이 방법은 시험관내 폐암 세포에서 2개의 microRNA의 활동을 확인하는 데 필요한 실험실 기술을 이해하고 수행하는 데 도움이 될 것입니다. 폐암은 전 세계적으로 암 관련 사망의 주요 원인입니다. 여기서는 기본 실험실 방법론에서 부터 유전자 발현 분석 및 항체 단백질 microRNA와 같은 보다 복잡한 프로토콜에 이르는 기술을 제시하며, 특히 microRNA의 작용의 효과를 식별하는 데 사용됩니다.
다음 방법은 폐암 세포에서 세포 주기를 조절에 2 개의 microRNAs, microRNA 143 및 microRNA 506의 효력에 관하여 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 것입니다. 우리는 세포 전환, RNA 추출, 정량적 실시간 PCR 및 microRNA 분석과 같은 다른 실험실 기술을 제시합니다. 프레젠테이션이 이러한 분석을 성공적으로 완료하는 데 기여하기를 바랍니다.
첫째, 배양된 세포를 RNA 및 단백질 추출에 충분한 적절한 플라스크에 앉히고, qPCR 또는 마이크로 어레이 분석을 사용하여 유전자 발현을 수행한다. 그런 다음 10 % FBS와 1 % 페니실린 연쇄 절제술로 보충 된 미디어로 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날, 각각 100 나노몰라의 농도로 미디어에서 마이크로RNA 143 및 microRNA 506을 희석하여 트랜스페션을 위한 microRNA 샘플을 준비한다.
인큐베이터에서 플라스크를 꺼내 미디어를 제거합니다. 1x PBS로 씻으시다. 처리되지 않은 모든 컨트롤에는 셀이 있는 불완전한 미디어만 포함됩니다.
인큐베이터에서 6시간 동안 형질전환 매체로 세포를 배양한다. 6시간 후 미디어를 제거하고 4밀리리터의 신선하고 완전한 미디어로 교체하십시오. 트립시화에 의해 24 시간 48 시간 후에 세포를 수확하십시오.
다음으로 각 튜브에 1x PBS로 두 번 세척하고 상복부을 제거합니다. 나중에 RNA 추출을 수행하기 위해, 영하 80도에서 세포를 동결. RNA 추출은 RNA 키트를 사용하여 수행되었으며, 제조업체의 지시에 따라 수행되었다.
첫째, 영하 80도에서 튜브를 제거하고 해동할 수 있습니다. 300 마이크로리터의 분해 완충제와 파이펫을 위아래로 추가하여 세포막을 분해합니다. 100% 초순수 에탄올의 동일한 볼륨을 추가합니다.
그런 다음 잘 섞어서 분리된 열에 놓습니다. 원심 분리기를 제거하고 흐름을 제거합니다. 버퍼를 제거하기 위해 400 마이크로리터의 세척 및 버퍼 및 원심분리기를 추가합니다.
각 샘플에 75 마이크로리터 VNA 소화 버퍼와 DNAse 1의 마이크로리터 5개를 추가하고 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 400 마이크로 리터 RNA 준비 버퍼로 샘플을 세척하십시오. 다음으로 RNA 세척 버퍼로 두 번 씻으시다.
지금, 열에 핵이없는 물을 추가, 원심 분리기 다음 RNA를 수집. RNA 농도를 측정합니다. 이 단계에서는 RNA 시퀀싱을 위해 2마이크로그램의 RNA 샘플을 전송할 수 있다.
열사이클러를 사용하여 텍스트 섹션에 설명된 프로토콜에 따라 cDNA를 준비합니다. DNAse RNA가 없는 물로 앞으로 준비하고 10 마이크로몰러의 농도로 방향을 바울 수 있습니다. 샘플 수에 따라 검출될 각 유전자에 대한 마스터 믹스를 준비한다.
각 cDNA 샘플에 대해, 반응 량은 텍스트에 기재된 표에 따른것이다. 각 샘플을 각 우물에 놓습니다. qPCR의 경우 샘플을 추적하기 위해 96 개의 웰 플레이트 레이아웃으로 Excel 문서를 준비하는 것이 좋습니다.
각 샘플 및 분석 된 유전자에 대해, 삼중, 또는 적어도 중복에 자신의 반응을 수행. 투명하고 광학적으로 투명한 플라스틱 실러로 플라스틱 플레이트를 밀봉하십시오. 이것은 거짓 신호를 생성 할 수 있기 때문에 손가락으로 얇고 플라스틱 층을 만지지 마십시오.
모든 시약을 우물 바닥에 섞기 위해 플레이트를 빠르게 회전시합니다. 다음으로, 정량적 실시간 PCR 기계를 사용하여 샘플 플레이트를 실행합니다. qPCR 기계에서 생성된 CT 값을 얻고 상대적인 유전자 발현을 분석합니다.
이 비디오의 이전 섹션에 설명된 바와 같이 세포를 변형시. 트립시니화를 위해 각 샘플에서 15 밀리리터 멸균 튜브에서 세포를 수확합니다. 다음으로, 세포를 1x PBS로 두 번 씻고, 751G에서 원심분리를 5분 동안 세척한 다음, 상퍼를 제거합니다.
파이펫을 통해 200 마이크로 리터 얼음 차가운 1 x PBS를 추가하여 팔레트를 다시 일시 중단하고 깨집니다. 튜브를 부드럽게 돌리면서 튜브를 부드럽게 돌리면서 70%의 얼음 차가운 에탄올 2밀리리터를 튜브에 넣고 튜브를 부드럽게 돌립니다. 실내 온도에서 30 분 동안 튜브를 인큐베이션하고 1 시간 동안 섭씨 4도에 배치하십시오.
4섭씨와 원심분리기에서 튜브를 제거합니다. 2ml의 얼음 차가운 PBS와 소용돌이를 추가한 다음 원심분리로 상체를 제거합니다. 프로피듐 요오드와 리보누칼리스 A를 포함하는 1x PBS의 500 마이크로리터를 각각 각 샘플에 밀리리터당 50 및 200 마이크로그램을 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
샘플을 적절한 튜브로 옮기고 빛으로부터 보호하고 유동 세포계에서 실행합니다. 본 실험은 microRNA 치료에 의해 변화된 모든 세포 주기 통로 단백질의 발현을 확인하는 것이다. 경질 단면도에 기술된 절차에 따라 단백질 샘플을 수집하고 BCA 분석으로 정량화한다.
실온에 가지고 수분을 제거하기 위해 실험 1 시간 전에 영하 4도에서 슬라이드를 제거합니다. 단백질 샘플 70마이크로그램을 취하고 제조업체의 지침에 따라 샘플 슬라이드를 준비하며, 이는 텍스트 섹션에서 단계별로 설명됩니다. 여기에 주의, 매우 순수한 deionized 물로 슬라이드의 적절한 세척은 슬라이드의 배경을 줄이는 데 도움이 될 것입니다으로, 또 다른 중요한 단계입니다.
또한 이 실험에서는 최종 단계까지 샘플 슬라이드를 건조시키지 않는 것이 매우 중요합니다. 마지막으로 마이크로 어레이 머신을 사용하여 슬라이드를 스캔하고 데이터를 분석합니다. 마이크로RNA 처리 된 샘플의 qPCR 분석은 CDK1, CDK4 및 CDK6의 유전자 발현을 결정하기 위해 일어났다.
이 유전자는 정상 및 암세포의 세포 주기를 조절하고 종양 진행을 억제하기위한 수단으로 표적으로 삼았습니다. 데이터는 microRNA 143 및 506를 가진 처리 때문에 이 유전자의 다운규제 효력을 보여주었습니다. 유동 세포측정에서 세포주기 분포 데이터는 G0 및 G1 단계의 인구 증가를 입증하고, microRNA 143 및 506의 편협 처리의 효과로 인해 S 상에서 인구 감소를 입증했다.
세포 주기의 특정 마이크로 어레이 분석은 대략 60개의 유전자의 단백질 발현 변경을 검출했습니다. 대표열지도는 CDK2, Helen 1 및 3, RE2F1과 같은 세포 주기 및 증식의 진행에 필요한 다중 유전자의 단백질 수준에서 하향 조절을 나타냈다. 대조적으로, 그들의 성장한 억제 효력에 의해 일반적으로 인식되는 단백질은 강화조정되었습니다.
결과는 반정적이며 추가 분석이 필요하지만 마이크로 어레이 분석은 경로의 활동에 대한 간략한 개요를 제공합니다. 우리는 이 비디오를 본 후에 세포에서 microRNA 활동의 식별에 도움이 될 것입니다 근본적인, 뿐만 아니라 복잡한, 실험실 실험을 수행 할 수있을 것입니다 믿습니다.
