작성자는 사진과 음성을 통해 비디오의 사후 생산 다나 Kamalidenova, 모건 Autexier, 그리고 Roch Chopier, 비디오 및 애니메이션을 제작뿐만 아니라, 플로리안 벡 감사드립니다. 이 작품은 올림푸스에서 후원하는 HFSPO (경력 개발 상), ANR (프로그램 Jeunes chercheurs 및 프로그램 블랑 Neurosciences), FRC (연방 뿌린 라 공들인 쉬르 르 Cerveau), INSERM과 라 Pitié Salpêtrière 병원 (병진 연구에서 보조금에 의해 지원되었다 JS로 NR로 계약), 프랑스어 연구 성과 독일 Forschungsgemeinschaft postdoc 휄로 십에서 UP, 그리고 박사 학교 &quot;생명 과학의 프론티어&quot;에서까지, 파리 Diderot 대학, B​​ettencourt Schuller 기초하고, FRM (Fondation 뿌린 라 공들인 Médicale) 박사 친목

1. 인공 뇌척수 및 세포 솔루션의 준비 <ol><li> 실험을 시작하기 전에, 하나는 패치 클램프 녹음뿐만 아니라 해마 준비를위한 인공 뇌척수 (ACSF)에 대한 내부 솔루션을 준비해야합니다. 유리 가스 발생 장치 (마이크로 필터 촛불, ROBU 독일) 및 조직 그리드 (모기 그물이나 나일론 꼭), 당신은 또한 외과 가위, 고급 홍채 가위, 두 spatulas와 포셉 (정밀 과학 도구)로 구성된 분해 키트가 필요합니다 뿐만 아니라 superglue (Uhu 덴트). 전기 생리학 슬라이스 패치 설치의 구성 Finkel &amp; 닐, 2001 년 1 설명했다. </li><li> 내부 솔루션 (MM)을 용해 : 105 K-글루 콘산, 30 KCl, 탈 이온수 10 HEPES 및 0.3 EGTA (최종 볼륨 70-80%에서). 4 ° C에 솔루션을 시원하고 (MM)을 추가 : 4 ATP-MG, 0.3 GTP-트리스 10 phosphocreatine. 코와 채우기 U와 함께 7.4으로 pH를 조정최종 볼륨에 탈 이온수와 P. (Osmolaritiy : ~ 280 mOsm). 이 솔루션 (기공 크기 0.2 μm)를 필터링 할 수 있습니다. Aliquoted 솔루션에 3~4주에 대한 안정 - 20 ° C. 한 실험 일 경우, 내부 솔루션의 ~ 1 ML이 필요합니다. </li><li> 별도로 명시되지 않는 한, CA1 지역에서 해마의 준비와 세포의 녹음에 사용되는 ACSF은 (MM)을 포함하고 : 119 NaCl, 2.5 KCl, 2.5 CaCl 2, 1.3 MgSO 4, 아니 2 PO 4, 26.2 NaHCO 3, 11 포도당. carbogen (95% O 2 5 % CO 2)에 - 적어도 10 분 (7.4 산도 ~ 7.3)를위한 탈 이온수 (Osmolarity ~ 320 mOsm)과 산소를이 솔루션에서 이러한 염을 분해. 실험 당 솔루션의 이상 1리터를 준비합니다. 특히주의 해마의 CA3 영역에서 실험을 수행하는 데 사용됩니다 hippocampal 조직의 준비를 위해주의해야한다. 사실,이 지역은 활동과 이후 neuronal 죽음을 epileptiform하는 경향이 있습니다. 따라서 synapt87 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl 2, 7 MgCl 2, 1 아냐 2 PO 4 : 포함 된 얼음처럼 차가운 자당 솔루션에서 해마의 절개를 (MM)를 수행하여 IC 활동이 강력하게 슬라이스 준비하는 동안 감소해야하고, 이것은 달성 , 25 NaHCO 3, 10 혈당 75 자당. 이 솔루션에서, 낮은 나트륨, 낮은 칼슘, 높은 마그네슘 농도의 조합은 대량 따라서 자연 활동과 세포 사망을 최소화 presynaptic 발사 및 출시 확률뿐만 아니라, postsynaptic 수용체 NMDA 활동을 줄일 수 있습니다. CA3 지역에서 세포의 녹음에 사용되면 준비, hippocampal 슬라이스는 polysynaptic 활동을 최소화하기 위해 4 MM CaCl 2, MgSO 4 4, 포함 수정 ACSF와 perfused 있습니다. </li></ol> 2. 급성 Hippocampal 슬라이스 준비 <ol><li> 지속적으로 oxygenating 동안 ~ 300 썰기 챔버에 대한 ACSF의 ML뿐만 아니라, 4 ° C에서 준비 다운 쿨carbogen. 또한 carbogen (구성표 그림 1)과 산소를합니다 슬라이스 스토리지, 동안 실온 (RT)에 ACSF에 작은 비커를 준비합니다. </li><li> 케이지에 추가됩니다 한 ML의 isoflurane로 적셔 작은 종이 타월로 후드 아래에 마우스를 마취. </li><li> 마우스를 깊이 anesthetized되면​​ 머리를 잘라서 얼음처럼 차가운 산소를 ACSF과 함께 작은 그릇에 직접 추가 할 수 있습니다. 작은 가위로 두피를 제거하고 다음 단계에 조직 위에 머리를 전송할 수 있습니다. 그림과 그림 1에 설명 된대로, 해마를 해부하기 시작합니다. </li><li> 얼음처럼 차가워에서 저속 (3 μm / 초) 70 Hz의 진동 주파수에서 300-400 μm 두께의 가로 조각을 잘라 ACSF을 산소 및 저장 칸으로도 양도 할 수 없습니다. 최소 1 시간 전에 녹화 RT의 조각을 방치 했죠. CA3 실험에 대한 슬라이스는 34 ° C에서 25 분을 저장하고 RT 적어도 30 분은 썰기 과정에서 복구 할 수 있습니다. </li></좋았어요&gt; 3. Evoked Astroglial 전류와 Neuronal 필드 후보들의 듀얼 녹화 우리는 여기서 세포 전극을 사용하여 afference의 자극을 통해 시냅스 활성에 의해 유도 astroglial와 neuronal 반응, 즉 반응을 synaptically-evoked 기록하는 방법에 대해 설명합니다. <ol><li> 지속적으로 흥분성의 반응을 분리하기 위해 100 μM의 picrotoxin을 (GABA 길항제) 포함 산소 ACSF (1.5-2 ML / 분, RT)으로 녹음 챔버를 perfuse. 폴리-L-라이신 (1.5-3 MG / ML) 코팅 coverslip에 조각을 전송, 좋은 슬라이스 접착력을 달성하기 위해 액체를 담그고하며 슬라이스 위에 ASCF 한 방울을 추가합니다. 녹음 챔버에 coverslip를 놓습니다. picrotoxin에 의한 억제 전송 봉쇄는 epileptiform 활동에 evoked 이벤트의 측정을 왜곡 할 neuronal 인구의 예 자연, 동기 사격을 발생할 수 있습니다. 따라서, epileptiform 활동을 방지하기 위해,을CA1과 CA3 지역 사이의 평면 절단 (표면 만)은 Schaffer 민간인 피해 (그림 2A에 표시된)를 통해 전파되지 않도록 할 수 있습니다. </li><li> 지층 radiatum의 astrocytes들은 작은 소마 크기 (~ 10 μm)와 별 모양의 프로세스 어셈블리로 식별 할 수 있습니다. 적어도 20-30 μm 슬라이스 표면 아래 셀을 선택합니다. 자극 격리 상자에 연결되어 목욕탕 (단순히 유리 피펫 주위에 두 번째 실버 와이어를 배치하여)에 접지되어있는 은색 선에 유리 자극 전극 (팁 저항 MΩ ~ 1) 탑재합니다. Schaffer의 담보 지역에 자극 전극을 놓고, 같은 거리에 선택한 astrocyte 200-300 μm의 거리에서 그림 2A에 표시된. 앰프의 headstage에 연결된 염화 실버 와이어로 필드 레코딩 전극 (MΩ ~ 2-5) 탑재합니다. 두 전극은 ACSF과 전에 채워집니다. 외부 COM을 사용할 수 없게 나는 = 0 모드를 multiclamp에서 선택mand 입력 및 ~ 50 μm 떨어진 지층 radiatum 지역 (그림 2A)로 astrocyte의 전극을 배치합니다. 게인 2-10과 2 kHz에서 베셀 필터 필터와 응답을 기록합니다. 뇌 슬라이스로 전류 주입은 presynaptic 터미널에서 주변 Schaffer의 부수적 인 axons와 후속 송신기 릴리스에서 작업 잠재력을 실행 해당 프로젝트 postsynaptic CA1 피라미드 뉴런합니다. 출시 송신기는 작은 부정적인 잠재적으로 extracellularly 측정합니다 postsynaptic ionotropic 수용체를 통해 세포에 긍정적 인 충전 흐름을, 실행됩니다. 억제 전송이 pharmacologically 차단되는 동안이 필드는 흥분성의 postsynaptic 잠재력 (fEPSP)는 동시에 활성화 뉴런의 그룹의 활동을 통합합니다. fEPSP를 그대로 보여주고하려면 몇 가지 테스트 펄스를 (0.1 밀리 초 시간)를 적용하고, 자극 전극의 일부 재배치는 fEPSP를 높이는 데 도움이 있습니다. 전형적인 CA1 지층 radiat음 ... fEPSP는 그림 2B에 도시된다. 위치 및 응답 파형에 대한 자세한 내용은 원 외에서 찾을 수 있습니다. 2,003 2. 건강한 hippocampal 슬라이스의 fEPSP 진폭은 일반적으로 섬유 발리의 진폭보다 두 배나 큰 이상이어야합니다. fEPSP 진폭 또는 기울기의 정확한 정량화를 들어, evoked reponse는 polysynaptic 활동으로 (다중 피크 응답으로 감지) 시냅스 활동이 hyperexcitability에 표시 될 수있는 전기 자극의 독립을 나타냅니다 monosynaptic해야합니다. 그림 3C에 도시 된 바와 같이 해마의 CA3 영역에서 수행 실험 자극 및 녹화 피펫이 위치하고 있습니다. 분명 몇 초 동안 이끼 섬유 강력하게 촉진 아르 입력, 쌍 - 펄스 자극 (50 밀리 초 interpulse 간격) 및 1 Hz에서의 자극을 식별하려면 매우 fEPSP responses.At에게 끝을 evoked 처음 낮은 진폭을 강화하기 위해 적용되는실험 DCGIV, mGluR2 / 3 수용체 길항제는 더 이상 참 이끼 섬유 입력이 자극되어 있는지 확인하기로 세탁 할 수의. 이 길항제의 응용 프로그램 mGluR2 / 3 수용체, 이끼 섬유 boutons에서 억제 presynaptic 릴리스의 높은 표현으로 인해 ~ 90 %로 fEPSP을 감소해야합니다. </li><li> 필터링 내부 솔루션과 패치 피펫을 (MΩ ~ 2-5)를 입력하고 두 번째 headstage에 연결된 염화 실버 와이어로를 탑재하여 피펫 홀더에 튜브를 통해 연결되어있는 주사기와 긍정적 인 압력을 적용 할 수 있습니다. 지속적으로 10 mV의 20 밀리 초 테스트 펄스를 적용하고 세포 표면에 도달하고 막에 편향이 표시 될 때까지 조직에 피펫 이동합니다. 오프셋 피펫을 제로, 긍정적 인 압력을 제거하고에 막 클램프 - 80 뮤직 비디오. gigaseal (최소 1 GΩ) (그 몇 초보다 더 오래 걸릴하지 않아야 함)에 도달 할 때까지 기다립니다. 일부 부정적인 압력을 부드럽게 응용 프로그램은 AG에 도달하는 데 도움이 될igaseal. 세포에 침입하는 것은 부정적인 압력의 짧은 응용 프로그램에 의해 달성 multiclamp에서 적의 공격 기능을 사용하고 있습니다. fEPSP 및 전압 클램프의 astroglial 응답을 (-, 주파수 0.1 Hz에서, 베셀 필터 2 kHz에서, 게인 10 80 뮤직 비디오 Vhold) evoked Schaffer의 담보의 동시 녹음을 시작합니다. 당신이 인접 피라미드 세포에 의해 생성 된 fEPSPs을 반영, 빠른 과도 외부 전류를 볼 수 있습니다 첫째 : astroglial 현재 반응은 biphasic입니다. 이것은 천천히 상승 썩어 가고있는 내향 전류 (neuronal 반응이 종료 된 후에도 지속 몇 초 (&gt; 10 초))을합니다. 이 전류는 depolarized postsynaptic 터미널 주변의 출시에 따라, astrocytes에 칼륨 항목 주로 때문입니다. presynaptic glutamate 자료에 의해 트리거 전류를 동시에 활성화 빠른 과도 glutamate의 전송 (GLT)은 칼륨 전류에 의해 마스크됩니다. astrocyte뿐만 아니라 패치의 액세스 저항의 개최 가능성은 MO해야실험을하는 동안 nitored 및 녹화 조건의 변화로 인해 astroglial reponses의 부정확 한 모니터링을 방지하기 위해, ~ 20 % 이상을 변경할 수 없습니다. 초기 지주 가능성&gt; -70 뮤직 비디오 만 astrocytes는 건강한 세포를 연구 조사해야합니다. </li><li> evoked astrocytic 막 탈분극을 기록하기 위해 전압에서 전류 클램프로 전환합니다. fEPSP이 완전히 차단되고 GLT 진폭이 대지에 도달 할 때까지, ionotropic의 glutamate 수용체 차단 kynurenic 산 (5 ㎜)의 재관류에 의해 glial glutamate의 전송 (GLT)는 현재 분리합니다. 명확하게 GLT 전류를 확인하려면 특정 길항제 DL-threo-β-Benzyloxyaspartatic 산 (DL-TBOA, 200 μM)를 적용 할 수 있습니다. 다른 시냅스 강도에 neuronal 및 astroglial 반응을 기록, 페어링 된 펄스 자극에 대한 응답을 조사하는 두 밀접하게 이격 된 자극을 (50 밀리 초 간격) 적용하기 위해 5 배에서 2 배하여 자극의 강도를 높입니다. 시리즈 R의 안정성glial 세포의 esistance와 막 잠재력은 녹​​화 내내 모니터링해야합니다. </li><li> 갭 접합의 범위는 astroglial 네트워크를 중재 시각화하기 위해 염료 커플 링 실험 등 sulforhodamine-B의 낮은 분자 염료 (&lt;1.5 kDa)의 수동적 확산을 사용하려면, 모든 현재 분사하지 않고, 현재 클램프 모드에서 수행해야 간격 접합 채널을 통해. 주변 조직에 염료가 모자라 방송을 최소화하기 위해, 조직을 입력 만하면 긍정적 인 압력이 패치 피펫을 통해 적용해야하고 패치는 가능한 한 빨리 도달해야합니다. </li></ol>

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	<li>Finkel, A., Bookman, R., Crawley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+6+The+electrophysiology+setup.">Chapter 6 The electrophysiology setup.</a> Current protocols in neuroscience. , (2001).</li><li>Yuan, Y. A., Atchison, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elelctrophysiological+studies+of+neurotoxicants+on+central+synaptic+transmission+in+acutely+isolated+brain+slices.">Elelctrophysiological studies of neurotoxicants on central synaptic transmission in acutely isolated brain slices.</a> Current Protocols in Toxicology. , (2003).</li><li>Bergles, D. E., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activation+of+glutamate+transporters+in+hippocampal+astrocytes.">Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes.</a> Neuron. 19, 1297-1308 (1997).</li><li>Diamond, J. S., Bergles, D. E., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+release+monitored+with+astrocyte+transporter+currents+during+LTP.">Glutamate release monitored with astrocyte transporter currents during LTP.</a> Neuron. 21, 425-433 (1998).</li><li>Luscher, C., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+glutamate+release+during+LTP+with+glial+transporter+currents.">Monitoring glutamate release during LTP with glial transporter currents.</a> Neuron. 21, 435-441 (1998).</li><li>Pannasch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglial+networks+scale+synaptic+activity+and+plasticity.">Astroglial networks scale synaptic activity and plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 8467-8472 (2011).</li><li>Poolos, N. P., Mauk, M. D., Kocsis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-evoked+increases+in+extracellular+potassium+modulate+presynaptic+excitability+in+the+CA1+region+of+the+hippocampus.">Activity-evoked increases in extracellular potassium modulate presynaptic excitability in the CA1 region of the hippocampus.</a> J. Neurophysiol. 58, 404-416 (1987).</li><li>Amzica, F., Massimini, M., Manfridi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+buffering+during+slow+and+paroxysmal+sleep+oscillations+in+cortical+networks+of+glial+cells+in+vivo.">Spatial buffering during slow and paroxysmal sleep oscillations in cortical networks of glial cells in vivo.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 1042-1053 (2002).</li><li>Diamond, J. S., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transporters+buffer+synaptically+released+glutamate+on+a+submillisecond+time+scale.">Transporters buffer synaptically released glutamate on a submillisecond time scale.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 17, 4672-4687 (1997).</li><li>Oliet, S. H., Piet, R., Poulain, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+glutamate+clearance+and+synaptic+efficacy+by+glial+coverage+of+neurons.">Control of glutamate clearance and synaptic efficacy by glial coverage of neurons.</a> Science. 292, 923-926 (2001).</li><li>Bergles, D. E., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+contribution+to+glutamate+uptake+at+Schaffer+collateral-commissural+synapses+in+the+hippocampus.">Glial contribution to glutamate uptake at Schaffer collateral-commissural synapses in the hippocampus.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 7709-7716 (1998).</li><li>Danbolt, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+uptake.">Glutamate uptake.</a> Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).</li><li>Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+the+glutamate+clearance+time+course+from+transporter+currents+in+CA1+hippocampal+astrocytes:+transmitter+uptake+gets+faster+during+development.">Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2906-2916 (2005).</li><li>Scimemi, A., Tian, H., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+transporter+regulate+glutamate+clearance,+NMDA+receptor+activation,+and+synaptic+plasticity+in+the+hippocampus.">Neuronal transporter regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 14581-14595 (2009).</li><li>Davie, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+patch-clamp+recording.">Dendritic patch-clamp recording.</a> Nature. 1, 1235-1247 (2006).</li><li>Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+loading+of+calcium+indicator+dyes+to+study+astrocyte+physiology:+key+limitations+and+improvements+using+morphological+maps.">Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 9353-9358 (2011).</li><li>Panatier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+are+endogenous+regulators+of+basal+transmission+at+central+synapses.">Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses.</a> Cell. 146, 785-798 (2011).</li><li>Castro, M. A. D. i., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+Ca2++detection+and+modulation+of+synaptic+release+by+astrocytes.">Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes.</a> Nature. 14, 1276-1284 (2011).</li><li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes.">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nature. 13, 759-766 (2010).</li></ol>

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synaptically - 유도 neuronal와 glial 응답 듀얼 녹화가 astroglial 특성의 변화에​​ 관련된 사전 및 postsynaptic 활동에 온라인으로 변경 공부를 할 수있는 유용한 방법입니다. synaptically-evoked glial 막 탈분극은 세포 칼륨 presynaptic 작업 잠재적 발사에 부분에 의한 상승 8,하지만 대부분 postsynaptic 탈분극 7의 직접 측정 한 것입니다. glial 막전위 역학에 따라서 녹음 presynaptic 흥분의 수정, postsynaptic 활동, 세포 공간 볼륨과 칼륨 버퍼링 용량을 6, 8을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. astroglial glutamate의 전송 전류는 출시 확률 3 단기 변화, 5, 9 모니터 할 수 presynaptic glutamate 자료의 민감한 측정입니다. 그것은 또한 다른 시냅스에서 또는 다른 개발 St에서 기능 시냅스-glia 상호 작용을 특징하는 데 사용할 수 있습니다나이 10. 그것은 GLTs 높은 온도에 민감한 11아르와 그렇단 +, K +와 H 12의 전기 기울기에 의해 구동되는 강조 표시됩니다. 따라서 GLT 전류의 진폭과 반응 속도론은 매우 선택한 실험 조건에 따라 달라집니다. 또한, 기록 된 GLT 전류에서 파생 astroglial glutamate 통관의 실제 시간 코스는 부분적으로 드러나지 것으로 알려져 있습니다. 이 같은 13의 동력학을 왜곡 astrocytes의 electrotonic 속성이나 비동기 송신기 출시 등 요인에 의해 GLT 전류 필터링 때문입니다. 필터링 메커니즘의 시간 기능을 추출 방법들이 개발되었으며 recenly 6,13,14을 수행으로 생리 나 병리 상황에서 실제 glutamate 통관 시간 코스를 도출하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, astroglial 막 탈분극의 동시 녹음, 현재 클램프에 insig 제공 할 수 있습니다세포 칼륨 과도 가능한 변경에 HTS. 싱글 astrocytes는 ~ 100 서로 다른 뉴런의 시냅스 100,000까지 연락, 따라서 통합 않으며 지역 neuronal 네트워크의 활동을 조절. astrocytes의 방법을 사용하는 것은 여기에 제시된 즉, 녹음 electrophysiological 전체 세포 반응을 기초 시냅스 활동에 대한 인사이트를 얻으려면 하나는 astrocytes에서, 소마 레벨에서 패치 - 클램프 녹음이 검출 전류는 주로 세포 소마에서 발생 할 수 있다는 점에 유의해야합니다 또는 근위 처리합니다. 수용체 여러 고급 과정에서 발생하는 채널의 강력한 활성화는 세포 소마로 확산 전류를 생성 할 수있을 때 사실, 소마에서 감지 전류는 부분적으로 고급 말초 과정에서 발생한. 따라서 신경 구획을 다루는 각각의 작은 astroglial 과정에서 기저 수용체 및 채널 활동은 거의 감지합니다. 이 부분의 제한된로 인해 침을 뱉입니다현장에서 astrocytes에서 전체 세포 패치 - 클램프 녹음에 의한 막 전류와 전압의 ial과 측두엽 제어 할 수 있습니다. 그러나, 풍부한 작은 astrocytic 프로세스의 표면이 소마과 주요 프로세스의 막 면적 훨씬 초과하는 것을인지해야합니다. 또한, 이러한 perisynaptic astroglial microdomains 가능성이 neuroglial 커뮤니케이션과 신경 조절에 중요​​한 역할을 기능적으로 관련 수용체 및 채널을 포함합니다. 우리가 제시 한 기술은 따라서 afference의 자극에 특정에서 발생, neuronal ensembles의 동기 활동의 astrocytic 통합을 연구하는 대부분 유용합니다. 그것은 기초 자발적인 활동을 통해 발생하는 각각의 시냅스와 인접 고급 astrocytic 프로세스 사이의 대화를 공부하는 데 사용할 수 없습니다. 기초 시냅스 활동에 의해 유도 지역 astroglial 반응을 공부하는 다른 방법은 고급 과정에서 패치 - 클램프 녹음을 수행 할 수와 같은 D 것입니다수석 15 하나입니다. 패치 이러한 고급 astroglial 프로세스가 가능성이 작은 크기로 인해 도전 있지만, 아마 astroglial microdomains 및 개인 시냅스 사이의 더 친밀한 대화 상자를 해명하기 위해 추구 할 수있는 길입니다. 전기 노이즈 패치 - 클램프 녹음에서 평균 3-5 PA에 도달 있기 때문에, 개별 고급 astroglial 과정에서 발생하는 가능성이 작은 electrophysiological astroglial 응답은 임계 값 감지 아래있을 수 있습니다. neuroactive 물질에 의한 astrocytic 막 수용체 또는 수송의 활성화는 세포 내 칼슘 과도를 실행할 수 있기 때문에 시냅스 활동에 astroglial 반응을 연구하는 또 다른 방법은 칼슘 이미징입니다. 그러나, 칼슘 지표와 astrocytes의 대량로드는 주로 체세포의 활동 16이 반영 될 수 있습니다. 전기 생리학과 칼슘 이미징의 조합도 중 B를 자발적으로 발생하거나 발생, 고급 astroglial 과정에서 작은 칼슘 신호를 검출 가능Y 최소한의 신경 자극 17, 18. 그러나, 하나는 낮은 선호도 지표가 감지 레벨 아래에서 사용할 수있는 반면에 높은 친 화성 칼슘 지표, 칼슘 버퍼, 억제 중요한 칼슘 신호 경로처럼 행동 수 있다는 점에 유의해야합니다. 마지막으로, 또한 전체 셀 패치 - 클램프 동안 세포 신호 분자의 유실을 circumvents 고급 astrocytic 과정에서 칼슘 이벤트, 공부 우아하고 비 침습적 기술은 astrocytes로 표현 될 수있는 멤브레인 대상으로 칼슘 센서를 사용하여 구성 현장에서뿐만 아니라 생체 19 있습니다. 전체 세포 패치 - 클램프 채널과 수용체 활성화에 발생하는 모든 다른 이온 전류에 대한 양적 정보를 제공하는 반면 그러나, 칼슘 이미징은 하나의 신호 많은에 관여 분자, 전부는 아니지만 세포의 활동에 대한 정보를 제공 할 수 있습니다. 뉴런과 astrocytes에서 따라서 동시 electrophysiological 레코딩neuroglial 이온 신호와 역할 뇌 정보 처리의 역학을 온라인으로 해명 할 수있는 독특하고 강력한 방법입니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> Picrotoxin </td><td> 시그마 </td><td> P1675 </td><td> DMSO에 용해 </td></tr><tr><td> Kynurenic 산 </td><td> Tocris </td><td> 0223 </td><td> 34에 용해 ° C 저어 또는 sonication </td></tr><tr><td> DL-TBOA </td><td> Tocris </td><td> 1223 </td><td> DCG IV Tocris 0975 </td></tr></tbody></table>

dual electrophysiological recordings of synaptically-evoked astroglial and neuronal responses in acute hippocampal slices

Astrocytes들은 통합 곳, 뉴런 삼자 간의 시냅스와 함께 형성하고 neuronal 활동을 조절. 사실, astrocytes는 이온 채널과 신경 전달 물질 수용체의 활성화를 통해 neuronal 입력을 감지하고, gliotransmitters의 활동에 의존 출시를 통해 일부 프로세스 정보를 제공합니다. 또한, astrocytes는 glutamate의 기본 이해 시스템을 구성, 칼륨 공간 버퍼링에 기여뿐만 아니라 GABA 통관에 있습니다. 이러한 세포는 따라서 지속적으로 시냅스 활동을 모니터링하고, synaptically 출시 glutamate의 변경, GABA 및 세포 칼륨 수준에이를 민감한 지표입니다. 또한, astroglial 이해 활동이나 버퍼링 용량의 변경이 neuronal 기능에 심각한 영향을 미칠 수 있으며, physiopathological 상황 또는 녹아웃 마우스를 특성화 할 때 간과 될 수 있습니다. neuronal 및 astroglial 활동의 듀얼 녹화 따라서에서 변경을 연구하는 중요한 방법입니다시냅스 강도가 astroglial 이해와 버퍼링 용량의 변화를 수반하는 연관. 여기 hippocampal 슬라이스, 어떻게 지층 radiatum의 astrocytes을 식별하는 방법과 동시에 neuronal 및 astroglial electrophysiological 응답을 기록하는 방법을 준비하는 방법에 대해 설명합니다. 또한, 우리는 pharmacologically synaptically-evoked astroglial 전류를 분리하는 방법에 대해 설명합니다.

해마의 CA1 지역에서 synaptically-evoked astroglial와 neuronal 응답의 대표 동시 녹음 (fEPSPs)는 그림 2 AB에 표시됩니다. evoked astroglial 전류는 biphasic입니다, 즉이 과도 외부 전류 및 (그림 2B) (&gt; 10 초) 천천히 부패 안쪽 현재 구성되어 있습니다. 외부 전류는 evoked fEPSP을 반영하고, kynurenic 산 (짙은 회색 추적, 그림 2B) (3)에 의해 ionotropic의 glutamate 수용체의 억제 후 차단됩니다. 이 또한 주를 대표하는 것으로 알려진 postsynaptic ionotropic의 glutamate 수용체의 활동을 억제하는 kynurenic 산, (그림 2B 및 그림 2C 1) 3-6으로 폐지되기 때문에 속도가 느린 안쪽 현재의 대부분은 astrocyte 다음과 postsynaptic 탈분극에 칼륨 항목을 반영 칼륨 출시 7 소스 (80 %). 나머지는 빠른 속도로 상승D 부패 안쪽으로 전류가 GLT 길항제 DL-TBOA (밝은 회색 추적, 그림 2B 및 그림 2C 2)에 의해 저해된다. kynurenic 산 (짙은 회색 추적)에서 현재의 TBOA (밝은 회색 추적)에서 나머지 느린 전류의 후 임시 빼기는 현재 순수 astroglial glutamate의 전송 (흑백 추적)의 분리는 그림 2C 2에 도시 할 수 있습니다. 지속적인 천천히 kynurenic 산에서 현재의 부패와 TBOA은 (밝은 회색 추적, 그림 2B 및 그림 2C 2) TTX (데이터 미도시)에 의해 차단하고, 가능성이 가장 높은 세포 K의 축적을 반영 + presynaptic 수입 성의 사격 3에서 릴리스 할 수 있습니다. Schaffer 민간인 피해의 보통 하나의 자극은 동일한 세포 (그림 2D)에 기록 된 작은 evoked 탈분극에 비해 상대적으로 큰 synaptically-evoked astroglial 전류를 유도한다. 이것은 때문입니다astrocytes의 낮은 막 저항. synaptically-evoked astroglial 막전위 역학의 녹음, 그림 2D에 도시 된 바와 같이, 지역 세포 칼륨 수준 8 직접적으로 측정 한 것입니다. 기본 neuronal 활동 evoked astroglial 응답 정상화 다른 실험의 직접적인 비교 등 최근 6 표시 할 수 있습니다. 총 synaptically-evoked astroglial 전류 선형 fEPSP의 증가 (그림 2E)을 다음과 같이 Astroglial 전류은 또한 매우 안정적으로 흥분성의 전송에 변경을 모니터링 할 수 있습니다. 사람들이 보여 이후 Astroglial 전류 또한, 단기 시냅스 소성을 반영, 뉴런 등, 짝 펄스 촉진 (그림 2F). CA1 피라미드 세포와 astrocyte의 짝을 전체 셀 녹음, depolarizing 펄스에 대한 응답으로 뉴런 표시 행동 잠재력 때문에, 두 세포 유형에 매우 다른 electrophysiological 동작을 보여인근 astrocyte는 (그림 3A-B) 자동에 있습니다. 그러나, Schaffer 민간인 피해의 적당한 자극을 동시에 CA1 피라미드 세포와 인접 astrocyte (그림 3B 2) 빠른 외부와 느린 안쪽으로 전류의 빠른 흥분성의 posynaptic 잠재력을 그대로 보여주고 있습니다. 그림 3C와 같이 synaptically-evoked neuronal 및 astroglial 응답 듀얼 녹음은 또한 해마의 CA3 영역에 기록 할 수 있습니다. 사실, CA3 이끼 섬유의 하나의 자극이 기저 상태에서 astrocytes의 작은 빠른 외측과 내측 느린 전류 (그림 3D 1)에 연결된 로컬 fEPSPs로 기록 아주 작은 neuronal 응답을, 세상의 시작과 끝. 그것은 단지 적당한 astroglial 응답 (그림 3D 2) 증가하면서 대조적으로, 몇 초 동안 CA3 이끼 섬유의 1 Hz에서의 자극은 강하게, fEPSP을 potentiates. 횡단 조각을 준비하는 1. 해마 절연 그림. 뇌를 해부하기 위해 중간 선 (가) 함께 스컬을 잘라. 후각 망울 (B)의 수준과 이후 소뇌 (C)의 수준에서 코로나 몫을합니다. 조심스럽게 집게 (D)의 도움으로 스컬를 제거 블레이드 (전자)와 두 반구를 분리하고 차가운 산소를 ACSF (F)에 작은 스푼에 올려 전송할 수 있습니다. ~ 5 분 평균 한 후, 최대 안쪽 표면 (g)와 마른 조직에 하나의 반구를 넣습니다. 두 스푼의 도움으로 diencephalon (HJ)를 제거하십시오. 점선 (K)에 의해 그림과 같이 해마, 지금은 볼 수 있습니다. 흰색 구조 (LM)과 같은 표시, fimbria부터, 스푼으로 해마를 해부. 추위 ACSF에 다시 해마를 전송합니다. 작은 아가로 오스 블록, alveus 측면이있는 위치에 두 hippocampi을하고 복부 hippocamp 준비우리는 한천 블록의 가장자리를 마주하고, 한천 (N)에 좋은 첨부 파일을 허용하는 거리에주의 깊게 모든 액체를 즐겨보십시오. 접착제 해마는 복부 부분 (O)에 한천 블록에 부착. <img src="/files/ftp_upload/4418/4418fig2.jpg" alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4418/4418fig2highres.jpg"/> 그림 2. 해마의 CA1 영역에서 - synaptically evoked 동시 neuronal와 astroglial 응답. A) astrocytic 전류를 기록하는 Schaffer 민간인 피해 (SC), 패치 피펫 전극을 활성화 할 수있는 자극 전극의 배열을 도시 hippocampal 슬라이스, 그리고 세포 전극의 계획은 hippocampal에 SC의 자극에 의​​해 evoked, fEPSP을 기록하는 CA1 공간이 마련되어 있습니다. B) fEPSPs의 동시 녹음 (상단 패널)과 evoked-synaptically presenc에서 SC의 자극에 의​​해 astrocytic 전류 (낮은 패널)의 대표 흔적약리 약물의 전자. 답변은 먼저 GABA 흥분성의 반응을 분리하는 수용체 차단 (picrotoxin, 100 μM, 검은 흔적)의 존재에 기록됩니다. ionotropic의 glutamate 수용체 차단 (kynurenic 산, 5 음, 짙은 회색 흔적)의 후속 응용 프로그램입니다 astrocytic 현재 응답의 작고 빠른 과도 구성 요소를, unmasking, fEPSP과 오래 지속 astroglial 현재의 주요 부분을 억제 glutamate 전송 차단 (TBOA, 200 μM, 밝은 회색 흔적)에 민감. 규모 바, fEPSP 0.1 MV, astrocytic 현재 15 PA, 10 밀리 초. C 1). 총 전류에서 kynurenic 산 (2)에 남아있는 현재 구성 요소를 차감하여 B (하단 패널, 검은 색 추적)에 표시된 evoked 응답에서 격리 할 수​​ 있습니다 현재 astroglial 칼륨 (1-2)의 샘플 추적 ( 1). 규모 바, 20 파, 1 초. TBOA 물론, 뺄셈 얻은 현재 glutamate 전송 (2-3)의 C 2) 샘플 추적kynurenic 산 (2)에서 현재의 nsensitive 속도가 느린 구성 요소 (3). 규모 바, 2.5 PA, 25 밀리 초. D) 안쪽으로 현재의 샘플 흔적은 전압 클램프 (하단 패널)와 SC의 자극에 의​​해 astrocyte에서 유도 전류 클램프 (상단 패널)에 기록 된 해당 막 탈분극에 기록. 스케일 바는, 1.5 MV, 전압 클램프 5 파, 1 초에 전류 클램프. E) presynaptic 섬유 연발 (입력) 및 (출력) 총 astroglial 현재 사이의 관계를 설명 입력 - 출력 곡선은 SC의 자극 (N = 6)에 대한 응답으로 동시에 기록했다. neuronal fEPSP으로 선형 증가 섬유 연발있는 astroglial 현재 증가. F) neuronal 응답 (fEPSP)과 astrocytic 현재의 샘플 흔적은 40 밀리 초 interpulse 간격으로 짝 - 펄스 자극에 표시됩니다. synaptically-evoked astroglial 현재 전시 뉴런, 짝 - 펄스 촉진처럼. 규모 바, 0.1 MV, 5 PA, 20 밀리 초. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-페이지 = &quot;항상&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4418/4418fig3.jpg" alt="그림 3" fo:content-width="3.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4418/4418fig3highres.jpg"/> 그림 3. 해마의 CA1과 CA3 영역에서 synaptically 유발 neuronal 및 astroglial 응답 듀얼 레코딩. A) sulforhodamine-B (적색, 0.1 %)과 전체 세포 패치 - 클램프 기법을 사용하여 fluorescein dextran (녹색, 0.1 %)로 가득 astrocyte와 함께 주입 CA1 피라미드 세포의 재건. 스케일 바, 10 μm. B 1) CA1 피라미드 세포와 인접 astrocyte에서 전류 클램프에 기록 된 막 전위의 동시 전체 셀 녹음의 대표 흔적. Neuronal 작업 잠재적 발사 (검은 흔적), 전류 펄스를 depolarizing 20 PA의 주입에 의해 evoked, 인접 astrocyte (회색 추적)에서 응답 세상의 시작과 끝 않습니다. 규모 바, 20 MV, 10 파, 100 밀리 초. 전류 조개의 CA1 피라미드 세포의 이중 전체 셀 녹음의 B 2) 샘플 흔적P와 picrotoxin (100 μM)의 존재에 SC의 자극 후 전압 클램프의 이웃 astrocyte. SC의 자극은 (​​회색 추적) 작고 오래 지속 astrocytic 현재에 연결 흥분성의 postsynaptic 잠재력을 (EPSP, 검은 흔적), 세상의 시작과 끝. 규모 바, 5 뮤직 비디오, 10 파, 100 밀리 초. C) hippocampal 슬라이스의 제도에 이끼 ​​섬유, 패치 피펫 전극 (회색), astrocytic 전류를 기록하고, 세포 전극을 활성화하려면 이가있는 이랑 (DG)과 CA3 영역 자극 전극의 배열에 묘사 CA3 이끼 섬유의 자극에 의​​해 evoked 기록 fEPSP. CA3 fEPSPs의 짝을 녹음 (상단 패널, D 1, D 2 블랙 흔적)와 astrocytic 전체 세포 반응 (하단 패널, D 1, D 2 회색 흔적) CA3 이끼의 단일 자극에의 D, E) 대표 흔적 0.02 Hz에서 (삽입 확대) (D 1)에서 또는 1 Hz에서의 자극 주파수 (D 2)의 섬유. D에 대한 스케일 바 <sub&gt; 1 D 2, 0.2 MV, 15 파, 시간 : D 1 1 초, D이 100 밀리 초. 삽입 스케일 바, 0.1 MV, 100 밀리 초.

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Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

절연 hippocampi에서 급성 뇌 조각뿐만 아니라 astrocytes와의 뉴런의 동시 electrophysiological 레코딩의 준비<em&gt; 지층 radiatum</em&gt; schaffer 민간인 피해의 자극 동안이 설명되어 있습니다. astroglial 칼륨 및 glutamate 전송 전류의 약리 고립 증명합니다.

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

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27.1K 조회수.  Collège de France. 절연 hippocampi에서 급성 뇌 조각뿐만 아니라 astrocytes와의 뉴런의 동시 electrophysiological 레코딩의 준비 지층 radiatum schaffer 민간인 피해의 자극 동안이 설명되어 있습니다. astroglial 칼륨 및 glutamate 전송 전류의 약리 고립 증명합니다.

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Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Identified by Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamic Slices

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH). These gonadotropins are essential for the regulation of reproductive function. The GnRH-containing neurons are distributed diffusely throughout the hypothalamus and project to the median eminence where they release GnRH from their axon terminals into the hypophysiotropic portal system (1). In the portal capillaries, GnRH travels to the anterior pituitary gland to stimulate release of gonadotropins into systemic circulation. GnRH release is not continuous but rather occurs in episodic pulses. It is well established that the intermittent manner of GnRH release is essential for reproduction (2, 3).
Coordination of activity of multiple GnRH neurons probably underlies GnRH pulses. Total peptide content in GnRH neurons is approximately 1.0 pg/cell (4), of which 30% likely comprises the releasable pool. Levels of GnRH during a pulse (5, 6), suggest multiple GnRH neurons are probably involved in neurosecretion. Likewise, single unit activity extracted from hypothalamic multi-unit recordings during LH release indicates changes in activity of multiple neurons (7). The electrodes with recorded activity during LH pulses are associated with either GnRH somata or fibers (8). Therefore, at least some of this activity arises from GnRH neurons.
The mechanisms that result in synchronized firing in hypothalamic GnRH neurons are unknown. Elucidating the mechanisms that coordinate firing in GnRH neurons is a complex problem. First, the GnRH neurons are relatively few in number. In rodents, there are 800-2500 GnRH neurons. It is not clear that all GnRH neurons are involved in episodic GnRH release. Moreover, GnRH neurons are diffusely distributed (1). This has complicated our understanding of coordination of firing and has made many technical approaches intractable. We have optimized loose cell-attached recordings in current-clamp mode for the direct detection of action potentials and developed a recording approach that allows for simultaneous recordings from pairs of GnRH neurons.

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices

Activity in neuronal systems often requires synchronous action potential discharges from neurons within a specific population. For example, pulses of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) likely require coordinated activity between GnRH neurons. We present our methodological approach for reliably obtaining simultaneous electrophysiological recordings from the diffusely distributed GnRH neurons.

에서 듀얼 레코딩 체세포 생식 샘 자극 호르몬 - 방출 Hypothalamic 조각에 녹색 형광 단백질 (GFP)에 의해 확인된 호르몬 (GnRH) 신경을

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating ...

연구

신경과학

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

해마의 Organotypic 조각의 쌍으로 전체 셀 녹음

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

급성 뇌 조각에서 신경 세포의 미세 회로의 전기 생리 및 형태 학적 특성은 페어 패치 클램프 녹음을 사용하여

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity is achieved in neurons within a specific time frame. These long-term plasticity-related processes are the leading candidate models to study the basis of memory formation and persistence at the cellular level. Both STC and cross-tagging involve two serial processes: (1) setting of the synaptic tag as triggered by a specific pattern of stimulation, and (2) synaptic capture, whereby the synaptic tag interacts with newly synthesized plasticity-related proteins (PRPs). Much of the understanding about the concepts of STC and cross-tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the laboratories are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging. This video article describes the experimental procedures to study long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.

This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.

설치류에서 급성 해마 조각을 사용하여 시냅스 태그 / 캡처 및 크로스 캡처 조사

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

급성 Hippocampal 조각에 작은 볼륨 재활용-, 관류-침수 형 챔버 시스템 유지에 시 냅 스가 소성을 기록

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the pathophysiological basis of these diseases, it is necessary to precisely characterize in which way the processing of information is disturbed between the different neuronal parts of the circuit. Using extracellular in vivo electrophysiological recordings, it is possible to accurately delineate neuronal activity within a neuronal network. The application of this method has several advantages over alternative techniques, e.g., functional magnetic resonance imaging and calcium imaging, as it allows a unique temporal and spatial resolution and does not rely on genetically engineered organisms. However, the use of extracellular in vivo recordings is limited since it is an invasive technique that cannot be universally applied. In this article, a simple and easy to use method is presented with which it is possible to simultaneously record extracellular potentials such as local field potentials and multiunit activity at multiple sites of a network. It is detailed how a precise targeting of subcortical nuclei can be achieved using a combination of stereotactic surgery and online analysis of multi-unit recordings. Thus, it is demonstrated, how a complete network such as the hyperdirect cortico-basal ganglia loop can be studied in anesthetized animals in vivo.

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

In this study, the methodology is presented on how to perform multi-site in vivo electrophysiological recordings from the hyperdirect pathway under urethane anesthesia.

심각한<em&gt; In Vivo</em&gt; 마취 된 래트에서의 Hyperdirect 경로로부터의 국소 장 전위 및 다중 단위 활성의 전기 생리 학적 기록

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is tightly regulated during development and neuronal maturation. Importantly, deficits in synapse number can lead to cognitive dysfunction. Therefore, the evaluation of synapse number is an integral part of neurobiology. However, as synapses are small and highly compact in the intact brain, the assessment of absolute number is challenging. This protocol describes a method to easily identify and evaluate synapses in hippocampal rodent slices using immunofluorescence microscopy. It includes a three-step procedure to evaluate synapses in high-quality confocal microscopy images by analyzing the co-localization of pre- and postsynaptic proteins in hippocampal slices. It also explains how the analysis is performed and gives representative examples from both excitatory and inhibitory synapses. This protocol provides a solid foundation for the analysis of synapses and can be applied to any research investigating the structure and function of the brain.

A protocol for accurately identifying and analyzing synapses in hippocampal slices using immunofluorescence is outlined in this article.

시 냅 스 밀도 Hippocampal 설치류 두뇌 분할 영역에서의 평가

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Optogenetic 쥐 행동에 Hippocampal 세타 진동의 유입

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for sudden death. Despite an abundance of available treatment options, about 30% of patients are drug-resistant. Several novel therapeutics have been developed using animal models, though the rate of drug-resistant patients remains unaltered. One of probable reasons is the lack of translation between rodent models and humans, such as a weak representation of human pharmacoresistance in animal models. Resected human brain tissue as a preclinical evaluation tool has the advantage to bridge this translational gap. Described here is a method for high quality preparation of human hippocampal brain slices and subsequent stable induction of epileptiform activity. The protocol describes the induction of burst activity during application of 8 mM KCl and 4-aminopyridin. This activity is sensitive to established AED lacosamide or novel antiepileptic candidates, such as dimethylethanolamine (DMEA). In addition, the method describes induction of seizure-like events in CA1 of human hippocampal brain slices by reduction of extracellular Mg2+ and application of bicuculline, a GABAA receptor blocker. The experimental set-up can be used to screen potential antiepileptic substances for their effects on epileptiform activity. Furthermore, mechanisms of action postulated for specific compounds can be validated using this approach in human tissue (e.g., using patch-clamp recordings). To conclude, investigation of vital human brain tissue ex vivo (here, resected hippocampus from patients suffering from temporal lobe epilepsy) will improve the current knowledge of physiological and pathological mechanisms in the human brain.

The presented protocol describes the transport and preparation of resected human hippocampal tissue with the ultimate goal to use vital brain slices as a preclinical evaluation tool for potential antiepileptic substances.

전기 생리학적 기록을 위한 급성 인간 해마 슬라이스의 준비

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.