비어가 보유한 저작권을 가지고 있었다. 이 작품은에 의해 지원되었다 Fundação 데 앰 파로 à Pesquisa 에스 타도 데 상파울루 (FAPESP), INSTITUTO 나시 오날 데 Ciência 전자 Tecnologia 데 Processos 산화 환원 EM Biomedicina, Pesquisa 데 Processos 산화 환원 EM Biomedicina, USPHS NS064945 (KN) à Núcleo 드 Apoio 및 USPHS GM087483 (KN을 ). BBQ는 FAPESP의 교제가 지원하는 박사 과정의 학생입니다.

1. C. 엘레 성장 <ol><li> 표준 재배 방법 1 당 OP50 박테리아와 시드 35mm 선충류 성장 미디어 (NGM) 한천 플레이트, 준비합니다. </li><li> 시드 NGM 판에 6 임신하는 성인을 배치하여 C. elegans의 동기화. ~ 100 계란 (~ 3의 시간)을 배치 한 후 성인을 제거합니다. </li><li> 벌레가 젊은 성인 단계로 개발이 실험을 위해 최적화되어있다 할 시점에서 20 ° C에서 3 일, 대한 번호판을 품어. C. 동기화하는 다른 프로토콜 엘레 다른 곳에서 10에 설명되어 있습니다. </li></ol> 2. AS 용 재료 <ol><li> M9 완충액 (22 mM의 KH 2 PO 4, 42 mM의 나 2 HPO 4, 86 mM의 염화나트륨, 1 mM의 MgSO4로)가 N 2로 평형화하여 산소로 퍼징한다 실험 전에 30 분 동안 (아르곤은 또한 사용될 수있다) 얼음에 둘러싸여 있었다. </li><li> 작은 구멍 (3mm 만들기) 폭은 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브의 뚜껑에있는 벌레는 AS 동안 배치됩니다. 이 과도한 미디어의 증발로 이어질 수있는 구멍은, 뚜껑을 열어 유지하지 않고 가스를 교환 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 산소 결핍 / 기아 <ol><li> 적어도 중으로 모든 실험을 실시한다. </li><li> 상술 한 바와 같이 성장 젊은 성인 벌레를 포함하는 각 35mm 판에 RT 1 ㎖​​, 산소 M9 버퍼를 추가합니다. (박테리아가 접종되지 않은 가장자리에 M9 추가) 판에서 박테리아를 제거하지 않도록주의하십시오. ~ 1 분 후에 벌레는 M9에서 수영을해야합니다. </li><li> 피펫 및 멸균 1 % BSA 솔루션을 추방하여 코트 BSA와 1 ㎖ 피펫 팁을. </li><li> 정중 M9 버퍼에 웜을 포함하는 플레이트를 기울여, 그것이 첨가 같은 장소에서 M9을 제거하고, 제조 된 마이크로 원심 튜브에 서스펜션을 배치. 웜은 튜브의 바닥에 떨어졌다 때까지 얼음에 나머지를하자 (1 ~-2 분). </li><li> (약 100 μl를 떠나) 튜브에서 벌레를 방해하지 않고 가능한 M9의 최대 양을 제거, 산소 제거 및 아이스 M9의 1 ML을 추가하고 벌레가 다시 바닥에 정착 할 때까지 얼음에 튜브를 배치합니다. 마지막 단계의 3 배를 반복합니다. ~ 100 μL는 튜브에 남아 때까지 마지막 세척에서, M9를 제거합니다. </li><li> (3.6.2 절, 아래의 방법을 참고하십시오) 지정 밀폐 용기에, 또는, (아래의 지시 사항, 3.6.1 절 참조) 또는 무산소 / 저산소 챔버 내부에 환원 된 M9의 벌레와 튜브를 놓습니다. <ol><li> 시판의 무산소 / 저산소 챔버가 사용되는 경우, 단계 3.5를 시작하기 전에, 챔버 내부에 일부 치환 M9를 남기고 웜 챔버 내부 일단 단계 5를 반복한다. </li><li> 커스텀 챔버가 사용될 경우, 저비용 장치를 생성하는 방법의 상세한 설명은이 프로토콜의 단부에 제공된다 (11)과 이전에 다른 그룹에 의해 설명되었다. 간단히 : <ol&gt; <li> 250 ㎖의 유리 섬유 복합 재질의 타입 용기 뚜껑에 두 개의 구멍을 만들어 그들에게 튜브 커넥터를 추가합니다. 하나는 다른 수조에 가스 출구 것이다 동안 가스 혼합물을 주입하기 위해 사용된다. </li><li> 챔버에 벌레를 넣고 뚜껑을 사용하여 챔버를 밀봉. </li><li> 상수 N 2 플럭스 (100 ㎖ / 분)와 가스. </li><li> 26 ℃의 물을 욕조 안에 컨테이너를 배치 누수가 (실 자체에서 발생하는 기포에 의한 명백한) 시스템에 없는지없이 공기가 반환되도록 출구 관은 물에 잘 포장되어 있는지 확인합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 20 시간 동안 26 ° C에서 벌레를 품어. </li></ol> 4. 시뮬레이션 재관류 <ol><li> AS 조건에서 20 시간 후, 실내 공기에 배양 챔버에서 튜브를 제거합니다. </li><li> 피펫 C. OP50 상 (단계 3.3에서와 같이) BSA 코팅 된 팁 엘레 35mm NGM 플레이트를 시드. 24 시간 동안 20 ° C에서 접시를 품어.이 후, 벌레가 득점 할 준비가 될 것입니다. </li></ol> 5. 라이브 웜 수스가 죽은 확인 <ol><li> 백금 픽을 사용하여 가볍게 웜의 머리의 상단을 터치합니다. 라이브 벌레는 터치 후 뒤로 이동합니다. 벌레가 응답하지 않는 경우, 죽은로 점수. 때때로, 웜은 뒤로 이동하지 않지만 약간 옆으로 머리의 움직임을 보일 수 있습니다. 기술적으로 죽은하지 않지만, 이러한 웜은 시간 이내에 만료 거의 확실하고, 죽음으로 채점한다. 하나는 웜 점수를하는 데 시간이 너무 오래 기다리는 경우, 자손의 내부 부화가 발생할 수 있으며, 이러한 &quot;가방 - 중 - 웜은&quot;매우 어려운 시체를 검출하고, 파열 할 수 있습니다. </li><li> 그들이 중복 계산을 피하기 위해 계산 될 때 플레이트에서 모두 라이브와 죽은 벌레를 제거합니다. 라이브 웜 행동 분석을 수행하기 위해 별도의 플레이트로 이동 될 수있다. 전체를 기준으로 사는 벌레의 양이 남아있는 벌레의 %로 표시됩니다 (그림 1A </st룽&gt;). </li></ol> 6. 응답 분석을 터치 <ol><li> 이 프로토콜에 대한 자세한 설명은 하트 앤 C., ED에 제시되어 있습니다. 동작 (2006년 7월 3일), WormBook, 에디션. C. elegans의 연구 커뮤니티, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org. <ol><li> 터치 반응에 대한 점수를하기 위해 이동하고 가볍게 속눈썹 선택 (그림 3)과 (인두의 중간 부분 근처) 웜의 머리의 측면을 터치하는 웜을 식별합니다. </li><li> 웜이 뒤로 이동하는 경우 같은 응답 점수를, 그렇지 않은 경우 (그림 1B)로 응답하지 않는 점수. 10 초 간격으로 각각의 벌레에 대해이 단계 10 - 15 배를 반복합니다. 정확한 데이터를 가지고 각 그룹에서 최소 10 벌레를 조사. 동일한 분석은 후부 체벽에 가볍게 누르고 다음 순방향 locomotory 변화를 평가하기 위해 사용될 수있다. 이 별개의 행동을 자극하기 때문에 웜의 머리 또는 꼬리에 닿지 않도록해야합니다. </li><li> 마지막으로,에기업 유전자 제어 계통 [네거티브에 대한 긍정적, 멕 (mechanosensory) 돌연변이에 대한 N2 브리스톨 야생 형 - 예를 들어, CB1338 MEC-3 (e1338) IV] 벌레를 터치로 힘을 보정한다. 자극이 너무 가혹한도 조금 야생형 N2 컨트롤에 효과를 유도하지 않습니다, 멕 돌연변이의 행동 반응을 유도 할 것이다. </li></ol></li></ol> 7. 신경 수정 <ol><li> 의 연결을 수정 AS 포스트를 시각화 터치 응답 멕 신경 4,5에 GFP를 표현하는 변형을 사용합니다. 이 신경 세포는 신체의 벽을 따라 실행하고 쉽게 형태 학적 이상 득점하는 긴 과정이있다. 또, 형태 학적 정보는 전술 한 바와 같이, 신경 기능의 행동 대책과 통합 될 수있다. 이 목적을 위해 사용될 수있는 하나의 균주 C.에서 사용할 TU2583이며 엘레 유전학 센터 이리저리 GFP를 표현 uIs25 통합 형질 전환 유전자를 포함통합 MEC-3 :: GFP 융합을 포함하는 MEC-18 프로모터, 또는 대안 TU2562을 해요. </li><li> 아가로 오스 패드를 준비합니다. <ol><li> 물에 10 배 주식으로 M9을 배일 가지고, 70 ℃에서 솔루션을 유지 아가로 오스 2 %를 용융 </li><li> 자신의 바닥면에 테이프의 한 조각이 각각 다른 두 슬라이드 사이에 배치 된 유리 슬라이드 (X 75mm 25mm)에이 솔루션의 드롭 (~ 20 μL)을 놓습니다. </li><li> 2 % 아가로 오스 솔루션의 맨 첫 번째에 수직 최종 유리 슬라이드를 배치하고, 실온에서 냉각 할 수 있습니다. 이는 테이프의 두께 패드를 형성한다. </li><li> 상단 슬라이드를 제거하고 벌레를 무력화합니다 0.1 % tetramisole를 포함하는 M9의 10 μl를 추가합니다. </li></ol></li><li> 2 % 아가로 오스 슬라이드에 벌레를 사는 일부 (~ 10)로 이동합니다. 그들에 커버 슬립을 놓고 적절한 조명과 100X 목적에 따라 형광 현미경을 이용하여 GFP를 시각화. </li><li> 손상된뉴런은 프로세스 (그림 2B) 깨진 것으로 나타 세포질 막 여러 누점 (그림 2A)로 구성 과정에서 진주 패턴의 문자열, 및 / 또는 이상을 보여줄 것이다. 적어도 10 벌레의 총을 사용하여 각 웜 모두 신경에있는 눈물 점 이상을 계산합니다. </li></ol> 8. 실험실에서 만든 저산소 챔버 <ol><li> 유리 섬유 복합 재질의 스타일, 밀봉, 밀폐 용기는 무산소 챔버로 개조 할 수있다. 가능한 한 작은 컨테이너를 선택하는데주의를 기울여야. 작은 컨테이너는 빠른 저산소 환경을 생성하고 (그림 4) 물을 욕조에 맞게하는 것이 더 쉽습니다. </li><li> 뚜껑에 두 개의 구멍이 (드라이버 또는 집게를 가열하고 뚜껑에 강제로 수행 할 수 있습니다) 확인하고 튜브 (그림 5A)을 맞는 플라스틱 또는 금속 커넥터를 삽입합니다. 물에 배치 할 수있는 접착제를 사용하고, 또한 운동을 피하고, 건조 후 힘들어커넥터 따라서 누설의 가능성 (도 5b)을 감소시킨다. </li><li> 그것이 (도 4) 완전히 잠기도록 용기는 수조에 배치되어야한다. 용기를 체험하기 위해, 병의 중량 다이빙 무게를 사용합니다. </li><li> 관 연결 중 하나는 가스 혼합물을 도입하고 다른 튜브 용기가 외부 환경 (도 4)로부터 밀폐 차단되도록 따라서는 물 아래 두어야, 압력 완화 역할을 사용한다. </li><li> 공기 조성물 주문품 가스 질량 흐름 제어기 또는 원하는 가스 혼합물 어떠한 장치를 사용하여 변조 될 수있다. 높은 유동은 과도한 증발을 만들 수있는 가스 유동이 제어되어야한다. 예를 들어, 250 ml의 용기에 가스를 100 ㎖ / 분 웜 좋은 공간과 적절한 유량을 제공 할 것입니다. </li><li> 그들은 가스, 투과 될 수있는 튜브의 길이는 최소로 유지되어야llowing O 2의 입구. 이러한 물질이 가스 교환에 투과성으로 실리콘을 사용하지 않도록하는 것이 중요하다, 타이곤은 관. 우리는 폴리 프로필렌 또는 나일론 튜브를 선호합니다. 유리 또는 금속 튜브가 아니라 가스를 유지뿐만 아니라 작업하기 어렵습니다. </li></ol>

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저자가 공개하는 게 없다.

널리 C.에 사용 된 AS IR 부상을 모델로 엘레. 몇 가지 주요 포인트는이 프로토콜에 대한 강조해야 C. elegans의이 시스템을 사용하여 죽음을 달성하기 위해 3 수반하는 모욕 (열, 기아와 산소 결핍)의 필요성을 정당화, 상해의 다양한 배열에 저항. 단독 무산소 시간이 14이 창에 벌레를 죽이지 않습니다. 또한, 온도 상승은 추가적인 응력이므로 밀접하게 모니터링하는 것이 중요하다. 엄밀히 말하면, 기아 라기 7 관찰 치사율의 정도에 크게 기여하지 않지만 실험 복제물 사이 변동을 줄이기 위해 나타난다. 일상에서 중요한 변화가있을 수 있음을 감안할 때, 그것은 샘플을 병렬로 직접 실행할 비교하고, 여러 일 동안의 실험을 반복하는 것이 매우 중요합니다. 일반적으로, 결과는 50 ~ 100 웜의 세 개의 판 / 실험 조건을 측정하고 이들은된다N 평균과 하나의 실험적인 복제로 간주. 일반적으로, 일곱 사이에 아홉 개의 반복 달성 또는 통계적 유의성을 배제하기에 충분한 것으로 보인다. 실험에 사용 된 웜의 발달 단계는 손상이 크게 변화한다 15,16 신중에 다른 단계의 감수성으로 모니터링 할 필요가있다. 젊은 성인의 사용은 표준이며, 애벌레 단계 (L3 및 L4) 웜은 AS (게시되지 않은 데이터)의 손상 효과에 강한 것으로 보인다. 이 프로토콜은 실험을 수행하는 두 가지 방법, 시판의 4,6 저산소 챔버를 사용하고, 다른 (타파웨어 형 용기 및 가스 입력 (11)을 사용하여) 랩으로 만든기구를 사용하여 하나를 제시한다. 그 밖에 13,17 바와 같이 무산소는, 산소를 소비하는 다른 수단에 의해 달성 될 수있다. 저산소 환경을 만들 수있는 대체 기술의 사용이 필요 AS 배양 시간을 변경할 수 있습니다죽음의 원하는 금액을 만들 수 있습니다. 80 %는 AS의 해로운 영향을 악화 개입 유사 이상적입니다 동안 ~ 20 %의 생존율을 대상으로하는 것은, 보호 개입 공부를위한 이상적인 출발점입니다. 또 다른 중요한주의해야 할 점은에서 관찰자 점수 살아 / 죽은 벌레의 시간입니다. 분석 시간이 24 시간 이상으로 확장되면 죽은 벌레가 식별 할 점점 더 어려워지고 있기 때문에, 데이터는 오해의 소지가있을 수있다. 이는 웜의 시체가 시간이 지남에 따라 상대적으로 투명 해지고에있을뿐만 아니라, 수정 된 배아가 시체의 내부 자손 사후에 개발하고 그들이 등장으로 그들을 방해 할 수 있다는 사실에있다. 신경원 형태의 분석은 단백질 발현 패턴 (18), 핵 분열 4 및 해당 부호화 유전자 마커를 발현하는 웜 균주 대체하여 다른 파라미터들 (19)을보고하기 위해 수정 될 수있다. 마지막으로주의 할 점은 그의 시각화신경 프로세스는 슬라이드에 벌레를 배치 한 후보다 30 분을 수행해야합니다. 긴 기간은 AS 독립적 인 손상을 나타낼 수에 대한 동물 슬라이드에 마취 유지. 그들을 추적하고 분석하는 데 필요한 시간에 따른 슬라이드 당 동물의 양을 조정한다.

C. elegans의 널리 브레너 1에 의해 처음 소개 된 이후 다세포 진핵 세포 모델 생물로 채택 된 선충이다. 그것은 유전 변경과 표현형 사이에 쉽게 링크 2를 변경 할 수있는 저렴하고 간단하고 다양한 모델입니다. 허혈은 반응성 산소 종의 파열은 3을 제조하고 손상의 대부분이 발생된다 재관류 하였다 영양분과 조직에 산소 공급의 부족에 의해 특징된다. 2002 년, C.에서 허혈 / 재관류 (IR)의 모델 엘레 정상 조건에서 24 시간 뒤에 약 20 시간 동안 산소 결핍, 영양 결핍과 열 스트레스에 전체 웜을 제출 관련 4를 개발했다. 이 모델은 기술적으로 산소 결핍 - 기아 (AS)이지만 상태, 세포 죽음은 재관류 동안 산화제에 의해 유도 된 손상을 포함하여 포유 동물에 보존되어 메커니즘을 통해 발생 &lt;SUP&gt; 5. AS C.에 의해 유도 또한, 포유류의 IR과 유사한 손상 엘레 허혈 6,7 또는 마취 전 처치 8,9 방지 할 수있다. 아래의 프로토콜은 C에서 IR을 모방하는 방법을 보여줍니다 엘레 AS로 인한 형태 학적 및 행동 이상을 득점하는 방법, AS 모델을 사용하는 방법과 실험 맞춤 제작, 쉽게 구성된 챔버의 대안을 사용하여 낮은 초기 투자를 실시 할 수 있도록하는 방법으로 프로토콜을 적용하는 방법 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1146">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">N2&#160; strain</td>
			<td style="width:269px;">CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)</td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:453px;">Wild type strain</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP)</td>
			<td style="width:269px;">CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)</td>
			<td style="width:208px;">TU2583</td>
			<td style="width:453px;">integrated fluorescent transgene used to label touch neurons</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CB1338 mec-3 (e1338)IV</td>
			<td style="width:269px;">CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)</td>
			<td style="width:208px;">CB1338</td>
			<td style="width:453px;">canonical mec-3 mutant that is touch insensitive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Microcentrifuge Tube</td>
			<td style="width:269px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:208px;">0030 120.086</td>
			<td style="width:453px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Nikon Eclipse TE2000-U Microscope&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Nikon USA</td>
			<td style="width:208px;">TE2000-U</td>
			<td style="width:453px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Low Temperature Incubator</td>
			<td style="width:269px;">Sheldon Manufacturing Inc.</td>
			<td style="width:208px;">Model 2005</td>
			<td style="width:453px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Eyelash Pick</td>
			<td style="width:269px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:453px;">An eyelash pick can be prepared by attaching&#160; an eyelash onto a wooden toothpick, then attaching the toothpick in a glass Pasteur pipette (Figure 3)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Hypoxic Chamber</td>
			<td style="width:269px;">Coy</td>
			<td style="width:208px;">8307030</td>
			<td>Hypoxic Glove box equipped with paladium catalyst and CO2 controller.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an anoxia-starvation model for ischemia/reperfusion in c. elegans

유전자 모델 생물 C. elegans의에서 산소 결핍 / 기아에 대한 프로토콜은 허혈 / 재관류를 시뮬레이션 할 수 있습니다. 웜은 세균 음식에서 분리 무산소 아래에 배치 20 시간 (시뮬레이션 국소 빈혈)에, 이후 음식 (시뮬레이션 재관류)와 일반 대기로 이동합니다. 증가 죽음과 신경 손상과 기술이 실험 패러다임의 결과는 유기체의 생존, 터치 신경 프로세스의 형태로 변경뿐만 아니라 신경 기능의 동작 출력을 나타내는 터치 감도를 평가하기 위해 제공됩니다. 마지막으로, 일반 부엌 저장 용기를 사용하는 저산소 배양기를 구성하기위한 방법을 설명한다. 변경이 지정 인큐베이터에서 가스 혼합물에 수행되어야하고, 순환 수조 모두 온도 제어를 허용하고 쉽게 누출을 식별 할 수있게하기위한 유량 제어 유닛의 추가는 허용한다. 이 방법은 시판하는 저비용의 대안을 제공한다사용할 수있는 제품.

C.를 쓰는 사용자 지정 연구실 만든 배양 챔버에서 AS에서 26 ° C의 20 시간에 elegans의 설명 (3.6.2 절)가 중요한 사망률 (그림 1A)의 결과로 5. 생존자의 GFP 표지의 연결 과정에서 눈물 점과 휴식의 후속 형광 이미징은 형태 학적 이상 소견의 존재 (그림 2) 확인했다. 생존자는 가벼운 몸 벽 터치 (그림 1B)에 제대로 대응했다. 이 모델은 유전 적 소인, 제약의 개입, 그리고 신진 대사 가소성이 AS 따라 결과 4-6,8,9,12,13에 미치는 영향을 연구하기 위해 여러 그룹에 의해 사용되고 있습니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig1.jpg" /> 그림 1. C. elegans의 생존과 터치 반응 후24 시간 후 AS 생존을 전시 웜의 AS.) 비율입니다. N2 균주는 야생형 유전자 배경, 그리고 KWN85는 C. 생활의 자극을 터치하는 GFP. B와 멕 뉴런 레이블 통합 유전자) 응답을 포함 AS 후 엘레 (N2 균주). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51231/51231fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig2.jpg" /> 그림 2. 이러한 고통스러운 과정 및 휴식 (A) 또는 프로세스 (B)에서 GFP의 집계 축적 한 후 신경 세포의 수정을 누릅니다. 터치 신경을 (PLML 및 PLMR) 이상이 생존에 감시했다 C. 마취 eleg<html> ANS AS 후. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig3.jpg" /> 그림 3. 속눈썹 선택. 조립 속눈썹 선택. 삽입에 속눈썹의 세부 사항 이쑤시개 나무에 붙어. <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig4.jpg" /> 그림 4. 실험실에서 만든 수조 내부에 저산소 실. 실험을 시작할 준비가 밀폐 용기. 화살표는 가스 입구와 출구 및 부동에서 보관하는 데 사용되는 병의 무게를 나타냅니다. 231fig5.jpg &quot;/&gt; 그림 5. 용기 뚜껑의 내부와 외부 측면의 세부 사항. 이전에 만들어진 구멍에 연결된 튜브 커넥터를 나타내는 이전에 만들어진 구멍. B) 용기 뚜껑의 외측에 부착 된 튜브와 커넥터를 나타내는 용기 뚜껑의 A) 외측.

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An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

프로토콜은 C에서 산소 결핍 / 기아를 사용하는 설명 허혈 / 재관류를 모델로 엘레. 기능적 결과는 사망률 증가, GFP - 라벨의 연결 과정에서 볼 수 이상 및 신경 세포의 기능을 필요로 장애 행동 반응 (가) 있습니다.

허혈 / 재관류에 대한 산소 결핍 - 기아 모델<em&gt; C. 엘레</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

an-anoxia-starvation-model-for-ischemiareperfusion-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

9.8K 조회수.  Universidade de São Paulo.  프로토콜은 C에서 산소 결핍 / 기아를 사용하는 설명 허혈 / 재관류를 모델로 엘레. 기능적 결과는 사망률 증가, GFP - 라벨의 연결 과정에서 볼 수 이상 및 신경 세포의 기능을 필요로 장애 행동 반응 (가) 있습니다. 

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Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

이미징 C. 엘레간스</emEpifluorescent 현미경과 오픈 소스 소프트웨어를 사용> 태아

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

연구

생물학

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

기본<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans의 주 화성 분석

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

배아 배양하는 방법<em&gt; C. 엘레</em&gt; 셀

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

항체 염색법에<em&gt; C. 엘레</em&gt; &quot;동결 크래킹 사용&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

에 상처 응답에 대한 피부 상처에 대한 방법 및 분석 실험<em&gt; C. 엘레</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

방법은 근육의 세포 내 구획을 평가하기 위해<em&gt; C. 엘레</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

후생 동물 모델 생물을 사용하여 확산 및 독성 프리온 같은 단백질을 조사<em&gt; C. 엘레</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

의 발달 프로세스 추적 및 정량화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 오픈 소스 도구를 사용하여

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

C. Elegans의 생리적 스트레스 반응 측정

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...