이러한 방법은 생체 재료 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 특히 뼈 재생에 대 한. 그들은 생체 재료와 잠재적인 면역 반응의 효과 평가 하는 데 사용 됩니다.
이 종합 플랫폼의 주요 장점은 뼈 수리에 사용되는 생체 재료의 생체 적합성을 예측하기위한 다양한 매개 변수를 제공한다는 것입니다. 시험관 내 및 생체 내 뼈 기술의 의미는 그밖 뼈 무질서쪽으로 확장합니다. 때문에 새로운 정형 외과 생체 재료의 전임상 검사의 필요성.
피부과 방법론은 뼈 치유를 위한 생체 재료에 대한 통찰력을 제공할 수 있으며, 다른 임상 적응증을 위한 생체 재료 평가에도 적용될 수 있다. 골성 미네랄화 배지의 첨가 후 14일 간 1차 골세포에서 흡인배기 배지. 1X PBS의 0.5 밀리리터로 두 번 헹구는 다.
그런 다음 10%의 완충 된 포르말린 용액의 0.5 밀리리터를 추가하고 10 분 동안 실온에서 배양하여 세포를 수정합니다. 10분 후, 10% 버퍼링된 포르말린을 일회용 파이펫으로 흡인하고 0.5 밀리리터의 초순수로 두 번 세척합니다. 그런 다음 고정 된 골에 40 밀리머 알리자린 레드 S 염색 용액의 250 마이크로 리터를 추가합니다.
그리고 분당 100 쉐이크에서 셰이커에 10 분 동안 실온에서 접시를 배양하십시오. 스테핑 용액으로 인큐베이션을 사용하여 염색 용액을 일회용 파이펫으로 흡인하고 1 밀리리터의 초순수로 헹구세요. 헹구는 용액이 명확해질 때까지 이 단계를 5~10회 반복하여 비특이적 얼룩을 제거합니다.
마지막 세척을 한 후, 차가운 PBS의 1 밀리리터를 추가합니다. 그리고 이전과 같이 셰이커에 10 분 동안 실온에서 접시를 배양. 다음으로, 스테인드 베타 트리칼슘 인산염 디스크를 새로운 우물로 옮기고 평판 스캐너로 플레이트를 스캔하여 광물화를 기록합니다.
이미지 캡처 후, 10% 세틸피리디늄 염화물 용액의 250 마이크로리터를 추가하고 15분 동안 흔들어 알리자린 레드 S 염료를 추출합니다. 다음으로, 우물에서 1.5 밀리리터 튜브및 원심분리기로 실온에서 5분 동안 000 x g로 용액을 옮긴다. 1.5 밀리리터 튜브에서 1:10~1:20의 희석 배급으로 10%의 세틸피리디늄 염화물 용액으로 추출물을 희석시 희석시.
그런 다음 각 희석 된 샘플의 300 마이크로 리터를 96 웰 플레이트의 우물로 옮킨다. 염화10%만 함유한 빈 우물 2개를 포함합니다. 다음으로, 표준 곡선을 생성하기 위해 10%의 세틸피리디늄 염화물 용액으로 40 밀리오몰러 알리자린 레드 S 염색 용액을 희석하여 4400 마이크로몰라에 이르는 7개의 Alizarin Red S 기준 표준을 준비합니다.
각 표준의 300 마이크로리터를 플레이트에 적재합니다. 마지막으로, 520 나노미터에서 샘플, 블랭크 및 기준 표준의 흡수제를 읽어보십시오. 멸균 가위를 사용하여 검수 골다공전구체를 안락사 마우스의 대퇴골과 경골으로부터 분리하여 엉덩이 관절에서 신체에서 다리를 제거합니다.
무릎과 발목 관절의 팔다리를 자르고 멸균 메스와 집게로 연조직을 제거합니다. 표피를 잘라냅니다. 27 게이지 바늘을 주사기에 부착하여 뼈 성장 배지 1밀리리터로 채워진 주사기에 부착된 27게이지 바늘을 루멘에 넣고 골수를 6센티미터 멸균 페트리 접시에 넣습니다.
모든 대퇴골과 경골에 대해 이를 반복한 후 세포 현탁액을 50 밀리리터 원문 튜브로 옮기십시오. 6센티미터 페트리 접시를 뼈 성장 매체의 5밀리리터로 씻어 동일한 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮겨냅니다. 섭씨 4도에서 350 x g의 원심분리기는 5분간.
원심분리에 따라 다골 세포 분화 배지의 웰당 1밀리리터로 세포를 다시 중단한다. BALB/c 마우스 1개에서는 24웰 배양 플레이트 1개에 충분한 수의 골세포 전구체를 제공합니다. 뼈 성장 배지에서 중단된 1차 골세포를 생체 재료에 넣고 제곱센티미터당 8.8*10^4세포에서 대조군을 추가합니다.
베타 트리칼슘 인산염 디스크, 조절된 소 뼈 및 조직 배양 플라스틱이 여기에 사용됩니다. 24시간 동안 이산화탄소 5%에서 섭씨 37도에서 배양합니다. 24시간 후, 갓 분리된 골수 골수 전구체와 골분세포 분화 배지를 배양된 1차 골관절염에 추가하고 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 5일간 배양식으로 돌아갑니다.
매일 신선하게 준비된 골세포 분화 매체로 배지를 교체하십시오. 그런 다음 타타르트 내성 산 인산염을 위한 스테인 골세포가 분화를 평가합니다. 마취 된 8 주 된 BALB / c 마우스의 두피를 면도하고 7.5 %의 포비도네 요오드 용액과 70 %의 에탄올로 표면을 청소하십시오.
시술 중에 건조를 방지하기 위해 안과 연고로 눈을 가립니다. 발가락과 꼬리 꼬집어 반응의 부족으로 마취의 적절한 수준을 확인합니다. 그런 다음 중간 위선 처상 절개를 한 후 메스로 긁어 오른쪽 정수리 뼈 위의 파라크라늄 결합 조직을 제거합니다.
그런 다음 분당 직경 4밀리미터의 멸균 치과 트레핀을 사용하여 오른쪽 정수리 뼈에 중요한 크기의 결함을 만듭니다. 적당한 뼈를 노치하고 자궁 내막과 일부 엔토코르텍스를 절단하면서 멸균 식염수 용액으로 부위를 지속적으로 관개합니다. 데라 마터의 손상을 방지하기 위해 작은 페리오스토스토스 엘리베이터를 사용하여 나머지 엔코코르텍스를 뚫습니다.
그런 다음 집게를 사용하여 칼변이를 조심스럽게 들어 올리고 제거합니다. 그 결과 결함은 원형과 직경 약 3.5밀리미터여야 합니다. 다음으로, 멸균 PBS에 미리 담근 베타 트리칼슘 인산염 콜라겐 폼으로 칼변변성 결함을 채웁니다.
생체 물질을 제자리에 유지하려면 결함의 끝에 0.5 마이크로리터의 조직 접착제를 두 개의 반대 지점에서 적용하십시오. 그런 다음 흡수할 수 없는 봉합사로 피부를 닫습니다. 마취 된 마우스를 등에 놓고 복부 털을 면도하고 7.5 %의 포비도네 요오드 용액과 70 %의 에탄올로 면도 된 표면을 청소하십시오.
복부의 리나 알바를 따라 피부를 통해 8 밀리미터 길이의 중간 선 절개를 한 후, 임플란트 PBS는 피부 밑에 생체 물질을 담그었다. 그런 다음 흡수할 수 없는 봉합사로 피부를 봉합합니다. 이식 후 8주, 안락사 된 마우스에서 주변 조직으로 이식 부위를 배분한다.
이 이미지는 오픈 바에 표시된 베타 트리칼슘 인산염 디스크의 성장이 7일과 14일 문화의 조직 배양 플라스틱의 성장에 비해 골다막트 생존에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여줍니다. 배양 된 골세포는 14 일 후에 알리자린 레드 S로 염색되었습니다. 광물화는 중간배지에서만 배양된 골에 비해 광물화 배지 제어를 위해 높았다.
그리고 현탁액 배양 우물에서 베타 트리칼슘 인산염 디스크에. 외과적으로 유발된 치명적인 크기의 calvarial 결손증이 비어 있을 때, 전체 결함을 덮는 얇은 층이 관찰되었지만 수술 후 12주 동안 에는 중요한 뼈 형성이 존재하지 않았습니다. 대조적으로, 결함이 베타 삼칼슘 인산염 콜라겐 폼을 포함했을 때, 일부 혈관과 염증 세포를 포함한 조밀 한 섬유 조직에 둘러싸인 거품 잔재는 뼈 형성의 증거없이 결함 영역을 교개했다.
피하 베타 트리칼슘 인산염 콜라겐 폼 이식에 이어, 이물질 거대 세포와 함께 염증 반응을 관찰하였으며, 혈소시클린과 에오신 염색 섹션에서는 8주 만에 마슨의 삼색 염색 부위에 섬유증의 증거가 나타났다. 대조적으로, 가짜 대조의 이식 사이트는 최소한의 염증과 섬유증이 없었다. 이 절차를 시도하는 동안 동물을 다치게하지 않고 칼바륨의 정확하고 재현 가능한 노칭을하는 것이 중요합니다.
골세포 분화 세포 와 높은 처리량과 같은 이 절차의 다른 방법에 따라 생체 재료 및 면역 반응의 유형에 대한 osteoclast의 반응과 같은 추가 질문에 대답하기 위해 미리 형성 될 수 있습니다.
