저자는 우리의 데이터 분석을 위해 자신의 컴퓨팅 클러스터의 사용에 대한 어린이의 자비 병원 및 클리닉에서 박사 스티븐 Kingsmore 및 소아 게놈 의학 센터에 진심으로 감사드립니다, Illumina의 현장 서비스 팀 (엘리자베스 Boyer, 스콧 쿡과 마크 쿡) 및 기술 자신의 빠른 응답 및 차세대 DNA 시퀀싱 장비, HiScanSQ, 데이터 품질 분석의 실행에 대한 유용한 제안에 대한 컨설턴트 팀. 이 작품은 건강 기금 HL080042 (SQY까지) 국립 연구소에 의해 일부 지원과 어린이의 자비 병원과 클리닉의 시동 기금과 기금, 캔사스 시티의 미주리 대학 (SQY까지).되었습니다

<html> 이 프로토콜을 요약 순서도는 그림 1에 표시됩니다. 1. 트롬빈, RNA 분리, RNA의 품질 평가 및 정량화와 세포의 치료 <ol><li> 5% FBS, 성장 요인 및 항생제와 EGM-2 중간에 6 잘 접시에 90~100%의 합류로 문화 인간 폐 Microvascular 내피 세포 (HMVEC-LBl) (Lonza, 고양이 # CC-3202). </li><li> 기아 미디어 (0 % FBS) 이전 트롬빈 치료를 30 분에 미디어를 변경합니다. </li><li> 0.05 U / ML 트롬빈으로 세포를 치료하거나 ° C 5 % CO 2 37에서 6 시간에 대한 제어로 치료 둡니다. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 Ambion 미르 Vana 키트를 사용하여 처리 및 제어 세포로부터 총 RNA를 분리합니다. </li><li> Experion 자동 전기 영동 역 (에서 표준 프로토콜에 따라 Experion StdSense의 진핵 세포 RN​​A 칩과 RNA의 품질을 평가= &quot;_blank&quot;&gt; www.bio-rad.com). </li><li> 표준 분광 방법을 사용하여 RNA을 수량화. </li></ol> 2. 도서관 건축 장면 <ol><li> 자료를 시작으로 샘플 당 고품질의 총 RNA의 1 μg을 사용합니다. </li><li> 라이브러리를 구축하려면, Illumina (프로토콜 # 15008136 목사)에서 표준 절차를 수행하십시오. 이 프로토콜에서는 폴리의 두 발 (A)가 포함 된 mRNA의 선택은 rRNA 배열을 최소화하기 위해 rRNA를 제거하는 수행됩니다. </li><li> Experion 자동 전기 영동 역 (에서 표준 프로토콜에 따라 Experion의 DNA 1K 칩을 사용하여 라이브러리의 품질 평가 <a href="http://www.bio-rad.com" target="_blank">www.bio-rad.com을</a> ). </li><li> qPCR을 사용하여 라이브러리를 수량화 : 이전에 표준 곡선과 출혈도 잡았 어댑터에 대한 특정 프리 머으로 순서가 된 라이브러리를 사용합니다. 알 수없는 라이브러리 (예 : 1:100, 1:500 및 1:1,000)의 dilutions의 범위를 사용합니다. qPCR acco를 실행SyberGreen MM 프로토콜에 rding 각 도서관의 원래 주식 농도를 계산합니다. </li><li> 클러스터 흐름 셀을 할 준비가 될 때까지 -20 ° C에서 10 NM하고 저장할 라이브러리 주식을 희석. </li><li> 경우 클러스터 흐름 셀을 할 준비가 물 목욕에 cBot 시약 판을 해동. cBot은 클러스터 생성 과정을 간소화하는 데 사용 Illumina 악기입니다. </li><li> cBot 악기를 씻으십시오. </li><li> 라이브러리를 변성 : 튜브의 측면에 13 μl 1X TE 6 μl 10 μM 라이브러리 및을 조합 한 μl 1 N NaOH를 (Illumina에서 제공)를 추가합니다. 소용돌이, 스핀 다운 5 분 동안 실온에서 배양과 얼음의 변성 라이브러리를 배치합니다. </li><li> 라이브러리를 희석 : 12 PM의 최종 농도에 996 μl HT1과 4 μl 변성 라이브러리를 결합하여 사전에 차가운 하이브 리다이 제이션 버퍼로 변성 라이브러리 (HT1, Illumina에서 제공)을 희석. 얼음의 변성과 희석 라이브러리를 배치합니다. </li><li> , cBot 판의 튜브의 각 행을 반전모든 시약이 해동되어 있도록. 판 스핀 다운 / 펑크 호일 씰을 제거하고 cBot에로드합니다. </li><li> 스트립 관의 희석, 변성 도서관 나누어지는 120 μl는, 1-8이라는. 제어 스파이크 -에서와 같이 각 튜브에 1.2 μl 희석, 변성 PhiX 제어 라이브러리를 (Illumina에서) 추가합니다. 소용돌이와 튜브를 스핀 다운하고 올바른 방향으로 cBot (오른쪽 튜브 # 1)을로드합니다. </li><li> cBot로 흐름 셀 및 매니 폴드를로드합니다. </li><li> 흐름이 확인하고 클러스터링 실행을 시작 완료합니다. </li><li> 실행이 완료되면 모든 차선에서 시약 납품을 확인합니다. 모든 이상주의하십시오. 어느 4 ° C.에서 바로 시퀀싱 실행을 시작하거나 제공된 튜브에 흐름 세포를 저장 </li><li> 시퀀싱 별 합성 (SBS, Illumina) 시약을 해동. </li><li> 절단 믹스를 만진 후에는 다른 시약을 터치하지 않도록하고, 시약 트레이에 적절한 장소에 시약을로드합니다. </li><li> 더를 사용하여N-시퀀싱 흐름 셀 (즉, 이전에 순서가되었다 하나), 주요 시약 선 두 번. </li><li> 철저하게 70 % EtOH 및 렌즈 종이에 이어 70 % EtOH와 Kimwipes과 시퀀싱 흐름 세포를 청소하십시오. 모든 줄무늬의 흐름 셀을 검사합니다. 그 필요한 경우 다시 청소하십시오. </li><li> 시퀀서에 흐름 셀을로드하고 매니 폴드 및 흐름 세포 사이의 인감 꽉 있는지 확인 확인 흐름을 수행합니다. </li><li> 시퀀싱 실행을 시작합니다. </li><li> 사람들이 실행하는 동안 제공 될 품질 측정 항목을 (클러스터 밀도를 예를 들어, 필터를 통과 클러스터, 질문 30, 강도) 평가합니다. </li><li> 실행에 걸쳐 강도를 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 101 사이클이 완료되고 나면, 두 번째 읽기 완료 처리 화학을 수행 페어​​ 최종 시약 및 두 번째 읽기 설립 버퍼 (ICB, SBS 시약의 구성 요소, Illumina)를 해동 및 시약을로드합니다. </li><li> 제 2는 강도, 질문 30를 참조 평가, 순서 실행을 계속실행 진행 차 기타 품질 통계를 확인할 수 있습니다. </li></ol> 3. 데이터 분석 <ol><li> 각 샘플에 대해 하나의 fastq 파일의 생성을 보장하기 위해 0으로 fastq-클러스터 수를 설정. fastq 파일에 기본 통화 파일 (. BCL) 파일을 변환 할 수 CASAVA (Illumina, 현재 1.8.2)의 최신 버전을 사용 . 하류 분석을위한 fastq 파일의 압축을 풉니 다. </li><li> RNA-seq은 매우 높은 처리량 짧은 읽기 aligner (Bowtie, 0.12.7) 6 SAMtools을 (0.1 사용 포유류의 크기 genomes을 읽어 정렬 TopHat (1.4.1) 5의 최신 버전을 사용하여 쌍으로 최종 정렬을 수행합니다. 17) 7. SAMtools는 SAM 형식의 후 처리 정렬을위한 다양한 유틸리티를 구현합니다. 참조 인간 transcriptome는 iGenomes (에서 다운로드 할 수 있습니다 <a href="http://www.illumina.com" target="_blank">www.illumina.com</a> ). TopHat를 실행, 우리는 FR-unstranded (기본값)로 라이브러리 유형 옵션을 포함한 모든 기본 매개 변수 설정을 사용했습니다. </li><li> 우리8 소프트웨어 패키지 프로그램 CuffDiff, 커프스 단추의 일부를 (1.3.0) 들죠, 인간의 참조 transcriptome에 따라 이전에 differentially 표현 유전자 성적 증명서를 화면에 컨트롤 세포에 트롬빈 - 처리 세포를 비교합니다. 이 비교 알려진 성적 차등 표현을 감지합니다. 테이블 형태의 결과를 시각화하기 위해 Microsoft Excel을 사용합니다. 커프스 단추 프로그램을 실행에서, 우리는 모든 기본 매개 변수 설정을 사용했습니다. FPKM &lt;0.05 및 P&gt;있는 사람 유전자 성적은 0.05는 제외됩니다. </li><li> 소설 isoforms을 검색하려면, 참조 transcriptome없이 커프스 단추를 실행합니다. Cuffcompare를 사용하여 참조 게놈에 샘플 스크립트 파일을 비교 한 분석을위한 참조 게놈과 두 번째 분석을위한 참조 게놈으로 통합 제어 스크립트 파일로 결합 된 트롬빈 대본 파일을 사용 Cuffdiff으로 차등 표현을 테스트합니다. 표 형식의 결과를 시각화하기 위해 Microsoft Excel을 사용합니다. 다시 도스FPKM &lt;0.05 및 P&gt;과 전자 유전자 성적은 0.05는 제외됩니다. 이 단계 후, 조사관은 UCSC 게놈 브라우저 웹 사이트 (에 새로보고 된 성적 증명서의 목록을 업로드하도록 선택할 수 있습니다 <a href="http://genome.ucsc.edu/" target="_blank">http://genome.ucsc.edu/</a> 수동으로 검사하여 유효성을 확인하기 위해). </li><li> 독창성 경로 분석 (IPA에 differentially 표현 유전자의 목록을 제출 <a href="www.ingenuity.com" target="_blank">www.ingenuity.com</a> 트롬빈 치료에 의해 ​​영향을 유전자 및 경로의 특성을 위해). 이 단계에서, 수사관들이 CummeRbund (사용하도록 선택할 수 있습니다 <a href="http://compbio.mit.edu/cummeRbund/" target="_blank">http://compbio.mit.edu/cummeRbund/</a> 시각화, 관리 할 수 있도록), 커프스 단추 RNA-seq 출력을 분석하는 작업을 지원하고 단순화하도록 설계되었습니다 R 패키지를, 그리고 Cuffdiff 분석에 의해 생산의 모든 데이터를 통합 할 수 있습니다. </li></ol> 4. 수량 실시간 - 포에 의한 RNA-seq 결과의 유효성을 검사lymerase의 연쇄 반응 (qRT-PCR) <ol><li> 제어 및 트롬빈 - 처리 HMVEC - LBl 세포 RN​​A 품질 평가 및 1.6 단계 1.4에 설명 된 RNA의 정량화에서 총 RNA 격리를 수행합니다. </li><li> 제조업체의 지침 (Invitrogen, 18080-051)에 따라 윗 첨자 III 1 스트랜드 합성 시스템 RT 키트 각 샘플의 1 μg 총 RNA에서 DNA 보완를 생성 할 수 있습니다. </li><li> CUGBP, Elav-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor의 검출을위한 Taqman 분석 주문형 설계 oligonucleotides를 사용하여 응용 Biosystems ViiA 7 리얼 타임 PCR 시스템에 qRT-PCR 분석을 수행 - 관련 인자 1 (TRAF1, Hs01090170_m1) 및 β-고를 (ACTB, Hs99999903_m1). 각 샘플은 총 RNA의 5 NG에 해당 템플릿을했습니다. DDCt 방법을 사용 quantitation를 측정하고 β-고를를 정상화. 각 분석은 복제 적어도 세 생물학에 걸쳐 수행되었다. </li></ol>

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	<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).</li><li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+DNA+sequencing.">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li><li>Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat:+discovering+splice+junctions+with+RNA-Seq.">TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. 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G., Guttman, M., Trapnell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+methods+for+transcriptome+annotation+and+quantification+using+RNA-seq.">Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq.</a> Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).</li><li>Martin, J. A., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+transcriptome+assembly.">Next-generation transcriptome assembly.</a> Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

주요 단계 RNA 처리 : RNases는, 가장 높은 품질의 RNA를 저하됩니다 따라서 치료는 RNA (10)의 분리, 저장, 사용하는 동안주의해야합니다. 장갑은 항상 인간의 손에있는 RNases하여 오염을 방지하기 위해 착용하고 있습니다. 장갑은 특히 터치 피부, 문 손잡이 또는 기타 일반적인 표면 후, 자주 변경해야합니다. 피펫의 세트 작업을 RNA에 전적으로 헌신해야하고 모?...

<table border="1"><tbody><tr><td width="183"> 시약 및 장비 </td><td width="85"> 회사 </td><td width="185"> 카탈로그 번호 </td><td width="359"> 코멘트 </td></tr><tr><td> 인간 폐 Microvascular 내피 세포 </td><td> Lonza </td><td> CC-2815 </td><td></td></tr><tr><td> Lonza, 글 머리 기호 키트 </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td> EGM-2, FBS, 성장 요인 및 항생제를 포함 </td></tr><tr><td> 트롬빈 </td><td> 시그마 </td><td> T4393 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion 미르 Vana 키트 </td><td> 생명 기술 </td><td> 오전 1560 </td><td></td></tr><tr><td> RNase-해치 </td><td> 생명 기술 </td><td> AM9782 </td><td></td></tr><tr><td> Experion StdSens RNA </td><td> 바이오 RAD </td><td> 700-7103 </td><td></td></tr><tr><td> TruSeq RNA 준비키트 </td><td> Illumina </td><td> FC-122-1001 </td><td></td></tr><tr><td> AMPureXP 비즈 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> A63881 </td><td></td></tr><tr><td> 어깨 역 Transcriptase II </td><td> 생명 기술 </td><td> 18064-014 </td><td></td></tr><tr><td> Experion DNA의 1K </td><td> 바이오 RAD </td><td> 700-7107 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiTect SyberGreen </td><td> Qiagen </td><td> 204163 </td><td></td></tr><tr><td> PE 클러스터 생성 키트 </td><td> Illumina </td><td> PE-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> PhiX 제어 키트 </td><td> Illumina </td><td> FC110-301 </td><td></td></tr><tr><td> 200 사이클 SBS 키트 </td><td> Illumina </td><td> FC-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> HiScanSQ * </td><td> Illumina </td><td> SY-103-2001 </td><td></td></tr><tr><td> cBot </td><td> Illumina </td><td> SY-301-2002 </td><td></td></tr><tr><td> qPCR 기계 - Viia7 </td><td> 생명 기술 </td><td> 모델 # VIIA7 / 장비 # 10631261 </td><td> 또는 동급 </td></tr><tr><td> Experion 시스템 </td><td> 바이오 RAD </td><td> 7007001 </td><td> Bioanalyzer는 다른 시스템입니다 </td></tr><tr><td> 분광 광도계 </td><td> 바이오 테크 </td><td> 시대 Microplate 분광 </td><td> 또는 동급 </td></tr><tr><td> 원심 분리기 - Sorvall 전설 XTR </td><td> 열 과학 </td><td> 75004521 </td><td> 또는 동급 </td></tr><tr><td> 자기 스탠드 </td><td> 생명 기술 </td><td> AM10027 </td><td></td></tr><tr><td> thermocycler 96 - 웰 </td><td> 일반 실험실 공급 업체 </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 주요 시약 및 주요 E 표 3. 목록quipment. * 동영상에서는 대신 HiScanSQ의 HiSeq1000이 입증되었습니다. </td></tr></tbody></table>

rna-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells

mRNA 수준의 측정을 통해 세포의 유전자 발현의 특성은 세포의 전사 기계가 외부 신호 (예 : 약물 치료), 또는 어떻게 세포가 건강한 상태와 병에 걸린 상태 사이의 차이에 의해 영향을하는 방법을 결정하는 유용한 도구입니다. 차세대 DNA 시퀀싱 기술의 출현과 지속적인 개량을 통해 RNA-시퀀싱 (RNA-seq)는 성적 증명서의 모든 종류를 분류하기위한 모든 표현 유전자의 전사 구조를 파악하고 계량화 할 수 transcriptome 분석의 점점 인기있는 방법이되었다 주어진 셀, 조직 또는 유기체 1,2의 성적 증명서의 총 집합의 변화 표현 수준. RNA-seq은 점차 그 완전한 transcriptome를 프로파일의 장점을 가지고 있기 때문에, transcriptome 분석을위한 선호하는 방법으로 DNA의 microarrays를 대체하는 디지털 형 자료 (모든 증명서의 사본 번호)를 제공하고 알려진 게놈의 sequen에 의존하지 않습니다CE 3. 여기, 우리는 함께 또는 트롬빈 치료없이 인간의 폐 microvascular 내피 세포에 프로필 transcriptomes에 RNA-seq를 적용 할 수있는 완전하고 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 자격이 최근 출판 연구에 기초가 성공적으로 인간의 폐 microvascular 내피 세포의 첫 번째 전체 transcriptome 분석을 수행하는 4 &quot;RNA-seq은 트롬빈으로 치료 인간의 폐 Microvascular 내피 세포의 유전자와 Isoforms의 소설 Transcriptome를 보여&quot; 트롬빈은 RNA-seq을 사용하여 치료. 그것은 염증 조건, 암, 당뇨병, 관상 동맥 심장 질환의 pathogenesis에 트롬빈로 인한 내피 기능 장애의 근간이 분자 메커니즘에 통찰력을 얻기 위해 추가 실험을위한 전례없는 자원을 굴복, 이러한 질병에 대한 치료 타겟에 대한 잠재적 인 새 리드를 제공합니다. 이 프로토콜의 설명 텍스트네 부분으로 나누어 져 있습니다. 첫 번째 부분은 트롬빈과 RNA 분리, 품질 분석 및 정량화와 인간의 폐 microvascular 내피 세포의 치료에 대해 설명합니다. 두 번째 부분은 도서관 건설 및 시퀀싱에 대해 설명합니다. 세 번째 부분은 데이터 분석에 대해 설명합니다. 네 번째 부분은 RT-PCR 검증 분석을 설명합니다. 몇 가지 주요 단계를 대표 결과가 표시됩니다. 주요 단계에서의 성공을 높일 수 유용한 팁이나주의 사항은 토론 섹션에서 제공됩니다. 이 프로토콜은 트롬빈로 치료 인간의 폐 microvascular 내피 세포를 사용하지만, 그것은 포유류와 비 포유류의 세포 모두에서 서로 다른 자극이나 억제제, 또는 건강 상태 사이의 셀이나 조직에 transcriptomes를 비교로 치료 조직의 프로필 transcriptomes에 일반화 할 수 및 질병 상태.

1 단계의 경우 : 28s : 18의 비율은 전통적으로 RNA 저하의 지표로 사용됩니다. 이상적으로, 28s 피크는 18 밴드 (2의 비율)의 약 두 배 공간을 갖추고해야하지만이 이상적인 비율은 자주 연습에서 볼 수 없습니다. 또한, 28s : 분광 방법에서 얻은 18 비율은 RNA의 저하의 양을 과소 평가 할 수 있습니다. 보다 정확하게 저하, 따라서 RNA 샘플의 품질을 수량화하기 위해 Experion 시스템은 RNA 품질 표...

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RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

이 프로토콜은 다음과 같은 또는 트롬빈 치료없이 인간의 폐 microvascular 내피 세포의 프로필 transcriptomes에 RNA-seq, 강력한 차세대 DNA 시퀀싱 기술을 적용 할 완전하고 자세한 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 다른 시약 또는 질병 상태에 의해 영향을 다양한 세포 나 조직에 generalizable 수 있습니다.

RNA-seq의 트롬빈 - 처리의 Transcriptomes 분석 및 제어 인간 폐 Microvascular 내피 세포

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

rna-seq-analysis-transcriptomes-thrombin-treated-control-human

Research

JoVE Journal

Biology

21.8K 조회수.  Children's Mercy Hospital and Clinics, School of Medicine, University of Missouri-Kansas City. 이 프로토콜은 다음과 같은 또는 트롬빈 치료없이 인간의 폐 microvascular 내피 세포의 프로필 transcriptomes에 RNA-seq, 강력한 차세대 DNA 시퀀싱 기술을 적용 할 완전하고 자세한 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 다른 시약 또는 질병 상태에 의해 영향을 다양한 세포 나 조직에 generalizable 수 있습니다.

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Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

인간 제대 베인 내피 세포의 절연 (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

연구

생물학

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

신생아 마우스의 폐 내피 세포의 분리 및 문화

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks in vivo. In this regard, the search for experimental models to build blood vessel networks in vivo is of utmost importance 1. The feasibility of bioengineering microvascular networks in vivo was first shown using human tissue-derived mature endothelial cells (ECs) 2-4; however, such autologous endothelial cells present problems for wide clinical use, because they are difficult to obtain in sufficient quantities and require harvesting from existing vasculature. These limitations have instigated the search for other sources of ECs. The identification of endothelial colony-forming cells (ECFCs) in blood presented an opportunity to non-invasively obtain ECs 5-7. We and other authors have shown that adult and cord blood-derived ECFCs have the capacity to form functional vascular networks in vivo 7-11. Importantly, these studies have also shown that to obtain stable and durable vascular networks, ECFCs require co-implantation with perivascular cells. The assay we describe here illustrates this concept: we show how human cord blood-derived ECFCs can be combined with bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) as a single cell suspension in a collagen/fibronectin/fibrinogen gel to form a functional human vascular network within 7 days after implantation into an immunodeficient mouse. The presence of human ECFC-lined lumens containing host erythrocytes can be seen throughout the implants indicating not only the formation (de novo) of a vascular network, but also the development of functional anastomoses with the host circulatory system. This murine model of bioengineered human vascular network is ideally suited for studies on the cellular and molecular mechanisms of human vascular network formation and for the development of strategies to vascularize engineered tissues.

Here, we describe a methodology to deliver human cord blood-derived endothelial colony-forming cells (ECFCs) and bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs), embedded in a collagen/fibronectin gel, subcutaneously into immunodeficient mice. This cell/gel combination generates a human vascular network that connects with the mouse vasculature.

Immunodeficient 마우스의 생체 공학 인간 Microvascular 네트워크

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

에어 리퀴드 인터페이스에서 인간의 비강 상피 세포의 배양

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

마우스 저항 동맥의 미세 혈관 내피 튜브의 분리

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

제브라 피쉬 배아에서 산화 스트레스의 분석

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

쥐과 밸브 내피 세포의 분리

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

본래 동맥의 내피 층에서 산화 질소와 활성 산소의 욕실 얼굴 인식

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

고해상도 시간 경과 이미징 및 생활 인간 제대 정맥 내피 세포의 미세 소관 역학의 자동 분석

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We present a protocol to study human endothelial-pericyte interactions in mouse using a variation of the matrix gel plug angiogenesis assay.