타카유키 나가사키에서 실험 지원; 실명 방지를위한 조사이 연구는 안과 및 Visual 연구에서 동물의 사용에 대한 ARVO 보호 정책을 준수합니다. KJW는 NIH 보조금 5T32EY013933 및 5T32DK007647-20에 의해 지원됩니다. VBM은 NIH 보조금 K08EY020530에 의해 지원됩니다.

1. Subretinal 사출을위한 장치 조립 <ol><li> 구입 또는 유리 모세관에서 100 μm의 직경 바늘을합니다. 이것은 셔터 P-97 pipet을 끌어 당기는 또는 이와 유사한 장비를 사용하여 수동으로 수행 할 수 있습니다. 가 원하는 직경 (100 μm)에 도달 할 때까지 모세관 튜브의 끝을 가열하여 가져온 것입니다. 작은 직경 바늘은 유전자 치료 벡터에 사용 할 수 있지만,이 셀 또는 눈에 손상없이 세포 분사에 대한 권장 직경입니다. 강철 바늘에 비해 유리 모세관 바늘이 망막 파손의 원인이없이 주입 유체 및 subretinal 공간에 액세스 시각화를 위해 허용하는 아주 좋은하지만, 무딘 팁을 가지고 있습니다. 멸균 용기에 70 %의 에탄올 및 저장을 사용하여 필요한 경우이 당겨 바늘을 청소하십시오. 장소에 바늘을 가질 테이프 15cm 무균 조직 배양 접시에 주입 바늘이 적용하고 무균 환경에서 유지하는 방법 중 하나입니다. 이 시점에서, compl프로 시저가 개최됩니다 외과 객실 내에서 설정을 어서!. 그것은이 절차는 장벽 시설 내에서 수행됩니다 특히,이 무균 상태로 유지 될 수 있도록 항상 수술 방에 모든 장비를 유지하기 쉬운 것입니다. </li><li> 주입 바늘에 실리콘을 기음과 바늘의 내부 벽을 따라 코팅을 떠나 실리콘를 꺼냅니다. 실리콘 코팅 달리 내부 유리 모세관 벽에 충실 것 바늘 구멍을 통해 세포 및 바이러스의 통로를 극대화 할 수 있습니다. </li><li> (튜브에서 바늘을 제거) 직접 바늘 후 시점에서 luer 잠금을 설정 25 ¾ 게이지 혈액 컬렉션을 절단하여 멸균 플라스틱 튜브의 약 8cm 길이를 얻습니다. </li><li> 멸균 식염수에 1 ML 하위 Q 26 5/8-gauge 슬립 - 팁 주사기를 작성하고 주사기에서 바늘을 제거합니다. </li><li> 플라스틱 튜브의 절단 끝으로 주입 바늘을 부착하고 다른에서 luer 잠금에 주사기를 첨부끝. </li><li> 튜브 및 모세 혈관 주사 바늘에 죽은 공간, 제대로 된 누설없이 연결되어 있는지 확인 할 수있는 주사 바늘을 통해 꺼내기 식염수를 채우기 위해 멸균 생리를 대기음. 다음으로, 주입 바늘의 끝으로, 공기의 작은, 약 1 μl 금액을 대기음. 이것은 분사 유체에서 염분을 분리하고 수술시 주입 유체의 끝을 나타내는 시각적 큐를 제공합니다. 분사 장치는 수술 중 70 % 에탄올로 닦여 깨끗한 표면에 보관해야합니다. 또한 수술 중에 사용되는 모든 장비는 이미 사용을위한 무균 준비가 보관해야 주입 바늘의 예외, 이전과 70 %의 에탄올과 이후 모두 청소해야합니다. 이러한 바늘은 수술 후에 폐기하고 있지만, 다시 사용됩니다.되어야한다 </li><li> 마지막으로, 원하는 패키지 유전자 치료 바이러스 성 벡터 또는 줄기 세포를 포함하는 사출 솔루션을 기음. 이것은하여 수행 할 수 있습니다다음 멸균 세포 배양 접시의 표면에 솔루션을 pipetting, 살균 pipet 팁에 주입 솔루션을 차지. 이 솔루션은 이제 쉽게 주사기를 사용하여 주입 바늘로 흡입 할 수 있습니다. 필요한 금액은 마우스의 나이에 따라 달라집니다. 우리의 목적을 위해 우리는 분사 유체의 0.5-0.8 μl를 주입 될 수 후 산후 5 일 마우스를 사용합니다. 작은 금액, μl 0.5 이하, 젊은 쥐와 같은 1 μl와 같은 큰 금액에 대해 사용할 수는 성인 마우스에 사용할 수 있습니다. 세포의 바이러스 titer이나 번호가 주입되는 바이러스 / 세포와 원하는 대상 조직에 따라 결정되어야합니다, 작은 볼륨에서와 같이 너무 많은 바이러스 입자 나 세포는 망막 세포에 대한 독성을 초래할 수 있습니다. 동영상에서는, 시각화의 목적으로, 우리는 1.5 μl, 눈에 삽입하는 데 필요한보다 염료의 큰 금액을 사용했습니다. </li></ol> 2. Subretinal 공간에 접근하기 <ol><li> 무균 수술 방에,마우스의 나이에 따라 달라질 수 있습니다 로컬 승인 동물 처리 프로토콜에 따라 마우스를 안정화 또는 마취. 성인 마우스에 대한 일반적인 마취 isoflurane 가스 0.1 ml/10g 바디 케타민의 무게 (100 MG / ML)와 멸균 생리에 xylazine (20 MG / ML)의 내부 - 복막 분사의 사용이 포함되어 있습니다. perinatal 마우스의 경우 일반적인 마취 기술은 isoflurane 가스 나 cryoanesthesia (저체온증)의 사용을 포함합니다. 모든 마취 기술은 사용하기 전에 해당 지역의 IACUC위원회의 승인을 받아야합니다. 유사한 기술은 P0 또는 성인 마우스에 같은 어린애 마우스에 적용 할 수 있지만 우리는 일반적으로 (P) 후 산후 5 일 마우스를 사용합니다. 마우스가 다리와 더 이상 pinches을 발끝에 응답하지를 이동 중지 될 때까지 수술이 시작 수 없습니다. perinatal 마우스의 경우, 그들은 혈액의 흐름들이 완전히 마취하에 것을 알면, 다른 키를 느려지부터 색이 현저하게 가볍고 될 것입니다. </li><li> perinatal 쥐에 Vannas 바로 가위를 사용하여 m폐쇄 뚜껑 균열 (fissure)을 따라 피해는 대략 1.5 mm 절개. 눈이 자연스럽게 미래에 열립니다 들여 쓰기에서 컷을주의하십시오. 이 뚜껑은 치유와 마우스의 개발 기간 동안 제대로 열립니다 보장합니다. 우리는이 사람들이 절차를 수행하는 동안 눈을 펑 쳐링의 위험을 줄일 수 있기 때문에 Vannas 가위를 선호하지만, 수술 블레이드는이 목적을 위해 사용할 수 있습니다. 동영상에서 가위는 눈꺼풀 여백을 따라 직접 주사 및 절개에 사용되었습니다. 이 기술을 학습 할 때, 포셉은 절단하기 전에 눈꺼풀을 들고 눈을 손상의 위험을 줄이기 위해 사용되어야합니다. </li><li> 눈을 proptose하고 약간은 분사에 대한 proptosed 개최 할 수있는 눈 아래 눈꺼풀을 꼬집어보고 곡선의 드레스 집게로 눈꺼풀를 분열. 2 단계에서 만든 뚜껑 절개가 너무 큰 경우 눈 뚜껑 아래에서 실수로 주입 절차를 수행하는 동안 적절한 노출을 방지 할 수 있습니다. 박사와 함께 눈 주위에 약간의 압력을 가해 성인 마우스의 경우,포셉을 essing은 분사에 대한 proptosed 눈을 수용 할 수 있습니다. </li><li> 작은 scleral에서 절개 또는 15도 미세 블레이드로 표면을 긁는하여 전 세계의 적도에 후부하십시오. 이 절개은 주입 바늘의 끝을 통과 할 수 밖에 대형 있지만, 그 이상은 아니 커야합니다. 선호 경우, 해당 침술 바늘 같은 작은 날카로운 바늘 대신 미세 블레이드의 subretinal 공간에이 절개를 만들기 위해 사용할 수 있습니다. 어둡게 색소 동물에서 어두운 갈색 색소 조직 (맥락막 - 망막 안료 상피) 절개의 시점에서 볼 수있게됩니다. 가벼운 색소 나 흰둥이 쥐에서 수술 마킹 펜은 절개 사이트를 나타내는 잉크 자리를 떠날 미세 블레이드의 끝에 적용 할 수 있습니다. 절개 사이트에서 깨끗한 (유리) 유체 refluxes 경우, 블레이드는 너무 깊은 위치와 유리 캐비티 및 치료 바이러스 나 세포가 분사 동안 intravitreal 공간을 입력 할 수 있습니다를 입력했습니다. visualizati에 대한목적에, 우리는 동영상의이 시점에 절개를 만들었습니다. 그것은이 경우 subretinal 주입을 완료 볼 수 있습니다, 그러나 주입 유체의 존재로 인한 망막 초연은 완전히이 마우스에 치료를하지 않을 수 있습니다. 따라서주의를 주입하기 전에 만 바깥 쪽 눈의 표면이 아니라 망막을 통해 잘라로 이동합니다. </li><li> 조심스럽게 절개 사이트로 주입 바늘을 삽입하고 subretinal 공간을 입력 바깥 쪽 눈 벽에가 나란히 진출. 눈에서 바깥 쪽 벽에 너무 가까이거나 너무 깊이 발전하는 것은 잘못된 위치에 주사를 안내합니다. 바늘이 올바른 위치에 있는지 이해하는 가장 좋은 방법은 기술을 연습하는 것입니다. 가볍게 색소 나 흰둥이 쥐에서 연습하면 subretinal 공간으로 정밀하고 정확한 주사를 만들기 위해 도움이 될 수 있습니다. 바늘과 주입 유체이 눈에서 볼 수 있기 때문입니다. </li><li> 주사기 플런저에 빛 압력을 적용하고있을원하는 유체의 진 분사. 바늘이 제대로 subretinal 공간에 배치되어있는 경우, 중간 backpressure는 느낌이 될 것입니다. 바늘이 유리 내에있는 경우, 분사 동안 훨씬 적은 backpressure 잠재적으로 어떤 액체 환류가있을 것입니다. 중요한 backpressure가있는 경우, 천천히 바늘을 제거하기 전에 적어도 추가 15 초 동안 자리에 바늘을 누르고 있습니다. 이 높은 안구 압력이 절개 사이트으로 다시 주입 바이러스 나 세포를 refluxing 대신 평준화 할 수 있습니다. 공기와 염분의 일부는 주입 절차를 수행하는 동안 필요한 압력을 증가로 인해 subretinal 공간에 주입 할 수 있습니다. 주의는 눈에서 주입 된 바이러스 나 세포를 제거 할 수 있기 때문에 공기 나 호수가 이상 - 주입하지 않도록해야합니다. 이 subretinal 공간에 주입 너무 유체의 존재에서 영구 망막 분리를 일으킬 수도 있습니다. 시각화를 위해, 초과 염료 및 공기 INT 주입 된동영상에서 subretinal 공간을 O. 그것은 명확하게 기포가 subretinal 공간에 남아 유리에 사라지지 않는 방법도 너무 많이 주입 된 경우 염료의 일부가 subretinal 공간이 다시 밖으로 내보냈되는 방법을 볼 수 있지만 할 수 있습니다. 이것은이 주사는 눈의 정확한 위치 내의 모든 있다고 강조하는 데 사용 된, 그래서 하나는 바늘이 절개 사이트를 입력하는 방법을 시각화 할 수 있습니다. subretinal 공간으로 모든 주사는 주입 유체의 존재로 인해 일시적으로 망막 분리의 원인이됩니다. 분사 절차가 제대로 완료되면,이 임시 망막 분리는 더 실험에 사용할 수있는 24 시간과 쥐 이내에 치유됩니다. 눈 수술로 인해 약 1 주일 동안 부드러운 남아있을 수 있습니다, 두 번째 분사가 시간이 기간 동안 피해야한다 그래서. </li><li> 신생아 생쥐를 들어, 부드럽게 다시 뚜껑 뒤에와 궤도로 눈을 밀어 곡선 드레싱 포셉을 사용합니다. 그것은 유용 할 수 있습니다바이러스가 subretinal 공간 내에서 해결하고 부드럽게 궤도에 다시 눈을 밀어 때이 절개 사이트의 밖으로 내보냈 될 수 없습니다 수 있도록 잠깐만 기다리세요. 수술 후, 0.5 % bupivacaine 한 방울 (marcaine)은 주입 위치에 배치 할 수있는 25 게이지 바늘로 멸균 생리에서 0.25 %로 희석. 마우스 subretinal 수술 후 고통의 명백한 징후를 표시하지 않고 오랫동안 연기 화제 진통제로 bupivacaine의 사용은 이전 3 년 동안 충분한했습니다. 이러한 감염 등, 붓기, 또는 마우스의 통상적 인 일일 활동 감소, 마우스는 항상 고민의 흔적을 찾기 위해 수술 후 모니터링해야합니다. 이러한가 발생하면 수의사에게 통지해야하고 buprenorphine (0.05 밀리그램 / kg)와 같은 더 통증 약물은 intraperitoneal 주사로 제공 할 수 있습니다. </li><li> 로컬 승인 동물 처리 프로토콜에 따라 마취에서 마우스를 시작해보십시오. 마우스는 난방이 안된다에 보관해야합니다가 마취에서 깨어으로 광고가 정상적인 체온을 유지합니다. 수술 절차는 마취를 받아야하는 마우스에 대한 시간을 계산하지가 완료 될 때까지 5 분 정도 소요됩니다. 따라서, 가열 패드는 실제 절차를 수행하는 동안 필요하지 않습니다,하지만 절차는 오랜 기간 걸릴 수로 하나가 기술을 학습하는 동안 필요할 수 있습니다. 자체에 이동하기 시작했다 때까지 마우스는 깨끗한 새장에 다시 배치하지 않아야합니다. neonates를 들어, 부드러운 냄새가 pinches 완전히 마취에서 회복하기 위해 그들에게 도움이 될 것입니다, 그들은 엄마와 함께 다시 배치되기 전에 자신의 핑크 색상과 움직임을 회복해야합니다. 이전 목록으로 쥐들이 스트레스의 징후가 시간이 지남에 따라 모니터해야합니다. </li></ol>

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	<li>Abe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+retina+using+pigment+epithelial+cell+transplantation.">Regeneration of the retina using pigment epithelial cell transplantation.</a> Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 106, 778-803 (2002).</li><li>Jacobson, S. G., Cideciyan, A. V., Ratnakaram, R., Heon, E., Schwartz, S. B., Roman, A. J., Peden, M. C., Aleman, T. S., Boye, S. L., Sumaroka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+Leber+congenital+amaurosis+caused+by+RPE65+mutations:+safety+and+efficacy+in+15+children+and+adults+followed+up+to+3+years.">Gene therapy for Leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years.</a> Arch. Ophthalmol. 130, 9-24 (2011).</li><li>Schwartz, S. D., Hubschman, J. P., Heilwell, G., Franco-Cardenas, V., Pan, C. K., Ostrick, R. M., Mickunas, E., Gay, R., Klimanskaya, I., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration:+a+preliminary+report.">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379, 713-720 (2012).</li><li>Wang, N. K., Tosi, J., Kasanuki, J. M., Chou, C. L., Kong, J., Parmalee, N., Wert, K. J., Allikmets, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+reprogrammed+embryonic+stem+cells+improves+visual+function+in+a+mouse+model+for+retinitis+pigmentosa.">Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa.</a> Transplantation. 89, 911-919 (2010).</li><li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy.">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).</li><li>Tosi, J., Sancho-Pelluz, J., Davis, R. J., Hsu, C. W., Wolpert, K. V., Sengillo, J. D., Lin, C. S., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+expression+of+cDNA+and+shRNA+slows+degeneration+in+retinitis+pigmentosa.">Lentivirus-mediated expression of cDNA and shRNA slows degeneration in retinitis pigmentosa.</a> Exp. Biol. Med. 236, 1211-1217 (2011).</li><li>Tucker, B. A., Park, I. H., Qi, S. D., Klassen, H. J., Jiang, C., Yao, J., Redenti, S., Daley, G. Q., Young, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+adult+mouse+iPS+cell-derived+photoreceptor+precursors+restores+retinal+structure+and+function+in+degenerative+mice.">Transplantation of adult mouse iPS cell-derived photoreceptor precursors restores retinal structure and function in degenerative mice.</a> PLoS One. 6, e189992 (2011).</li><li>Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. , (2010).</li><li>Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+degeneration+mutants+in+the+mouse.">Retinal degeneration mutants in the mouse.</a> Vision Res. 42, 517-525 (2002).</li><li>Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+fundus+photography+and+angiography:+a+catalogue+of+normal+and+mutant+phenotypes.">Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes.</a> Mol. Vis. 5, 22 (1999).</li><li>Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+resources+for+vision+research.">Mouse model resources for vision research.</a> J. Ophthalmol. 2011, 391384 (2011).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

이 비디오 기술은 성공적으로 subretinal 주입 수술 절차를 완료하고, 유전자 치료 벡터 또는 줄기 세포가 효율적으로 안과 질환을 치료하는 데 필요한 위치에 배치됩니다 있도록에 대한 지침을 제공합니다. 이것을 세포의 주변에 유전자 치료 벡터 또는 줄기 세포 유래 조직을두고 있기 때문에이 기술은, 이러한 RPE 또는 photoreceptors과 같은 망막 세포의 타겟팅 할 수 있습니다. 이전 방법은 유체가 유?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> 목록 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 0.8-1.10 X 100mm 모세관 (유리) </td><td> 킴블 유리 주식회사 </td><td> 34,502 99 </td><td></td></tr><tr><td> / 브라운 Micropipette 풀러을 불타는 </td><td> 셔터 악기 </td><td> P-97 </td><td> Narishige microforge 대신 사용할 수 있습니다. 카탈로그 # MF-900 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> SL2-25ML </td><td> 실리콘 </td></tr><tr><td> Dubecco의 인산은 칼슘 염화물과 마그네슘 염화물과 식염 버퍼 </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 14040-133 </td><td></td></tr><tr><td> 안전 - 무사히 다녀 오게 25 3/4G X 12 &quot;, 혈액 컬렉션 세트 </td><td> BD Vacutainer </td><td> 367298 </td><td></td></tr><tr><td> 한 ML 하위 Q 265/8G 슬립 - 팁 주사기 </td><td> Becton - 디킨슨 </td><td> 309597 </td><td></td></tr><tr><td> 0.5-10 μl Finnpipette II 조정 - 볼륨 Pipetter </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-377-815 </td><td></td></tr><tr><td> 1-200 μl 자연 Beveled 팁 </td><td> 미국 과학 주식회사 </td><td> 1111년에서 1700년까지 </td><td></td></tr><tr><td> Discovery.V8 스테레오 현미경 </td><td> Zeiss </td><td> MC1500 </td><td></td></tr><tr><td> 60mm X 15mm 스타일 치료 폴리스티렌 세포 배양 접시 </td><td> 코닝 주식회사 </td><td> 430166 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas 스트레이트 가위 </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3383 S </td><td></td></tr><tr><td> 정교한 톱니 모양의 곡선 드레싱 포셉 </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1408 </td><td></td></tr><tr><td> 15도 미세 나이프 </td><td> Wils안과 주식회사에 </td><td> 091204 </td><td></td></tr><tr><td> 케타민 </td><td> Ketaset III </td><td> 나다 # 45-290 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> 로이드 연구소 </td><td> 나다 # 139-236 </td><td></td></tr><tr><td> Bupivacaine (Marcaine) </td><td> 아스트라 제 네 카 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Buprenorphine </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> B9275 </td><td></td></tr></tbody></table>

subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye

시력의 손실이 미국에서 약 3,400,000명에 영향을 미치는 향후 몇 년간 증가 할 것으로 예상된다. 최근 1 유전자 치료와 줄기 세포 transplantations는 망막 퇴행성 질환으로 인한 실명을 치료에 키 치료 도구가되었습니다. 이러한 홍채 색소 상피 세포 이식 등 연령 관련 황반 변성에 대한 autologous 이식의 여러 형태 (AMD)는 놀라운 결과를 생성하고, 인간의 임상 실험은 유전자와 줄기 세포 요법의 다른 형태에 시작했습니다.이 이는 RPE65 유전자 교환을 포함 Leber의 선천성 amaurosis과 Stargardt의 질병에 인간 배아 줄기 (ES) 세포를 사용하여 RPE 세포 이식 환자에서 치료. 3-4 이제 유전자 치료 벡터 및 망막 질환으로 환자를 치료에 사용할 수 줄기 세포가, 그걸 확인하는 것이 중요합니다 동물 모델에서 이러한 잠재적 인 치료 전에 적용인간의 연구에서 그들을 들죠. 마우스가 눈에 유전자 치료 벡터와 줄기 세포 이식의 치료 효능을 테스트하기위한 중요한 과학적 모델이되었습니다.이 동영상을 문서에 5-8, 우리는의 subretinal 공간으로 유전자 치료 벡터 또는 줄기 세포를 주입 할 수있는 기술을 제시 마우스 눈 주변 조직의 손상을 최소화하면서.

마우스 눈의 그림을 intravitreal와 subretinal 모두 주입 수술 절차 (화살촉, 그림 1)의 위치를 표시하는 화살표로, 참조 표시 주요 구조로 표시됩니다. 예를 lacZ lentiviral 벡터 (그림 2)와 같은 유전자 치료 벡터는 이러한 위치를 사용하여 주입 할 수 있습니다. 또한, 이러한 마우스 배아의 줄기 세포 (그림 3)과 같은 줄기 세포는 또한 마우스 눈이 사이트에 이식...

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Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

이 수술 기법은 마우스 눈의 subretinal 공간으로 유전자 치료 벡터와 줄기 세포의 주입을 보여줍니다.

마우스 눈에 유전자 치료 벡터와 줄기 세포의 Subretinal 주입

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

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Research

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Medicine

32.9K 조회수.  Columbia University. 이 수술 기법은 마우스 눈의 subretinal 공간으로 유전자 치료 벡터와 줄기 세포의 주입을 보여줍니다.

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High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a number of gene therapy clinical trials. More recently, a number of additional AAV serotypes have also been isolated, which have been shown to exhibit selective tissue-tropism in various small and large animal models1. Of the 10 most commonly used AAV serotypes, AAV3 is by far the least efficient in transducing cells and tissues in vitro as well as in vivo.
However, in our recently published studies, we have documented that AAV3 vectors transduce human liver cancer - hepatoblastoma (HB) and hepatocellular carcinoma (HCC) - cell lines extremely efficiently because AAV3 utilizes human hepatocyte growth factor receptor as a cellular co-receptor for binding and entry in these cells2,3.
In this article, we describe the steps required to achieve high-efficiency transduction of human liver cancer cells by recombinant AAV3 vectors carrying a reporter gene. The use of recombinant AAV3 vectors carrying a therapeutic gene may eventually lead to the potential gene therapy of liver cancers in humans.

In this article, we describe the identification of the adeno-associated virus serotype 3 (AAV3) as the most efficient vector for targeting human liver cancer cells.

재조합 Adeno - 관련 바이러스 혈청형 3 벡터에 의해 간암 세포의 고효율 전달

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

연구

의학

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

면역 결함 마우스의 확립과 인간 Retinoblastoma 종양의 전파

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive molecules contain an oxygen and include H2O2 (hydrogen peroxide), NO (nitric oxide), O2- (oxide anion), peroxynitrite (ONOO-), hydrochlorous acid (HOCl), and hydroxyl radical (OH-).
Oxidative species are produced not only under pathological situations (cancers, ischemic/reperfusion, neurologic and cardiovascular pathologies, infectious diseases, inflammatory diseases 1, autoimmune diseases 2, etc&hellip;) but also during physiological (non-pathological) situations such as cellular metabolism 3, 4. Indeed, ROS play important roles in many cellular signaling pathways (proliferation, cell activation 5, 6, migration 7 etc..). ROS can be detrimental (it is then referred to as "oxidative and nitrosative stress") when produced in high amounts in the intracellular compartments and cells generally respond to ROS by upregulating antioxidants such as superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione (GSH) that protects them by converting dangerous free radicals to harmless molecules (i.e. water). Vitamins C and E have also been described as ROS scavengers (antioxidants).
Free radicals are beneficial in low amounts 3. Macrophage and neutrophils-mediated immune responses involve the production and release of NO, which inhibits viruses, pathogens and tumor proliferation 8. NO also reacts with other ROS and thus, also has a role as a detoxifier (ROS scavenger). Finally NO acts on vessels to regulate blood flow which is important for the adaptation of muscle to prolonged exercise 9, 10. Several publications have also demonstrated that ROS are involved in insulin sensitivity 11, 12.
Numerous methods to evaluate ROS production are available. In this article we propose several simple, fast, and affordable assays; these assays have been validated by many publications and are routinely used to detect ROS or its effects in mammalian cells. While some of these assays detect multiple ROS, others detect only a single ROS.

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Here we propose simple methods to test and evaluate the presence of reactive oxygen species in cells.

암의 생산 및 반응 산소 종의 감지 (ROS)

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and acquired diseases. Apart from congenital or inherited abnormalities with the requirement for long-term expression of the delivered gene, several non-inherited perinatal conditions, where short-term gene expression or pharmacological intervention is sufficient to achieve therapeutic effects, are considered as potential future indications for this kind of approach. Candidate diseases for the application of short-term prenatal therapy could be the transient neonatal deficiency of surfactant protein B causing neonatal respiratory distress syndrome1,2 or hyperoxic injuries of the neonatal lung3. Candidate diseases for permanent therapeutic correction are Cystic Fibrosis (CF)4, genetic variants of surfactant deficiencies5 and &alpha;1-antitrypsin deficiency6.
Generally, an important advantage of prenatal gene therapy is the ability to start therapeutic intervention early in development, at or even prior to clinical manifestations in the patient, thus preventing irreparable damage to the individual. In addition, fetal organs have an increased cell proliferation rate as compared to adult organs, which could allow a more efficient gene or stem cell transfer into the fetus. Furthermore, in utero gene delivery is performed when the individual's immune system is not completely mature. Therefore, transplantation of heterologous cells or supplementation of a non-functional or absent protein with a correct version should not cause immune sensitization to the cell, vector or transgene product, which has recently been proven to be the case with both cellular and genetic therapies7.
In the present study, we investigated the potential to directly target the fetal trachea in a mouse model. This procedure is in use in larger animal models such as rabbits and sheep8, and even in a clinical setting9, but has to date not been performed before in a mouse model. When studying the potential of fetal gene therapy for genetic diseases such as CF, the mouse model is very useful as a first proof-of-concept because of the wide availability of different transgenic mouse strains, the well documented embryogenesis and fetal development, less stringent ethical regulations, short gestation and the large litter size.
Different access routes have been described to target the fetal rodent lung, including intra-amniotic injection10-12, (ultrasound-guided) intrapulmonary injection13,14 and intravenous administration into the yolk sac vessels15,16 or umbilical vein17. Our novel surgical procedure enables researchers to inject the agent of choice directly into the fetal mouse trachea which allows for a more efficient delivery to the airways than existing techniques18.

We developed a novel surgical approach for intratracheal administration of bioactive agents into the mouse fetus. The delivery route is more efficient in targeting the fetal mouse lungs than the commonly used intra-amniotic injection. This procedure has to date not been described in a mouse model.

태아 마우스 모델에서 Bioactive 에이전트의 Intratracheal 관리를위한 소설 외과 접근

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

나트륨 히알루 론산의 망막 주사 설치류에있는 망막 박리 모델

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability in industrialized countries. Replacement of degenerated photoreceptors by cell transplantation represents a possible treatment option in future clinical applications. Indeed, recent preclinical studies demonstrated that immature photoreceptors, isolated from the neonatal mouse retina at postnatal day 4, have the potential to integrate into the adult mouse retina following subretinal transplantation. Donor cells generated a mature photoreceptor morphology including inner and outer segments, a round cell body located at the outer nuclear layer, and synaptic terminals in close proximity to endogenous bipolar cells. Indeed, recent reports demonstrated that donor photoreceptors functionally integrate into the neural circuitry of host mice. For a future clinical application of such cell replacement approach, purified suspensions of the cells of choice have to be generated and placed at the correct position for proper integration into the eye. For the enrichment of photoreceptor precursors, sorting should be based on specific cell surface antigens to avoid genetic reporter modification of donor cells. Here we show magnetic-associated cell sorting (MACS) - enrichment of transplantable rod photoreceptor precursors isolated from the neonatal retina of photoreceptor-specific reporter mice based on the cell surface marker CD73. Incubation with anti-CD73 antibodies followed by micro-bead conjugated secondary antibodies allowed the enrichment of rod photoreceptor precursors by MACS to approximately 90%. In comparison to flow cytometry, MACS has the advantage that it can be easier applied to GMP standards and that high amounts of cells can be sorted in relative short time periods. Injection of enriched cell suspensions into the subretinal space of adult wild-type mice resulted in a 3-fold higher integration rate compared to unsorted cell suspensions.

Cell transplantation represents a strategy for the treatment of retinal degeneration characterized by photoreceptor loss. Here we describe a method for enrichment of transplantable photoreceptors and their subretinal grafting into adult mice.

성인 마우스 망막으로 MACS 정제 광수용체 전구체 세포의 감하 이식

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

서스펜션에 망막 색소 상피 세포를 제공하기 위해 설치류에서 망막 주사를 수행

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

췌장암 새로운 치료 전략을 개발하기위한 전지 특성 줄기 공부

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on animal models. The identification of PD-associated genes has led to the development of genetic PD models. Most transgenic &#945;-SYN mouse models develop gradual &#945;-SYN pathology but fail to display clear dopaminergic cell loss and dopamine-dependent behavioral deficits. This hurdle was overcome by direct targeting of the substantia nigra with viral vectors overexpressing PD-associated genes. Local gene delivery using viral vectors provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. Specific brain regions can be targeted (e.g. the substantia nigra), expression can be induced in the adult setting and high expression levels can be achieved. Further, different vector systems based on various viruses can be used. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based alpha-synuclein animal model for Parkinson&#39;s disease.

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson&#039;s Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson's disease.

재조합 아데노 - 관련 바이러스 성 벡터의 정위 주사를 통해 파킨슨 병에 대한 알파 - 시누 클레인 기반 쥐 모델 개발

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

토끼의 망막 수술에 대한 단계 프로토콜에 의해 단계

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...