We would like to thank the members of the Montgomery and Madison labs for helpful discussion. We acknowledge the funding received from the following sources in this research: NFNZ, AMRF, Marsden Fund, HRC, and NIH.

동물 윤리 정책 : 이 논문에서 설명하는 프로토콜은 오클랜드와 스탠포드 대학의 대학에 의해 설립 된 동물 보호 지침을 따르십시오. P7 쥐 새끼는 빠른 잘린 안락사되었다. 해마 해부는 즉시 아래에 설명 된대로 수행됩니다. 1의 Organotypic 해마 슬라이스 문화 <ol><li> 준비 <ol><li> (뇌를 해부에만 사용) 해부 매체를 준비합니다. , 5 ㎖의 HEPES 완충 용액, 2 ㎖의 1 M 트리스 주식 솔루션 (산도 7.2) (0.85 % NaCl을 각각 10,000 대) 200 ㎖의 최소 필수 중간, 2 ml의 페니실린 - 스트렙토 마이신 솔루션을 결합하고, 필터는 0.22 μm의 필터 소독 . 얼음처럼 차가운 해부 매체에서 해마 절제술을 수행하십시오. </li><li> 해부 매체를 쿨. 약 1 시간 전에 액체가 매우 추운 때까지 절개를 시작하기에 냉동실에서 해부 미디어를 넣습니다. 큰 얼음 CR을 허용하지 마십시오ystals을 형성한다. 필요한 때까지 얼음에 보관하십시오. </li><li> (해마의 해부를 제외한 모든 사용) 문화 매체를 준비합니다. / L-글루타민, 2 ml의 페니실린 - 스트렙토 마이신 솔루션 와트, 행크의 염 / w 100 ㎖의 최소 필수 중간, (1 배 농도, 액체) 겸용 (0.85 % 액체, 각각 10,000 대, 염화나트륨), 2.5 ml의 HEPES 한 M 버퍼 솔루션, 50 ML 행크의 균형 소금 솔루션, 50 ㎖의 말 세럼 (정의, 열 불 활성화) 및 필터는 0.22 μm의 필터 소독. </li><li> 문화 요리를 준비합니다. 35mm 배양 접시 당 배양액 1 ㎖를 배치하고, 각 요리에 막 삽입을 추가합니다. 한 150mm 페트리 접시에 이러한 요리의 일곱까지 착용 할 것 ( &#39;판&#39;이라고 함). 요리 배양 배지는 적절한 온도와 pH가 달성되도록 절개가 시작되기 전에 적어도 한 시간 동안 CO 2 배양기에서 접시를 놓습니다. </li></ol></li><li> 출생 후 7 일에서 쥐 새끼들까지 잔치에서 해마의 해부 (P7) <ol><li> 절차 전에 자외선 아래의 모든 해부 도구를 사전 소독. </li><li> 급속한 잘린 후 접시에 냉장 한 매체 중에 뇌와 장소를 제거하고 해부 용 가습 필터 종이 조각을 제거. 해마를 노출, 무딘 부드러운 플라스틱으로 코팅 된 미니 주걱을 사용하여 멀리 중뇌에서 피질을 애무 해줘. 원개를 절단 한 다음 조심스럽게 (그림 1A)를 밖으로 플립 해마 아래에 주걱을 작동합니다. 노트 : 슬라이스 배양 P10까지 동물을 사용하여 제조 될 수있다. </li><li> 멀리 뇌의 나머지 부분에서 분리 된 해마를 낸다. 적신 부드러운 붓을 사용하여 냉장 해부 매체를 포함하는 새로운 접시에 해마로 이동 (예를 들어, 흰색 검은 담비 # 4). </li><li> 이러한 스폰지, meninge 형상 조직이 어려운 해마를 분리 할 수 있도록 같이, 박리시 맥락총의 해마의 하부 (즉, 평탄한면) 청소나중에 서로 조각. 참고 : 그들이 부드럽게 떨어져 조롱 할 수없는 경우 대신이 조직을 둡니다. </li><li> 해마를 손상시키지 않고 가능한 한 빨리 전체 절개를 수행한다. 참고 :주의 해부 한 실험 조건이 냉각 될 때, 빠른 일보다 더 중요하다. 동시에 세 쥐의 해마를 썬다. 도금 조각이 인큐베이터에 갈 때 슬라이스 건강이에 한 시작부터 총 시간 등의 영향을받지 않습니다 30 분을 받고있다. </li></ol></li><li> 슬라이스 <ol><li> 가로 수동 조직 슬라이서를 사용하여 400 μm의 크로스 섹션으로 해마를 썬다. 슬라이싱이 수행 된 방법은 조직에 과도하게 손상되지 않고 (암몬의 혼이 쉽게 조직에 보존 할 볼 수 있습니다 즉) 쉽게 볼 수 층류 아키텍처와 일치하는 두께의 조각을 생산 너무 오래 같이 중요하지 않습니다. </li><li> 조직의 무대에서 해마를 거짓말2 여과지 트리플 두께의 위에 초퍼. 해마는 (오히려이 시점에서 슬라이스 빵 덩어리처럼, 그림 1B 모든 인하되었습니다 때까지 전체 해마가 헬기의 무대에 남아 즉) 개별적으로 모든 조각을 제거하지 않고 완전히 분리된다. </li><li> 각 해마 옆에 누워 부드러운 붓 (2 흰색 검은 담비 #)를 사용하여 해부 매체로 해마를 전송합니다. 부드럽게 해마와 기본 필터 종이 사이의 접착력을 깰 측면에 각 해마를 밀어 넣습니다. 무대에서 내려 데리러 각 해마 아래 브러시를 굴립니다. 냉장 해부 매체의 동일한 35mm 페트리 접시에 모든 해마를 놓습니다. 수동으로 시계 방향과 반 시계 방향으로 운동을 교대로 요리를 교반하여 개별 조각으로 해마를 분리합니다. </li><li> 해부 현미경 슬라이스를 검사하고 명확하게 보이는 셀을 소유하지 않는 작은 손상, 또는 어떤되는 모든 폐기몸 층. 참고 : 종종 모든 조각이 성공적으로이 방법으로 자신의 형제 분리되어 있지 경우가 될 것입니다. 이 경우, 그들은 가장자리에 돌려서 미세 핀셋의 선단 그들을 괴롭히는 의해 분리 될 수있다. &quot;좋은&quot;슬라이스가 다음 차단 및 화재 연마 파스퇴르 피펫 (그림 1C-E)를 사용하여 냉장 해부 매체를 포함하는 또 다른 깨끗한 페트리 접시로 전송됩니다. </li></ol></li><li> 저장 <ol><li> 멤브레인 필터 인서트에 개별 조각을 놓습니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 차단 및 화재, 더 큰 구멍을 줄 개별적으로 문화 삽입에 조각을 전송하는 연마. 참고 : 절단 및 화재 연마 피펫이 중요한 때 생성 된 구멍의 크기입니다. 너무 작은 조각은 쉽게 막에 대한 피펫을 떠나지 않을 것입니다. 너무나 큰 과잉 유체는 슬라이스와 함께 공막의 표면 상에 배치된다. 최적 내경은 전형적으로는 약 절반이다 DIAM피펫의 배럴의 eter. 절단 할 때에는,이 직경은 피펫의 테이퍼에 적절한 장소에서 절단함으로써 선택 될 수있다. </li><li> 슬라이스 전송 <ol><li> 첫째 매체와 피펫을 입력 한 다음 작은 흡입 힘을 가진 한 조각을 빨아. 이 피펫의 개통 근처에 슬라이스를 유지하고 슬라이스를 배치 할 삽입에 너무 많은 매체 추방을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 작은 매달려 방울을 형성하는 전구에 약간의 힘을 주어 슬라이스가 물방울에 정착 한 다음 막에 그 방울을 터치 멤브레인에 슬라이스 &quot;가을&quot;을 할 수 있습니다. 일반적으로 3 조각은 각각의 막 삽입에 배치됩니다. NOTE : 유체 액적가 너무 큰 경우, 세 조각에서 물방울 막 표면에 병합하는 경향이 있고, 슬라이스 따라서 모든 더 어렵게 이후 전기 생리 녹화 그들을 분리 할 수​​있게, 멤브레인의 중앙에 수집된다. </li></ol></li><li> 유체 Remov알 <ol><li> 슬라이스에 침지 또는 해부 매체의 수영장으로 둘러싸여되지 않도록, 그 판의 모든 조각 (삽입 당 3 조각 = 플레이트 당 21 조각)의 배양 용기 삽입의 상단에서 초과 매체를 대기음. </li><li> 이 포경 함께 수행하지만, 화재 연마 파스퇴르 피펫. 슬라이스가 정착 피펫 팅 전에 분 동안 막에 부착 할 수 있습니다. 최대 피펫으로 슬라이스를 흡입하지 않도록주의하십시오. 슬라이스가 정착하기에 충분한 시간을 허용하기 위해, 제 도금 인서트 유체 제거를 수행한다. </li></ol></li><li> 슬라이스 저장 <ol><li> 37 ° C에서 5.0 % CO 2 인큐베이터에 보관 슬라이스 문화. 그림 1E의 문화의 최종 배열을 관찰한다. 개별 조각은 밑바닥 공막가 배양 용기 삽입시 휴식,이 인서트는 매체의 소량 충전 페트리 접시 안에 맞는; 이것에 의해, 슬라이스 나에 몰입되지 않습니다dium는 있지만 배양 플레이트 인서트의 하단 멤브레인을 통해 액세스 할 수 있습니다. </li><li> 임의로, 배양 접시를 삽입하거나 제거하여 슬라이스를 포함하는 인서트 막의 단면을 잘라내어 수도 연구 중 슬라이스를 제거한다. </li></ol></li></ol></li><li> 유지 보수 <ol><li> 문화를 한 후 일 배양 접시에서 매체를 교환한다. 전송하기 전에 적어도 한 시간 동안 배양기에서 평형화 신선한 배지 1 ㎖를 함유하는 새로운 배양 접시에 배양 플레이트 인서트를 전송합니다. </li><li> 문화를 한 후 셋째 날에 동일한 방식으로 다시 매체를 변경합니다. 셋째 날, 34 ° C로 설정 인큐베이터에 문화를 전송합니다. 두 번 각 주 (모든 3-4일을) 매체를 변경합니다. </li><li> 건강한 문화를 식별합니다. 한 쌍의 전체 세포 레코딩을위한 건강한 문화를 선택합니다. 참고 : 건강한 문화가 잘 정의 된 가장자리와 명확하게 정의 된 피라미드 세포 층이있다. 문화 재치시간의 어두운 (가능성이 괴사) 지역 현재 또는 병합 된 테두리가있는 액포 외관은 거부됩니다. 이러한 기준 채택, 슬라이스 문화의 일반적으로 3 분의 2는 충분히 기록 건강. </li><li> 시간의 매우 작은 창 내에서 이러한 문화를 활용합니다. 신경 세포가 서서히 시간을 악화 약간 간질 동작을 표시하기 시작 이후 2 주 이상 배양 사용되지 조직을 수행합니다. 신경 세포의 생존의 정확한 상한은 알려져 있지 않습니다하지만 문화 피라미드 세포에게 늦게 16 개 주 기능에서 기록 할 수있다. </li></ol></li></ol> 2 쌍으로 전체 셀 녹음 <ol><li> ACSF 및 세포 내 솔루션 <ol><li> 120 글루 콘산 칼륨, 40 HEPES, 5 MgCl2를, 2 NaATP, 0.3 NaGTP (; 290 mOsm 삼투압 KOH으로 pH 7.2) (단위 : mm) 혼합하여 시냅스 전극 솔루션을 준비합니다. 같은 전극 용액이 시냅스 후 뉴런, 세슘 글루코 네이트에 사용되는 동안 (120 mM의) 일반적으로 주요 시냅스 전극에 소금 플러스 5 밀리미터 QX314로 사용됩니다. 참고 :이 시냅스 NMDAR - 중재 전류 8-10,13를 기록하는 양의 전위에서 안정 전압 클램핑을 할 수 있습니다. 또한 기가 옴 밀봉이되기 전에 시냅스 기록 전극에서 흐르는 내부 솔루션에 의해 시냅스 전 신경 세포의 칼륨에 의한 hyperexcitability을 방지 할 수 있습니다. </li><li> (mm 단위) 구성 시냅스 전극 액 120 세슘 글루코 네이트, 40 HEPES, 5를 MgCl 2, 5 QX314,이 NaATP하고, (; 290 mOsm 삼투압 CsOH를하여 pH 7.2) 0.3 NaGTP를 준비합니다. 5 ~ 10 MΩ 저항에 유리 미세 전극을 당겨 여과 내부 솔루션을 입력합니다. </li><li> 인공 뇌척수액 (ACSF) 119 염화나트륨, 2.4의 KCl (mm 단위) 구성을 준비 황산 1.3, 2.4 염화칼슘이, 하나 나 2 HPO 4, 26.2 탄산 수소 나트륨, 95 % O 2, 5로 포화 된 11 포도당, 산도 7.4, %의 CO 2. 주 : R을 AMPAR 매개하는 경우esponses는 NMDAR EPSCs의 검사를 위해 차단해야하는 ACSF에 10 μM C​​NQX 또는 NBQX을 포함한다. </li></ol></li><li> 페어 전체 셀 녹음을 구합니다 <ol><li> 이 개별 뉴런 사이의 시냅스 전달을 조사하기 위해, 시냅스 신경 세포로 하나의 신경 세포를 지정하고 활동 전위를 유도하고 시냅스 전달을 시작하기 위해 현재의 클램프를 누르고 있습니다. </li><li> 시냅스 후 뉴런과 같은 뉴런 제를 지정하고, 연구자에 의해 요구되는 정보에 따라 전류 또는 전압 클램프에 고정. 전압 클램프에서 시냅스 후 뉴런을 잡고 MV 6-16 30에서 조사 -65 MV에서 조사 AMPAR - 매개 EPSCs과 NMDAR - 중재 EPSCs와 글루타메이트 전류의 자세한 검사를 받기 </li><li> 페어링 기록을 설정합니다. 페어링 녹화를 설정하기 위해, 시냅스 전 세포 기록 반드시 여러 순차 시냅스 후 뉴런있게 제 얻어지는 접속 하는 시냅스 하나까지 획득 될D가 얻어진다. 시냅스 가소성 실험을 수행하는 경우, LTP 8,19 필요한 세포질 인자의 유실을 방지하기 전 세포 기록을 얻는 10 분 이내에 시작되어야 시냅스 후 뉴런에서 LTP의 유도로 제 시냅스 전 신경 세포를 얻는 것이 특히 중요하다. </li><li> 운동에 의한 세포의 손실을 피하십시오. 페어링 전 세포 기록을 행하는 주요 과제는 진동과 제 2 기록을 얻는 반면 제 전 세포 기록 움직임 - 유도 방해를 회피한다. <ol><li> 제 전 세포 기록을 구하여 설정된 기록이 모니터 (도 2a)에 표시되는 영역의 가장자리에 위치되도록 한 다음 X-축에서 10 내지 200 μm의 현미경 렌즈를 이동. </li><li> ACSF 여전히 렌즈와의 접촉을 유지하는 보장 ~ 5-10밀리미터을 현미경의 렌즈를 올립니다. 제 2 전극을 마운트하고 (유체 메 니스 커스 (meniscus)에 그림 2B 안내 </strong&gt;). </li><li> 이 렌즈를 통해 빛의 경로 바로 아래에 여전히 크게 기존의 기록 전극 위에까지 xy 평면에 전극을 이동합니다. 전극은 현미경으로 볼 일단 팁이 떨어져 제 1 전극으로부터 멀리 모니터의 가장자리에 확인. </li><li> 양 전극이 같은 초점면에 때까지 현미경의 초점을 순서대로 제 2 전극을 아래로 이동합니다. 그것은 제 전 세포 기록을 중단하도록 정압의 레벨이 너무 강해 팁 막힘을 방지하기에 충분히 강하지 만없는 것이 중요하다. 이것은 먼저 슬라이스 들어가면 전극으로부터 2-3에서 운동 신경원을 유도 정압으로 변환. </li><li> 첫번째 시냅스 기록 (그림 2C)와 비슷한 초점면에서 시냅스 파트너를 찾습니다. 녹화는 일반적으로 첫 번째 연구의 0-200mm 신경 세포에서 CA3 피라미드 뉴런 초 전 세포 사이의 녹음을 쌍의 취득ecording (그림 2C, D). 주 : 신경 쌍 사이 시냅스 전달 최대 3-4 시간의 시간 기간에 걸쳐 안정 이러한 표준 전체 셀에 기록하는 기술을 사용하는 경우. </li></ol></li></ol></li><li> 시냅스 일단 성공적 시냅스 연결 피라미드 세포 쌍 취득시 (도 3a를, B), 시냅스 전달과 가소성의 특성을 조사한다. <ol><li> LTP 유도. <ol><li> 1 분 0 MV (그림 3C) 7-9,12-14에 -10 시냅스 탈분극과 시냅스 활동 전위 (1 ~ 200Hz)를 페어링하여 LTP를 유도한다. 브레이크에서 시냅스 후 뉴런의 10 분 이내에 페어링을 시작합니다. 참고 : LTP는 시냅스 활동 전위로, 1 분 동안 1 Hz에서 시냅스와 시냅스 활동 전위를 페어링하여 현재 클램프에서 열린 두 신경 세포로 유도 할 수는 시냅스 전 신경 세포의 팔에 전류를 주입 다음 10 밀리 초를 유도 </s&gt;입니다. </li></ol></li><li> 또한 5 ~ 10 분 (그림 3C) 9 -55 MV에 시냅스 후 뉴런의 약간의 탈분극과 함께 1 Hz에서 저주파 자극 (LFS)에 의해 LTD를 유도한다. </li></ol></li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+interactions+in+the+induction+of+long-term+potentiation+and+depression+of+synaptic+excitation+between+hippocampal+CA3-CA1+cell+pairs+in+vitro.">Cooperative interactions in the induction of long-term potentiation and depression of synaptic excitation between hippocampal CA3-CA1 cell pairs in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 93 (20), 11225-11230 (1996).</li><li>Malinow, R., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+enhancement+shown+by+whole+cell+recordings+of+long-term+potentiation+in+hippocampal+slices.">Presynaptic enhancement shown by whole cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices.</a> Nature. 346 (6280), 177-180 (1990).</li><li>DeBello, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAP-mediated+protein-protein+interactions+essential+for+neurotransmitter+release.">SNAP-mediated protein-protein interactions essential for neurotransmitter release.</a> Nature. 373 (6515), 626-630 (1995).</li><li>Bekkers, J. M., Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+variability+in+quantal+size+in+cultured+hippocampal+neurons+and+hippocampal+slices.">Origin of variability in quantal size in cultured hippocampal neurons and hippocampal slices.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 87, 5359-5362 (1990).</li><li>Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+between+pairs+of+hippocampal+slice+neurons:+quantal+levels,+oscillations,+and+LTP.">Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations, and LTP.</a> Science. 252, 722-724 (1991).</li><li>Debanne, D., Gu&#233;rineau, N. C., G&#228;hwiler, B. H., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+pharmacology+of+unitary+synaptic+connections+between+pairs+of+cells+in+areas+CA3+and+CA1+of+rat+hippocampal+slice+cultures.">Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures.</a> Journal of Neurophysiology. 73 (3), 1282-1294 (1995).</li><li>Mitra, A., Blank, M., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally+altered+inhibition+in+Ts65Dn,+a+mouse+model+of+Down+syndrome.">Developmentally altered inhibition in Ts65Dn, a mouse model of Down syndrome.</a> Brain Research. 1440, 1-8 (2012).</li><li>Hanson, J. E., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+FMR1+genotype+influences+the+degree+of+synaptic+connectivity+in+a+mosaic+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).</li><li>Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+nature+of+synaptic+circuitry+is+altered+in+area+CA3+of+the+hippocampus+in+a+mouse+model+of+Down's+syndrome.">The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down's syndrome.</a> Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

여기에서 우리는 해마의 Organotypic 슬라이스 문화에 성공적으로 짝을 전체 셀 녹음을 확립하기위한 요구 사항을 설명했다. 짝 녹음은 급성 슬라이스와 해리 문화 시스템 (26, 27)를 포함하여 여러 준비, 수행 ​​될 수있다. 초점은 여기에서 시냅스 가소성 (즉 LTP와 LTD)의 이상 형태의 유도에 왔지만, 짧게는의 Organotypic, 급성 슬라이스에서 해당 쌍 전 세포 녹음을 강조하는 것이 중요하다 세?...

글루타메이트 수용체는 중추 신경계의 시냅스에서 흥분성 시냅스 전달의 대부분을 중재. 시냅스 후 막의 척추 헤드에서 번역 이온 성 글루타메이트 수용체의 두 가지 서브 타입은 N-메틸-D-아스파 테이트 (NMDA)과 α-아미노 -3 - 히드 록시-5 proprionic-4-메틸 아이 산 (AMPA) 수용체이다. 막 전위를 휴식에서 AMPA 수용체는 시냅스 전달하는 동안 시냅스 전류의 대부분을 수행한다. 해마에서, NMDA 수용체가 시냅스 막에서 AMPA 수용체의 수의 변화를 유발에 중요한 역할을한다 : &quot;일치 검출기&quot;로 작용함으로써 하나는 시냅스 강도 하나의 변경을 시작하는, NMDA 수용체는 시냅스 메커니즘에 참여 즉 세포 내 수준에서 학습과 기억을 뒷받침하는 것으로 생각된다. 시냅스 송신기 릴리스에 평행 시냅스 신경 세포의 탈분극에 응답하여, 칼슘 NMDA 통해 입사수용체가 AMPA 수용체의 삽입 또는 제거 2를 시작합니다. 이러한 수용체는 시냅스 역학 소성을 이루는 시냅스 강도의 감소가 장기 우울증 4 (LTD) 동안 시냅스 강도의 증가는 장기 증강 2,3 (LTP)이다. NMDA 수용체는 그것의 제어를 유도하는 것으로 생각되는 반면 따라서 AMPA 수용체 이동은 시냅스 가소성 발현 책임 생각된다. 시냅스 전송 및 소성의 기초가되는 정확한 메커니즘을 결정하는 것은 이상적으로 시냅스의 작은 인구, 하나의 시냅스를 공부해야합니다. 일부 시냅스는 매우 인해 시냅스 연결의 작은 확산 특성이 매우 어렵습니다 대부분의 시냅스 집단이 수준, 예를 들어, 다섯 개최의 꽃받침,에서 연구에 적합하는 동안. 두 주요한 기술은 전기 생리학 단일 시냅스 연결을 검사하기 위해 개발되었다 : 제 최소 자극이며, 어디 있나한 시냅스 섬유 추정된다 전자는 세포 외 자극. 두 번째 기술은 시냅스 연결 뉴런에서 두 개의 동시 전체 셀 녹음이 수행 기록을, 짝. 최소한의 자극의 주요 장점은 동시에 시냅스 후 뉴런에서 촬영하면서 축삭 기관으로 세포 외 자극 전극의 배치를 포함하는, 수행하도록 신속하고 비교적 간단하다는 것이다. 이 기술을 이용하여 주요 관심사는 단일 셀의 신뢰성 자극 거의 시험 후 시험을 보장 할 수 있다는 것이다. 지난 15 년 동안 우리는 정기적으로이 시냅스 연결 피라미드 뉴런 6-17에서 전체 셀 녹음을 쌍으로 사용하고 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단지 하나의 시냅스 전 뉴런이 일관되고 신뢰성있게 자극한다는 것이다. 또한 전기 생리 학적 특성뿐만 아니라, 시냅스 전 뉴런 6,18 &lt;약리학 조작뿐만 아니라 허용/ SUP&gt;. 그러나, 뉴런 사이의 시냅스 연결의 확률은 19 구에 접속 쌍 어렵게 낮다. 의 Organotypic 뇌 슬라이스 배양의 사용은 시냅스 연결 등이 장애물이 시험 관내에서 다시 설정할 수 있고, 더구나 그 결과 연결이 자연 네이티브 뇌 조직 (20)과 유사하다 우회. 또한,의 Organotypic 문화에 가소성 메커니즘을 가능하게 LTP, LTD 7-10,12-15,21 페어링 된 펄스 촉진 (PPF)과 우울증 (PPD) 6,22,23을 포함한 단기 시냅스 가소성을 추가로 표현 뉴런 쌍으로 연구 될 수있다. 여기에서 우리는 성공적으로 시험 관내 시스템에서 한 쌍의 기록을 달성에 관련된 자세한 방법을 설명합니다. 이 정보는 용이 급성 뇌 조각 및 다른 영역을 포함하는 다른 실험 시스템에 적용 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>Minimum Essential Medium</td><td></td><td></td><td>Stable motorized micromanipulators&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin solution&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Shallow tissue bath</td></tr><tr><td>HEPES buffer solution</td><td></td><td></td><td>DIC camera</td></tr><tr><td>1 M Tris stock solution</td><td></td><td></td><td>Amplifier</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution</td><td></td><td></td><td>Computer</td></tr><tr><td>Horse Serum&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Vibration isolation table</td></tr><tr><td>Plastic-coated miniature spatulas</td><td></td><td></td><td>Upright microscope</td></tr><tr><td>Soft paintbrush</td><td></td><td></td><td>Data acquistion and analysis software</td></tr><tr><td>Manual tissue chopper</td><td></td><td></td><td>Electrode puller</td></tr><tr><td>#2 Filter paper</td><td></td><td></td><td>Faraday cage</td></tr><tr><td>#5 Forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membrane inserts</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Class II hood</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

paired whole cell recordings in organotypic hippocampal slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

시냅스 연결이 기록 전극을 통해 탈분극 전류 펄스 (20 밀리 초에 대한 일반적으로 20 ~ 50 씩) 전달하여 활동 전위를 발생하는 시냅스 전 신경 세포를 자극하여 분명하다. 시냅스 현재 추적은 시냅스 활동 전위 (그림 3A)의 피크 후 짧은 (&lt;5 밀리 초)과 일치하는 대기 시간에 유발 monosynaptic EPSC의 존재를 검사합니다. 시냅스 연결 쌍 수득되기 전에 대부분의 실험에서 여러 시냅스 후 뉴런...

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Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

해마의 Organotypic 조각의 쌍으로 전체 셀 녹음

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

paired-whole-cell-recordings-in-organotypic-hippocampal-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.6K 조회수.  University of Auckland. Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

비디오: Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

네크로 텍스의 Organotypic 슬라이스 준비에서 전체 셀 녹음

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

연구

신경과학

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

One of the central tasks in retinal neuroscience is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are responsible for shaping the signals transmitted to the brain. Photons are detected in the retina by rod and cone photoreceptors, which convert that energy into an electrical signal, transmitting it to other retinal neurons, where it is processed and communicated to central targets in the brain via the optic nerve. Important early insights into retinal circuitry and visual processing came from the histological studies of Cajal1,2 and, later, from electrophysiological recordings of the spiking activity of retinal ganglion cells - the output cells of the retina3,4.
A detailed understanding of visual processing in the retina requires an understanding of the signaling at each step in the pathway from photoreceptor to retinal ganglion cell. However, many retinal cell types are buried deep in the tissue and therefore relatively inaccessible for electrophysiological recording. This limitation can be overcome by working with vertical slices, in which cells residing within each of the retinal layers are clearly visible and accessible for electrophysiological recording.
Here, we describe a method for making vertical sections of retinas from larval tiger salamanders (Ambystoma tigrinum). While this preparation was originally developed for recordings with sharp microelectrodes5,6, we describe a method for dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells in which we manipulate the photoreceptor's membrane potential while simultaneously recording post-synaptic responses in horizontal or bipolar cells. The photoreceptors of the tiger salamander are considerably larger than those of mammalian species, making this an ideal preparation in which to undertake this technically challenging experimental approach. These experiments are described with an eye toward probing the signaling properties of the synaptic ribbon - a specialized synaptic structure found in a only a handful of neurons, including rod and cone photoreceptors, that is well suited for maintaining a high rate of tonic neurotransmitter release7,8 - and how it contributes to the unique signaling properties of this first retinal synapse.

We describe the preparation of thin retinal slices from aquatic tiger salamanders (Ambystoma tigrinum) and explain how we use these slices to study synaptic processing in the retina by obtaining dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells.

양서류 망막 슬라이스 준비 광수와 2 차 신경 세포에서 동시에 전체 세포 녹음

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Morphologically- 및 Neurochemically 확인 된 해마의 interneurons에서 전체 세포 패치 클램프 녹음

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

A Model of Epileptogenesis in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slice Cultures

Organotypic slice cultures have been widely used to model brain disorders and are considered excellent platforms for evaluating a drug&#8217;s neuroprotective and therapeutic potential. Organotypic slices are prepared from explanted tissue and represent a complex multicellular ex vivo environment. They preserve the three-dimensional cytoarchitecture and local environment of brain cells, maintain the neuronal connectivity and the neuron-glia reciprocal interaction. Hippocampal organotypic slices are considered suitable to explore the basic mechanisms of epileptogenesis, but clinical research and animal models of epilepsy have suggested that the rhinal cortex, composed of perirhinal and entorhinal cortices, play a relevant role in seizure generation.
Here, we describe the preparation of rhinal cortex-hippocampus organotypic slices. Recordings of spontaneous activity from the CA3 area under perfusion with complete growth medium, at physiological temperature and in the absence of pharmacological manipulations, showed that these slices depict evolving epileptic-like events throughout time in culture. Increased cell death, through propidium iodide uptake assay, and gliosis, assessed with fluorescence-coupled immunohistochemistry, was also observed. The experimental approach presented highlights the value of rhinal cortex-hippocampus organotypic slice cultures as a platform to study the dynamics and progression of epileptogenesis and to screen potential therapeutic targets for this brain pathology.

Here, we describe the preparation of rhinal cortex-hippocampus organotypic slices. Under a gradual and controlled deprivation of serum, these slices depict evolving epileptic-like events and can be considered an ex vivo model of epileptogenesis. This system represents an excellent tool for monitoring the dynamics of spontaneous activity, as well as for assessing the progression of neuroinflammatory features throughout the course of epileptogenesis.

라인 피질-해마 오르가노티픽 슬라이스 배양에서 간질 발생의 모델

Organotypic slice cultures have been widely used to model brain disorders and are considered excellent platforms for evaluating a drug&#8217;s ...

Preparing Acute Brain Slices from the Dorsal Pole of the Hippocampus from Adult Rodents

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of cellular and synaptic properties. Nevertheless, there is an ever increasing need to perform correlated analyses between different experimental modes in addition to slice electrophysiology, for example: immunohistochemistry, molecular biology, in vivo imaging or electrophysiological recording; to answer evermore complex questions of brain function. However, making meaningful conclusions from these various experimental approaches is not straightforward, as even within relatively well described brain structures, a high degree of sub-regional variation of cellular function exists. Nowhere is this better exemplified than in the CA1 of the hippocampus, which has well-defined dorso-ventral properties, based on cellular and molecular properties. Nevertheless, many published studies examine protein expression patterns or behaviorally correlated in vivo activity in the dorsal extent of the hippocampus; and explain findings mechanistically with cellular electrophysiology from the ventro-medial region. This is further confounded by the fact that many acute slice electrophysiological experiments are performed in juvenile animals, when other experimental modes are performed in more mature animals. To address these issues, this method incorporates transcardial perfusion of mature (&#62;60 day old rodents) with artificial cerebrospinal fluid followed by preparation of modified coronal slices including the septal pole of the dorsal hippocampus to record from CA1 pyramidal cells. This process leads to the generation of healthy acute slices of dorsal hippocampus allowing for slice-based cellular electrophysiological interrogation matched to other measures.

The purpose of this protocol is to describe a method to produce slices of the dorsal hippocampus for electrophysiological examination. This procedure employs perfusion with chilled ACSF prior to slice preparation with a near-coronal slicing angle which allows for preservation of healthy principal neurons.

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of ...

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell resolution using electrophysiology, microscopy, and pharmacology. However, a major consideration in the design of in vitro experiments is the extent to which different slice preparations recapitulate naturalistic patterns of neural activity as observed in vivo. In the intact brain, the hippocampal network generates highly synchronized population activity reflective of the behavioral state of the animal, as exemplified by the sharp-wave ripple complexes (SWRs) that occur during waking consummatory states or non-REM sleep. SWRs and other forms of network activity can emerge spontaneously in isolated hippocampal slices under appropriate conditions. In order to apply the powerful brain slice toolkit to the investigation of hippocampal network activity, it is necessary to utilize an approach that optimizes tissue health and the preservation of functional connectivity within the hippocampal network. Mice are transcardially perfused with cold sucrose-based artificial cerebrospinal fluid. Horizontal slices containing the hippocampus are cut at a thickness of 450 &#956;m to preserve synaptic connectivity. Slices recover in an interface-style chamber and are transferred to a submerged chamber for recordings. The recording chamber is designed for dual surface superfusion of artificial cerebrospinal fluid at a high flow rate to improve oxygenation of the slice. This protocol yields healthy tissue suitable for the investigation of complex and spontaneous network activity in vitro.

This protocol describes the preparation of horizontal hippocampal-entorhinal cortex (HEC) slices from mice exhibiting spontaneous sharp-wave ripple activity. Slices are incubated in a simplified interface holding chamber and recordings are performed under submerged conditions with fast-flowing artificial cerebrospinal fluid to promote tissue oxygenation and the spontaneous emergence of network-level activity.

급성 마우스 뇌 슬라이스 자발적인 해 마 네트워크 활동을 조사

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in molecular, anatomical and functional criteria suggesting a division into different sub-circuits along its rostro-caudal extent. Owing to differential connectivity and function the most fundamental distinction is made between the dorsal and the ventral hippocampus, which are preferentially involved in spatial and emotional processing, respectively. Accordingly, in vivo work regarding spatial memory formation has focused on the dorsal hippocampus.
In contrast, electro-physiological in vitro recordings have been preferentially performed on intermediate-ventral hippocampus, largely motivated by factors like slice viability and circuit integrity. To allow for direct correlation of in vivo data on spatial processing with in vitro data we have adapted previous sectioning methods to obtain highly viable transverse brain slices from the dorsal-intermediate hippocampus for long-term recordings of principal cells and interneurons in the dentate gyrus. As spatial behavior is routinely analyzed in adult mice, we have combined this transversal slicing procedure with the use of protective solutions to enhance viability of brain tissue from mature animals. We use this approach for mice of about 3 months of age. The method offers a good alternative to the coronal preparation which is frequently used for in vitro studies on dorsal hippocampus. We compare these two preparations in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

We present a protocol to prepare acute-slices from the dorsal-intermediate hippocampus of mice. We compare this transversal preparation with coronal slicing in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

성인 마우스의 덴테이트 자이루스에서 전신 기록 및 신경 재건을위한 등산 해마에서 급성 슬라이스의 준비

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in ...

Photostimulation and Whole-Cell Patch Clamp Recordings of Neurons in Mouse Hippocampal Slices

Source: Richevaux, L., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59534">In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2019)
The video demonstrates a protocol to study synaptic interactions and neuronal responses in a transfected mouse hippocampal brain slice. It involves illuminating long-range sensory neurons to trigger action potentials and recording the resulting excitatory post-synaptic potentials in the recorded neuron using the whole-cell patch-clamp technique.

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Solutions for acute slice ...