장기 시 냅 스 가소성, 특히, 장기 potentiation 및 장기 우울증 해 마의 횡 방향에 따라 광범위 하 게 조사 되었습니다. 또한 세로 방향을 따라 살펴보았습니다. 그러나, 세로 방향에 관해서, 시 냅 스 가소성에 대 한 해 마의 세로 CA1 축에 거의 관심을 부여 되었습니다.
우리의 실험실에서 이전 간행물은 해마의 CA1 피라미드 뉴런시 시 냅 스 가소성을 지원할 수 있는 협회 연결을 형성 하는 것으로 나타났습니다. 이 프로토콜을 더 잘 이해하려면 아래 참조를 사용하여 이전 발행물을 참조하는 것이 좋습니다. 마우스를 마취시키기 위해 우레탄을 주입합니다.
완전히 마취된 마우스를 섭씨 37도로 설정된 가열 패드에 놓습니다. 눈을 촉촉하게 하기 위해 아이 젤을 발라주세요. 눈 클램프를 사용하여 마우스의 두개골을 단단히 고정합니다.
아이 클램프는 외과 적 시술 중에 실험자의 이동성의 자유를 제공합니다. 그리고 청각 피질을 포함하는 실험에도 특히 유용할 수 있습니다. 그러나 정확한 입체 적 좌표를 얻으려면 많은 주의를 기울여야합니다.
메스와 마우스의 자궁 간 및 후수 뼈의 끝에 피하 조직과 근육을 분리합니다. 면 봉봉으로 두라 물질을 건조. 그런 다음 시스테나 마그나를 뚫어 뇌척수액을 배출합니다.
면봉을 부착하여 뇌척수액을 계속 배출합니다. 두피에 피부를 잘라 내고 제거하고 노출된 부위를 건조하게 유지합니다. 베니야르 칼리퍼의 도움을 사용하여 해마 부위에 해당하는 점을 표시한다.
현미경으로 관찰하는 동안 메스 또는 고속 드릴을 사용하여 표시된 점을 따라 해마의 등대 위의 두개골에 절개를합니다. 생리식염수 또는 불활성 오일을 적용하여 노출된 뇌 조직을 촉촉하게 유지하십시오. 자극및 기록 전극을 스테레오탁스 홀더에 단단히 고정하고 배치합니다.
CA1 도살 해마 위의 자극 및 기록 전극을 조정합니다. 등경 CA1 해마 부위의 좌표를 찾는 가이드로서 입체 좌표에서 마우스 뇌를 사용한다. 멀티채널 전극을 사용하는 레코딩의 경우 먼저 첫 번째 채널을 사용하여 CA1 해마 영역에 대한 스테레오탁좌를 찾습니다.
나머지 전극을 배치하여 자극 및 기록 전극의 각도가 브레그마 점으로부터 의 중간선과 관련하여 30도에서 60도 사이의 범위에 있도록 배치합니다. 이 각도는 CA1 해마 영역의 세로 방향에 해당합니다. 레코딩 시스템을 켭니다.
기록 및 데이터 수집을 위한 신경 소프트웨어를 엽니다. 뇌 표면에 닿을 때까지 미세 조작기를 사용하여 천천히 기록 및 자극 전극을 낮춥춥니까. 전극이 뇌 표면에 닿을 때 임피던스의 증가를 관찰하십시오.
화면에 표시된 빨간색 채널에서 관찰할 수 있습니다. CA1 해마에 대해 선택한 입체 좌표에 해당하는 대략적인 깊이로 전극을 천천히 낮춥다. 안정적인 연상 절개 후 시냅스 전위가 관찰 될 때까지 자극을 준다.
입력 출력 곡선을 수행하여 최대 자극 강도를 감지합니다. 입력 출력 곡선을 사용하여 기준강도를 설정하고 고주파 자극 또는 저주파 자극을 불러 일으키는 자극 강도를 설정합니다. 고주파 자극 또는 저주파 자극 후 한 시간 동안 로컬 전체 잠재력을 기록합니다.
선택한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 내보내고 분석합니다. 이미 준비된 슬라이스 용액 400ml를 별도의 플라스크로 넣고 약 20분 동안 산소를 공급합니다. 산소 슬라이스 용액의 불쌍한 200ml.
파라 필름으로 덮고 슬러시를 만들기 위해 약 20 분 동안 80도 냉동고로 옮춥니다. 나머지 200ml의 슬라이스 용액을 뇌 슬라이스에 담고 챔버를 들고 있으며 지속적인 버블링으로 섭씨 32도의 물 봇에 보관하십시오. 차가운 슬라이스 용액을 꺼내고 약 50ml의 가난한 비커를 꺼내십시오.
마취 된 마우스를 참수합니다. 마우스의 두개골을 덮고 있는 피부를 자르고 중간선을 따라 두개골 조각을 목선 뼈로 자른다. 무딘 집게로 두개골을 엽니다.
주걱으로 뇌를 부드럽게 떠서 차가운 슬라이스 용액에 비커에 넣습니다. 두 뇌 반구를 중간선을 따라 메스 블레이드를 분리합니다. 주걱으로 피질에서 부드럽게 분리하여 해마를 분리합니다.
고립 된 해마의 중격 및 측두엽 끝을 잘라. 슬라이스 플레이트에 소량의 접착제를 발라주세요. 세로 CA1 해마 슬라이스의 경우 해마의 CA3 영역을 접착제로 슬라이싱 플레이트에 부착하십시오.
제어 역할을 하는 횡방향 슬라이스의 경우 해마의 복부 끝을 진동판의 슬라이싱 플레이트에 부착합니다. 슬라이스 챔버에 놓습니다. 진동 매개 변수를 설정합니다.
부속된 해마를 진동으로 슬라이스합니다. 좋은 세로 CA1 해마 뇌 슬라이스는 CA1의 한 층, 그리고 2 층의 규명 자이러스를 가질 것입니다. 또한, CA1 영역의 지층 오리엔스와 층 복사제가 존재할 것이다.
또는, 횡단 해마 뇌 슬라이스는 전술에 있는 dentate gyrus CA3 및 CA1 지구를 갖습니다. 물 봇에 챔버를 들고 뇌 슬라이스에 뇌 조각을 전송합니다. 섭씨 32도의 온도에서 20 분 동안 배양하고 회복을 위해 실온으로 가져 갑니다.
ACS serf를 분당 2ml의 속도로 녹음 챔버에 지속적으로 대체합니다. 뇌 슬라이스를 기록 실로 옮기고, 무딘 집게로 뇌 슬라이스의 위치를 조정하고, 햅로 제자리에 고정합니다. 데이터 수집을 위해 소프트웨어를 켭니다.
세로 뇌 슬라이스. 세로 슬라이스의 경우, 자극및 기록 전극을 지층 오리엔스에 배치합니다. 자극 전극을 뇌 슬라이스의 중격 또는 측두측에 동일한 층에서 기록하여 놓습니다.
대안적으로, 자극 및 기록 전극을 층 복사에 배치하고, 자극 전극을 뇌 슬라이스의 중격 또는 측두측에 놓는다. 횡방향 슬라이스를 제어로, CA3 샤퍼 측측 측측및 CA1 영역에 전극을 배치한다. 이솔레이터 자극 생성기를 켜고 자극을 줍니다.
안정적인 시냅틱 후 채워진 전위가 관찰될 때까지 기록 전극 깊이를 조정한다. 입력 출력 곡선을 수행하여 최대 자극 강도를 감지합니다. 입력 출력 곡선을 사용하여 고주파 자극 또는 저주파 자극을 불러 일으키는 기준 기록의 자극 강도를 설정합니다.
외로운 기간 전능또는 장기 우울증을 유도하는 매개 변수에 대한 첨부 된 PDF를 참조하십시오. 생체 내 고주파 자극에 대응하여 시냅스 후 전위가 증가하였다. 이것은 세로 해마 CA1이 장기적인 전능을 지원한다는 것을 보여줍니다.
경도 해마 CA1 뇌 슬라이스의 경우, 고주파 자극에 대한 반응의 증가는 지층 오리엔스와 지층 라디툼의 중격 및 측두측 모두에서 관찰되었다. 이는 세로 해마 CA1 영역을 따라 유도된 시냅스 가소성이 선형 또는 방향특이적이지 않다는 것을 보여준다. 장기 우울증에 대 한 이미 설립 된 프로토콜을 사용 하 여, 어떤 장기 우울증 생체 내와 체 외 에서 유도 되었다.
결론적으로, 우리는 생체 내및 체외 모두에서 세로 해마 CA1 영역에서 장기 시냅스 가소성을 조사하는 방법을 보여 주었다. 프로토콜의 자세한 내용은 자신의 실험실에서 세로 해마 CA1 영역을 따라 장기 시냅스 가소성을 조사하는 데 도움이이 비디오와 함께 PDF에서 찾을 수 있습니다.
