저자는 유용한 토론이 고체 상 합성 기술과 매튜 플로리다 파커의 초기 개발을 위해 박사 Z, 재커리 브라운과 제니퍼 Alleva 감사드립니다. 이 작품은 Cephalon, 주식 회사에서 지원하는 국방 위협 감소 기관 (국방부-DTRA) (HDTRA1-09-1-0009)와 호르스트 Witzel 원정대 수상에 의해 지원됩니다

1. 설치 <ol><li> 고체 상 합성을위한 반응이 설정은 그림 1과 같이 진공 하에서 밀폐된 여과 플라스크에 폴리 프로필렌 튜브를 통해 연결되어있는 폴리 프로필렌 필터 카트리지 또는 유리 반응기입니다. 반응은 자기 볶음 표시줄이나 반응을 통해 질소를 품어하여 혼합 수 있습니다. </li><li> 그것이 반응 용기는 불활성 분위기 하에서 억제시킬 수 있으며 밀폐 용기에서 시약의 제거를 허용로 건조 튜브 및 석유 버블러 갖춘 아르곤 실린더에 연결된 가스 매니폴드도 권장합니다. </li><li> 모든 작업은 연기 후드 및 적절한 개인 보호 장비 (안전 안경, 실험 복과 nitrile 장갑) 필요로 진행됩니다. </li></ol> 2. 수지에 비스 - 펩타이드 첫째로드 <ol><li> 8 ML 반응 용기에 HMBA-AM 수지 (0.88 mmol / G 로딩, 100 μmol)의 114 MG를 저울질하고 자기 저어 막대를 추가합니다. 회의 최상위를 쏠적어도 5 분 동안 아르곤과 고무 심장과 퍼지 튜브와 전자 들어왔습니다. </li><li> 한편, 그림 3 (586.63 g / 몰, 2eq)와 1 59.2 밀리그램의 화합물 1 117.3 밀리그램의 무게를 - (mesitylene-2-sulfonyl)-3-니트로-1 ,2,4-triazole (MSNT, 296.0 15 ML 일회용 원심 튜브로 G / 몰, 2eq) 2 ML 무수 dichloromethane (DCM)에서 해산. 완전히 녹아까지 솔루션과 믹스에 1-methylimidazole (NMI, 80.81 ML / 몰, 3eq) 24 μL를 추가합니다. </li><li> 주사기를 통해 반응 혈관에 활성화된 솔루션을 전송하고 아르곤 하룻밤 (~ 10 시간) 아래로 휘몰아 수 있습니다. </li><li> 심장을 제거하고 반응 혼합물을 드레인. DCM (5 배)와 dimethylformamide (DMF) (5 배)와 수지 씻으십시오. 수지로드의 정도를 평가하기 위해 섹션 10.1에서 설명한 &quot;메틸 레드 시험&quot;을 수행합니다. 수지는 메틸 레드 시험 중에 빨간색으로 남아있다면 2.2와 2.3가 반복되어야 단계. 부정적인 메틸 레드 시험 나타내는 노란 색깔, 선호이다;그러나, 모든 남아있는 수산기 그룹이 다음 단계로, 약간 긍정적인 결과 (밝은 오렌지색 수지 색상)에 공을되기 때문이다 허용있을 수 있습니다. </li></ol> 3. 상한 먼저 비스 - 펩타이드와 동시 수지의 Deprotection <ol><li> 반응 용기에 DCM 1 ML 추가 다음 삼십초 (기포 발생) 이상 아세트산 dropwise에 1 ML 33 % 브롬화 수소 (HBr)를 추가하고 15 분 동안 저어 수 있습니다. DCM (5 배)와 수지를 분출과 씻고 나서 다시 한 번 과정을 반복합니다. </li><li> DCM (5 배) 후 DMF (5 배)와 수지 씻으십시오. N의 5 % V / V 솔루션, DMF의 N-diisopropylethylamine (DIPEA) 후 DCM (5 배)하고 다시 DMF (5 배)로 씻어로 두 번 세척하여 수지를 무력화. &quot;메틸 레드 시험&quot;과 섹션 10.1 10.2에 나와 &quot;chloranil 검사&quot;를 수행합니다. 결과 chloranil 시험 메틸 시험 빨간색과 긍정을위한 부정이어야합니다. </li></ol> 4. 커플링 Boc / tBu 방지 작용 비스 - 아미더 산성 없음 <ol><li> 무수 DCM로 세 번 세척하여 수지가 들어있는 반응 용기에 불활성 분위기를 다시 소개 그러면 심장과 아르곤 라인을 첨부합니다. 정화 및 무수 DCM에서 한두 ML를 추가하고 아르곤 라인 버블러가 상승하기 시작 때까지 선박 배수 30 초 동안 저어 놓아 혈관을 씻는다. 최소 한번 더이 작업을 수행합니다. </li><li> 불꽃 건조 시험에서 DMF : 비스 - 아미노산 (3eq)와 2시 1분 DCM 2 ML 1 - 히드록시-7-azabenzotriazole (HOAt, 136.11 g / 몰, 18eq)의 245 밀리그램을 기능화 0.15 M의 용액을 준비한다 아르곤 분위기 하에서 튜브. diisopropylcarbodiimide 47 μL (DIC, 156.6 ML / 몰, 3eq)을 추가하고 90 분간 저어. </li><li> 수지에 666 μL 무수 DMF 35 μL DIPEA를 (174.19 ML / 몰, 2eq) 추가 5 분 동안 저어 수 있습니다. </li><li> 주사기를 통해 반응 용기에 미리 활성화된 비스 - 아미노산 솔루션을 전송하고 하룻밤 휘몰아 수 있습니다. </li><li> 반응 혼합물을 분출과 무수 DCM로 두 번 씻어 하의<html> 아르곤. </li><li> diketopiperazine의 폐쇄를 홍보하려면 1시 1분 DCM의 4 ML에 HOAt (136.11 g / 몰, 10eq) 및 DIC (156.6 ML / 몰, 10eq)의 0.25 M 용액 추가 DMF하고 아르곤 아래로 휘몰아 수 1 시간 정도. </li><li> 심장을 제거하고 반응 혼합물을 드레인. DCM (5 배)와 DMF (5 배)와 수지 씻으십시오. 원하는 경우 섹션 10.2에서 논의된 &quot;chloranil 테스트&quot;를 수행합니다. </li></ol> 5. Boc / tBu 방지 작용 비스 - 아미노산의 Deprotection <ol><li> 반응 용기에 triisopropylsilane (도움말 참조)하고 1 시간 정도 저어 수 : 95:5 trifluororacetic 산 (TFA)의 솔루션이 ML을 추가합니다. 배수하고 다시 한 번 과정을 반복 DCM (5 배)로 약 30 초 동안 수지 씻는다. </li><li> DCM (5 배) 후 DMF (5 배)와 수지 씻으십시오. 그리고 DCM (5 배)하고 다시 DMF를 (5 배) 씻어 DMF에 DIPEA의 5 % V / V 솔루션으로 두 번 세척하여 수지를 무력화. 원하는 경우 섹션 10.2에서 논의된 &quot;chloranil 테스트&quot;를 수행합니다. </li></ol>비스 - 펩타이드 타겟으로 합성하기 원하는대로 르 &quot;&gt; 6. 반복 4 단계와 5. 7. 비스 - 펩타이드의 Prolidine 엔드 Functionalizing <ol><li> 성장 비스 - 펩타이드의 prolidine 엔드는 diketopiperazine를 통해 독립적으로 또는 함께 acylated 수 있습니다. 또한이 부분이 무료로 아미노산을 affording, 후자를 죽습 수있는 보호 남아있을 수 있습니다. 원하는 경우, 커플링 효율을 평가하기 위해 섹션 10.2에 나와 &quot;chloranil 테스트&quot;를 수행합니다. </li></ol> 8. 비스 - 펩타이드의 제사기 엔드 Fmoc 및 Acylation의 Deprotection <ol><li> 20 분 동안 DMF의 20 % 피페리딘의 2mL 솔루션이 추가되고 반응이 혼합됩니다. DMF (5 배)와 수지를 분출과 씻고 나서 다시 한 번 과정을 반복합니다. </li><li> DCM (5 배) 후 DMF (5 배)와 수지 씻으십시오. </li><li> MG 2 114과 N-methylpyrrolidone 2 ML (NMP)에 아미노산 (3eq)의 0.15 M 용액을 준비한다 - (7 아자 1H-benzotriazole-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate<html> (HATU, 380.2 g / 몰, 3eq)와 104.5 μL DIPEA (174.19 ML / 몰, 6eq)와 잘 섞는다. 반응 용기에 넣고 6 시간 동안 저어 수 있습니다. </li><li> DCM (5 배) 후 DMF (5 배)와 수지 씻으십시오. </li></ol> 9. 수지에서 아미노산과 다니엘를 묶고있는 수지에서 Boc 그룹 제거 <ol><li> 반응 용기에 DCM 솔루션과 30 분간 볶음 수 : 1:1 TFA 2 ML을 추가합니다. DCM (5 배)와 수지를 분출과 씻고 나서 다시 한 번 과정을 반복합니다. </li><li> 그리고 DCM (5 배) DMF (5 배)와 30 초 수지를 씻어 및 드레인. </li><li> 무수 DMF의 10 % DIPEA의 솔루션이 ML을 추가하고 24~48시간 저어 수 있습니다. </li><li> 미리 무게 둥근 바닥 플라스크에 반응 혼합물을 수집합니다. LC-MS의 약병에 THF의 450 μL에이 용액의 30 μL를 전송 및 분석을 위해 제출합니다. DMF의 추가 aliquots으로 수지를 씻어하고 둥근 바닥 플라스크에 수집 후 vacuo에서 용매 제거합니다. </li></ol>&quot;dflinebreak&gt; 10. 비스 - 펩타이드의 정제 <ol><li> HPLC의 유리병에 삽입 디메틸 sulfoxide (100-250 μL) 및 전송의 최소 금액 비스 - 펩타이드 원유를 해산. 세미 prepitive HPLC 시스템 (휴렛 패커드 1100 시리즈)의 autosampler에 장소 인서트는 엑스 테라를 몰았어 초등학교 MS C18 5 μm의 7.8x150 밀리미터 칼럼과 100 μL 주입 루프가 장착되어. </li><li> 274 NM에서 모니터링을하면서 삼십분 동안 0.1 % 개미의 산성과 함께 물에 5~95%의 acetonitrile의 그라디언트 프로그램을 사용하여 샘​​플의 여러 50 μL 주입을 수행합니다. 미리 무게 일회용 원심 튜브에 제품 피크를 수집하고 lyophilizer를 사용하여 건조 동결.주의는 일반적으로 관찰되고 분석 LCMS에 비해 피크 유지 시간에 약간의 변화로 처음 실행으로 연결됩니다. </li></ol> 11. 평가 방법 <ol><li> 메틸 레드 테스트 7: 일회용 피펫을 통해 건조 수지 ~ 1 밀리그램을 제거 4 ML 반응 용기에 린스. 500 μL 무수 DCM에 20 밀리그램 메틸 레드, 50 μL N, N&#39;-diisopropylcarbodiimide (DIC), 5 MG 4-dimethylaminopyridine (DMAP)의 솔루션을 추가하고 5-10 분 동안 저어 수 있습니다. 분출과 여과물가 무색 될 때까지 DCM와 수지를 씻는다. 긍정적인 징후가 주황색이나 빨간색이 남아있는 수지 비즈입니다. </li><li> CHLORANIL TEST를 12 : 전송 ~ 일회용 피펫을 통해 작은 유리병에 건조 수지 1 밀리그램. 0.8 밀리미터 DMF 용액에서 chloranil 및 DMF 용액에 2 % 아세트 알데히드 모두 3 방울을 추가하고 5-10분 동안 실내 온도에 앉아 보자. 긍정적인 징후가 보라색 / 청색 터닝 수지 비즈입니다. </li><li> 활성 트랩 테스트 : 합성하는 동안 활성 화합물은 액체 크로마 토그래피 - 질량 분석법 (LC-MS) pyrrolidine 50 μL를 포함 유리병에 활성 솔루션의 소량 (5-10 μL)를 전송하여 평가 할 수 있습니다. 몇 초 동안 손으로 믹스 (soluti에 tetrahydrofuran (THF)의 450 μL로 희석와 LC-MS 분석에 제출 후) 노란색 수있게됩니다. </li><li> 분석 LC-MS : 최종 제품 및 활성 중간체는 워터스 엑스 테라를 몰았어 MS C18 3.5 μm의이 장착된 HP 1200 시리즈 LC-MS 시스템을 사용하여 평가받을 수있는 4.6 mm X 150mm 칼럼과 물에 5-95%의 acetonitrile의 기울기 시스템 삼십분 이상 0.1 % 개미의 산성으로. </li></ol> 12. 대표 결과 두 원유의 예 (그림 4)와 정화는 (그림 5) LCMS의 흔적이 제공됩니다. 약 10 %의 정제 수율은 위에서 설명한 방법을 사용하여 예상된다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig1.jpg" /> 그림 1. 고상 합성에 대한 실험 설정의 다이어그램. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig2.jpg" /> 그림 2.비스 - 아미노산 / BIS-펩티드의 관련 명명법. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig3.jpg" /> 그림 3. 전체 합성 제도. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4112/4112fig3large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . <img alt="그림 4A" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4a.jpg" /> 그림 4A. 274 NM에서 조잡 제품의 HPLC 추적. <img alt="그림 4B" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4b.jpg" /> 그림 4B. 조잡 제품 피크의 MS 스펙트럼. <img alt="그림 5A" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5a.jpg" /> 그림 5A. 274 NM에서 제품을 죄를 씻고의 HPLC 추적. <img alt="그림 5B" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5b.jpg" /> 정화 Produc의 그림 5B. MS 스펙트럼t 피크.

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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

본 발표 합성 방식은 일반적인 고체 상 펩타이드 합성 기술을 사용하여 비스 - 아미노산 빌딩 블록에서 작용 비스 - 펩티드의 합성에 대한 방법을 제공합니다. 트랜스-4-hydroxyproline 3에서 이러한 &quot;Pro4&quot;빌딩 블록의 단량체 합성은 높은 확장성이며 성공적으로 600 mmol (234 G) 규모 (게시되지 않은)에서 hydantoin 단계로 완료되었음을 알려드립니다. 단량체가 손에있다되면 고체 상 기술을 사용하여 반응 직장 업과 중간 purifications에 대한 필요성을 제거하여 현재 솔루션 상 방법론 4보다 비스 - 펩타이드 합성의 더 빠른 방법을 제공합니다. 고체 상 합성의 주요 과제는 더 중간체가 고립되지부터 해결 합성 진보와 문제를 진단하고 있습니다. 이것은 식별 비롯하여 많은 colorimetric 시험의 개발에 앞서있다면 무료로 아민 (카이저 시험 10) 또는 무료 하이드yls (메틸 레드 시험 7) 수지에 노출됩니다. 불행히도, 일반적으로 사용되는 카이저 시험 10 제사기 탄소에 연결된 보조 아민 또는 아민의 거의 독점적인 사용으로 인한 우리의 고체 상 합성에서 일반적으로 적용되지 않습니다. HMBA 수지에 대한 평가를위한 다른 옵션은 히드 라진 11, VIS / UV 1,11에 의해 모니터링 정량 Fmoc 절단으로 nucleophile를 사용하고 포집 및 수신 활성 화합물을 분석하는 테스트 cleavages을 포함합니다. 고체 상 합성의 또 다른 간과할 문제는 운영자가 필요한 합성 단계의 반복적인 성격이다. 이것은 마음과 함께 모든 수동 고체 상 펩타이드 합성을 수행할 때, 저자는 강력하게 스프레드 시트 또는 체크리스트의 사용을 권장합니다. 흔히 α-아미노산에 비해 고체 상 합성을위한 비스 - 펩티드를 사용하는 difficultly은 steric 힌을로 인해 더 어려워 커플링의 가능성을 포함drance, 온 - 수지 diketopiperazine의 폐쇄에 대한 필요성, 그리고 동시 deprotections (Boc / tBu; Cbz / tBu). 또 다른 difficultly 더 전통적인 방법에 비해이 &quot;안전 캐치&quot;방법을 사용하여 수지의 양적 자료를 달성에있다. 염두에두고 이러한 요소의 경우는,이​​ 방법의 더 최적화가 달성하고 현재의 노력이 여기에 제시된 방법을 개선하기 위해 그룹에서 진행 될 수있는 것은 아주 가능하다.

<table border="1"><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> HMBA 암을 수지 </td><td> NovaBiochem </td><td> 855,018 </td><td></td></tr><tr><td> MSNT </td><td> NovaBiochem </td><td> 851,011 </td><td></td></tr><tr><td> NMI </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 336,092 </td><td> 유독, 부식 </td></tr><tr><td> DCM </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;N4=D65100%7CSIAL&amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;F=SPEC" target="_blank">D65100</a> </td><td> 발암성 </td></tr><tr><td> 무수 DCM </td><td> Acros </td><td> 34,846 </td><td> 발암성 </td></tr><tr><td> 아세트산의 33 % 브롬화 수소 (HBr) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 248,630 </td><td> 유독, Corrosive, 가스 때 열려 </td></tr><tr><td> DIPEA </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 387,6​​49 </td><td> 부식, 독성, 가연성 </td></tr><tr><td> DMF </td><td> 피셔 과학 </td><td> AC27960 </td><td> 독성, 가연성 </td></tr><tr><td> 무수 DMF </td><td> Acros </td><td> 34,843 </td><td> 독성, 가연성 </td></tr><tr><td> HOAt </td><td> GenScript </td><td> C01568 </td><td></td></tr><tr><td> DIC </td><td> Acros </td><td> BP590 </td><td> 부식, 독성, 가연성 </td></tr><tr><td> TFA </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> T6508 </td><td> 유독, 부식 </td></tr><tr><td> 팁 </td><td> Acros </td><td> 21,492 </td><td> 독성, 가연성 </td></tr><tr><td> 피페리딘 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 104,094 </td><td> 부식, 독성, 가연성 </td></tr><tr><td> HATU </td><td> GenScript </td><td> C01566 </td><td&gt; 독성 </td></tr><tr><td> NMP </td><td> Acros </td><td> 36,438 </td><td> 유독한 </td></tr><tr><td> DMAP </td><td> NovaBiochem </td><td> 851,055 </td><td> 유독한 </td></tr><tr><td> 메틸 레드 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 250,198 </td><td></td></tr><tr><td> THF </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 401,757 </td><td> 성형 가연성, 독성, 과산화수소 </td></tr><tr><td> Pyrrolidine </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P73803 </td><td> 부식, 독성, 가연성 </td></tr><tr><td> 디메틸 Sulfoxide </td><td> 어부 </td><td> D1281 </td><td></td></tr><tr><td> SPPS 반응 선박 </td><td> 은혜 </td><td> 211,108 </td><td></td></tr><tr><td> LCMS </td><td> 애질런트 </td><td> 1200 시리즈 </td><td></td></tr><tr><td> 세미 초등학교 LC </td><td> 휴렛 팩커드 </td><td> 1100 시리즈 </td><td></td></tr><tR&gt; <td> Lyophilizer </td><td> Labconco </td><td> 7,934,027 </td><td></td></tr><tr><td> Rotovapor </td><td> Buchi </td><td> R-210 시리즈 </td><td></td></tr><tr><td> 아르곤 </td><td> Airgas </td><td> AR PP300CT </td><td></td></tr></table>

solid phase synthesis of a functionalized bis-peptide using "safety catch" methodology

1962 년, RB Merrifield 효율적으로 펩티드를 합성하는 새로운 경로로 고체 상 펩타이드 합성을 사용하여 첫 번째 절차를 발간했습니다. 이 기술은 빠른 시간과 노동 모두에서 자사의 솔루션 상 전임자 이상의 유리임이 밝혀졌다. 고체 지원의 성격에 관한 개선, 보호 그룹은 고용과 지난 50 년 동안 고용 커플링 방법은 Merrifield의 ​​원래 시스템의 유용성을 증가하고있다. 오늘날 Boc 기반 보호 및베이스 / nucleophile cleavable 수지 전략이나 Fmoc 기반 보호 및 산성 cleavable 수지 전략의 사용은 가장 일반적으로 펩티드 1의 합성에 사용되며, RC 셰퍼드에 의해 개척. Merrifield의 탄탄한 지원 전략에 의해 영감을, 우리는 여기에서 설명하는 작용 비스 - 펩티드 2의 조립 Boc / tert-부틸 고체 상 합성 전략을 개발했습니다. t에 비해 고체 상 합성에의 이용O 용액 상 방법론은 Merrifield 1 설명된대로 시간과 노동을 모두에만 유리한 것이 아니라, 또한 비스 - 펩타이드 라이브러리의 합성에 매우 쉽게이 있습니다. 우리가 여기서 발휘하는 합성은 두 단계로 diketopiperazine 형성에 의한 수지의 비스 - 펩타이드 작용을 공개하는 메커니즘을 &quot;안전 잡는 &#39;사용하는 최종 절단 단계를 포함합니다. 비스 - 펩티드는 종류와 입체 monomeric 단위의 각각의 단량체 사이의 연결에 의해 제어 예측하고 designable 방법으로 기능을 배치할 수있는 비스 - 아미노산의 강성, spiro-래더 oligomers입니다. 각 비스 - 아미노산 두 개의 아미노산 (α-아민과 카르복실산) 3,4를 포함 stereochemically 순수한 주기적 발판이다. 저희 연구실은 현재 촉매 작용, 단백질 - 단백질 상호 작용과 N을 포함하여 분야의 다양한 기능에 걸쳐 비스 - 펩티드의 가능성을 조사하고 있습니다anomaterials.

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Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using &quot;Safety Catch&quot; Methodology

HMBA 수지에서 절단 절차를 &quot;안전 잡는 &#39;활용하는 작용 비스 - 펩티드 trimer의 효율적인 고체 상 펩타이드 합성이 설명되어 있습니다.

기능화 비스 - 펩타이드의 고상 합성은 방법론 &quot;을 안전 잡아라&quot;사용

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

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Biology

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

24.4K 조회수.  Temple University. HMBA 수지에서 절단 절차를 "안전 잡는 '활용하는 작용 비스 - 펩티드 trimer의 효율적인 고체 상 펩타이드 합성이 설명되어 있습니다.

비디오: Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

Optimization of the Ugi Reaction Using Parallel Synthesis and Automated Liquid Handling

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described. Triplicate runs of 48 parallel experiments are reported, varying concentration, solvent and the excess of some of the reagents. The isolation of the product was achieved by a simple filtration and wash procedure. The highest yield obtained was 66% from 0.4 M methanol with 1.2 eq. of imine. This is significantly above the 49% yield obtained from the initial reaction under equimolar concentration at 0.4 M in methanol. Methanol solutions with reagent concentrations of 0.4M or 0.2M gave superior yields while all solvent systems at 0.07M performed poorly. At 0.2M, methanol and ethanol/methanol (60/40) mixtures were statistically equally good while THF/methanol (60/40) was poor and acetonitrile/methanol (60/40) was intermediate. Good reproducibility of the precipitate yields was obtained in these replicate experiments, allowing for subtle interaction effects to be positively identified.

The Ugi reaction has proved to be a convenient way to quickly create diverse libraries of compounds. It involves the reaction of an amine, an aldehyde, a carboxylic acid and an isonitrile typically in methanol at room temperature. In this video, we utilize a 48-slot Mettler-Toledo MiniBlock equipped with filtration tubes and a Mettler-Toledo MiniMapper automated liquid handler was used to deliver the reagents and solvent. The parameters of interest were the concentration, the solvent composition and the excess of some of the reagents.

병렬 합성 및 자동 액체 처리를 사용하여 Ugi 반응의 최적화

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described.  Triplicate runs ...

연구

생물학

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

생물 학적 시스템에서 산소 이미징에 대한 인광을 발하는 나노 프로브의 합성 및 교정

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide range of species, including mammals. It also causes a decrease in body weight and fertility, as well as lower levels of plasma glucose, insulin, and IGF-1 in these animals. This treatment is often referred to as dietary restriction (DR) or caloric restriction (CR). The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as an important model organism for studying the biology of aging. Both environmental and genetic manipulations have been used to model DR and have shown to extend lifespan in C. elegans. However, many of the reported DR studies in C. elegans were done by propagating animals in liquid media, while most of the genetic studies in the aging field were done on the standard solid agar in petri plates. Here we present a DR protocol using standard solid NGM agar-based plate with killed bacteria.

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Here we present a protocol for performing solid plate-based dietary restriction in C. elegans with killed bacteria.

솔리드 플레이트 기반식이 제한에 Caenorhabditis 엘레간스</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if animals have been exposed to adventitious infectious agents (viruses, mycoplasma, and other fastidious microorganisms). Infections of immunocompetent animals are generally transient, yet serum antibody responses to infection often can be detected within days to weeks and persist throughout the life of the host. Serology is the primary diagnostic methodology by which laboratory animals are monitored. Historically the indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has been the main screening method for serosurveillance. The ELISA is performed as a singleplex, in which one microbial antigen-antibody reaction is measured per well. In comparison the MFIA is performed as a multiplexed assay. Since the microspheres come in 100 distinct color sets, as many as 100 different assays can be performed simultaneously in a single microplate well. This innovation decreases the amount of serum, reagents and disposables required for routine testing while increasing the amount of information obtained from a single test well. In addition, we are able to incorporate multiple internal control beads to verify sample and system suitability and thereby assure the accuracy of results. These include tissue control and IgG anti-test serum species immunoglobulin (&alpha;Ig) coated bead sets to evaluate sample suitability. As in the ELISA and IFA, the tissue control detects non-specific binding of serum immunoglobulin. The &alpha;Ig control (Serum control) confirms that serum has been added and contains a sufficient immunoglobulin concentration while the IgG control bead (System Suitability control), coated with serum species immunoglobulin, demonstrates that the labeled reagents and Luminex reader are functioning properly.

Using Luminex Corporation&#x2019;s xMAP microsphere technology, we have developed the Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay (MFIA) for serosurveillance of various laboratory animal species. The MFIA is a suspension microarray where antigen, tissue control or immunoglobulins are covalently linked to color-coded polystyrene microspheres. The MFIA testing method as well as various troubleshooting topics is addressed.

멀티 플렉스 Fluorometric 면역 분석법 테스트 방법론 및 문제 해결

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

단백질 - 단백질 상호 작용 연구를 자성 비즈를 사용하여 액상 동질 캡처 분석 : Poliovirus-Nanobody의 예

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase synthesis using standard phosphoramidite chemistry. Oligonucleotides are post-synthetically labeled by two new photostable cyanine dyes using copper-catalyzed click-chemistry. The synthesis of both donor and acceptor dye is described and is performed in three consecutive steps. With the DNA as the surrounding architecture, these two dyes undergo an energy transfer when they are brought into close proximity by hybridization. Therefore, annealing of two single stranded DNA strands is visualized by a change of fluorescence color. This color change is characterized by fluorescence spectroscopy but can also be directly observed by using a handheld ultraviolet (UV) lamp. The concept of a dual fluorescence color readout makes these oligonucleotide probes excellent tools for molecular imaging especially when the described photostable dyes are used. Thereby, photobleaching of the imaging probes is prevented, and biological processes can be observed in real time for a longer time period.

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

광 안정성 시아닌 염료를 사용하여 파장 변환 DNA 혼성화 프로브의 합성

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, Rhizoctonia bataticola. In the literature, comprehensive and detailed step-by-step protocols on disease assays are sparse. This article provides complete details on the steps involved in setting up a blotting paper technique for quickly screening genotypes for resistance to DRR. The blotting paper technique is easy and less expensive. Another method, based on the sick pot approach, is a mimic of natural infection and can be applied to study the interacting components&#8212;plant, pathogen, and environment&#8212;involved in the disease triangle.
Moreover, in nature, DRR occurs mostly in rainfed chickpea cultivation areas, where soil moisture recedes as crop growth advances. Drought stress is known to predispose chickpea plants to DRR disease. Pathomorphological and molecular understanding of plant-pathogen interaction under drought stress can pave the way for the identification of elite DRR-resistant varieties from the chickpea germplasm pool. This article provides a stepwise methodology for the preparation of a sick pot and subsequent disease assay. Overall, the information presented herein will help researchers prepare R. bataticola fungal inoculum, maintain this pathogen, set up the blotting paper technique, prepare sick culture and sick pot, and assess pathogen infection in chickpea plants.

This study presents methodologies to study the pathomorphological and molecular mechanisms underlying chickpea&#8211;Rhizoctonia bataticola interaction. The blotting paper method is useful to rapidly study chickpea genotype responses, while the sick pot-based method can be used to simultaneously impose drought and R. bataticola infection and screen for tolerant genotypes.

병아리콩에서 건조 루트 썩은 질병 에세이 : 상세한 방법론

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, ...

Functionalized Spirocyclic Heterocycle Synthesis and Cytotoxicity Assay

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring systems is challenging. An efficient methodology to synthesize these compounds was recently published that described the solid phase synthesis in four steps rather than the previously reported five steps. The advantage of this shorter synthesis is the elimination of the use of toxic reagents. Low-loading Regenerating Michael (REM) linker-based resin was found to be crucial in the synthesis as high-loading versions prevented the addition of reagents containing bulky phenyl and aromatic side chains. The colorimetric 3-(4&#8242;,5&#8242;-dimethylthiazol-2&#8242;-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was used to examine the cytotoxicity of micromolar concentrations of these novel spirocyclic molecules in vitro. MTT is readily available commercially and produces relatively fast, reliable results, making this assay ideal for these spirocyclic heterocycles. Orthogonal ring structures as well as furfurylamine (a precursor in the synthesis method containing a similar 5-member ring motif) were tested.

Here, we describe a bioassay using 3-(4&#8242;,5&#8242;-dimethylthiazol-2&#8242;-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) to test previously synthesized spirocyclic oximes.

기능화된 스피로사이클릭 헤테로사이클 합성 및 세포독성 분석

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important players in the maintenance of organismal homeostasis and the progression of a wide spectrum of diseases. While the current research focuses on the characterization of endogenous exosomes with the endosomal origin, microvesicles blebbing from the plasma membrane have gained increasing attention in health and sickness, which are featured by an abundance of surface molecules recapitulating the membrane signature of parent cells. Here, a reproducible procedure is presented based on differential centrifugation for extracting and characterizing EVs from the plasma and solid tissues, such as the bone. The protocol further describes subsequent profiling of surface antigens and protein cargos of EVs, which are thus traceable for their derivations and identified with components related to potential function. This method will be useful for correlative, functional, and mechanistic analysis of EVs in biological, physiological, and pathological studies.

The present protocol describes a method to extract extracellular vesicles from the peripheral blood and solid tissues with subsequent profiling of surface antigens and protein cargos.

혈장 및 고형 조직에서 추적 가능하고 기능화된 세포외 소포의 분리 및 분석

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome segregation. As DNA synthesis defects underlie chromosome rearrangements, monitoring DNA replication has become essential to understand the basis of genome instability. Saccharomyces cerevisiae is a classical model to study cell cycle regulation, but key DNA replication parameters, such as the fraction of cells in the S phase or the S-phase duration, are still difficult to determine. This protocol uses short and non-toxic pulses of 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), a thymidine analog, in engineered TK-hENT1 yeast cells, followed by its detection by Click reaction to allow the visualization and quantification of DNA replication with high spatial and temporal resolution at both the single-cell and population levels by microscopy and flow cytometry. This method may identify previously overlooked defects in the S phase and cell cycle progression of yeast mutants, thereby allowing the characterization of new players essential for ensuring genome stability.

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2&#039;-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

We describe two complementary protocols to accurately determine S-phase duration in S. cerevisiae using EdU, a thymidine analog, which is incorporated in vivo and detected using Click chemistry by microscopy and flow cytometry. It allows for the easy characterization of the duration of DNA replication and overlooked replication defects in mutants.

사카로마이세스 세레비시아에 5-에티닐-2'-데옥시우리딘 혼입을 사용한 S상 지속 시간 측정

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome ...