그림 5A에 표시된 수석을 추적하는 그레이스 디온;이 작품은 또한, 우리는 수술 절차에 도움을 마 Petrella 감사 국립 안과 연구소 R01EY017925과 R21EY020985과 데이 &amp; 화이트 홀 재단에서 PK까지 자금의 보조금에 의해 지원되었으며, Pratik Chhatbar에 대한 원고에 대한 의견.

1. 외과 준비 <ol><li> 마취를 유도하고 지속적으로 심장 박동을 모니터링 갯벌 CO 2, EEG, 온도를 모두 종료합니다. 모든 절차는 사우스 캐롤라이나의 의과 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다 우리는 이전에 9,15을 발표 이들에 기초했다. </li><li> 메스 블레이드로 피부를 절단하여 두개골의 등 표면을 쉽게받을 수 있습니다. Brudon의 퀴렛를 사용하여 뼈를 놓인 결합 조직을 해부. 면 스쳐 applicators과면 거즈를 사용하여 뼈를 청소합니다. 작은 사자의 정맥을 통해 가끔씩 출혈을 멈추게하기 위해 두개골에 뼈 왁스 (필요에 따라) 적용됩니다. </li><li> 검은 색 페인트 (자료 참조)과 혼합 치과 시멘트를 사용하여 두개골 (craniotomy을 수행 할 것입니다 관심 지역 이상)에 티타늄 스테인레스 스틸 헤드 판을 연결합니다. 머리 판의 중앙에 사각형 오픈 craniotomy에 대한 액세스 및 광학 이미징을 제공합니다. 머리 판 위에 금속 챔버를 연결합니다. 이 챔버는 물 침적 목적 렌즈와 이미징을위한 유체 저수지 역할을합니다. </li><li> 금속 게시물을 사용하여 XY 스테이지에 헤드 판을 고정합니다. </li><li> 치과 드릴을 사용하여 headplate의 사각형 오픈에서 뼈의 넓은 지역을 희석. 얇게 할 영역은 잘 계획 craniotomy의 경계를 넘어 확장해야합니다. craniotomy 사이트에서, 뼈의 두께가 coverglass과 neocortical 표면 사이의 아가로 오스의 두께를 지시하기 때문에 고해상도 이미지가 네크로에서 획득 할 경우 비 쥐 포유류의 두꺼운 두개골은 (아래 참조) 얇게해야합니다 . </li><li> craniotomy의 뼈에서 2 X 2mm 광장 윤곽을 뚫는다. 뼈 조각을 제거하고 기본 피질에 열 손실을 최소화하기 위해 새로운 인공 뇌척수 (ACSF)에 정기적으로 실을 씻어. 필요에 따라 가끔씩 출혈을 멈추게하기 위해 뼈 왁스를 적용합니다. </li><li> 난생t # 3 포셉과 뼈 플랩. </li><li> 제외한 모든 좋은 포셉 (# 5CO)와 Vannas 스프링 가위를 사용하여 경질의 맨 아래 레이어를 제거합니다. 비 쥐 포유류의 경질은 두껍고 불투명하지만 서로 다른 층으로 제거 할 수 있습니다. 출혈은 드문이지만, Gelfoam으로 중단 할 수 있고 어떤 혈흔이 부드럽게 경질는 포셉을 사용하고 ACSF와 린스의 나머지 계층에서 제거해야합니다. 경질의 마지막 층은 투명하고 pial 선박은 확실하게 표시됩니다. 고유 신호 이미징 동안 경질의 최종 레이어를 그대로두면 (토론 참조) 실험 이후 두 광자 이미징 단계에 형광 칼슘 지표 대량로드의 성공 속도를 증가 할 것이다. </li><li> 따뜻한 2% 아가로 오스 (ACSF에 용해)의 드롭을 적용하고 즉시 craniotomy을 통해 coverglass를 놓습니다. 호흡기 및 심장 혈관 pulsations은 수술 해부 현미경이나의 oculars 사용하여 최소한 있는지 확인하기 위해 craniotomy을 확인 두 -밝은 분야 모드에서 광자 현미경. </li></ol> 2. 고유 신호 광학 이미징 <ol><li> 고유 신호 이미징 동안 건조에서 아가로 오스를 방지하기 위해 coverglass의 바깥 주위에 ACSF로 적셔 젤 거품을 추가합니다. </li><li> 두 광자 현미경 (그림 1) 위의 표준 C-마운트 포트에 고유 신호 이미징 CCD 카메라를 연결합니다. XY 스테이지 (그림 1A) 근처의 공기 테이블에 조명 광원을 배치합니다. 위치 및 craniotomy 및 headplate / 챔버 (그림 1B)를 통해 빛 가이드를 확보. 고유 신호에 필요한 반사 붉은 빛이 CCD 카메라 (그림 1C-D)에 craniotomy에서 직접 통과 할 수 있도록 기본 이색 성 및 C-마운트 포트 아래에있는 거울을 취소. 4 배 공기 목적 (0.13 NA, 17mm WD),보기의 2 X 2mm 필드를 사용하면 고유 신호 이미징 사용할 수 있습니다. </li><li> 리터에 열 필터를 삽입난방에서 피질을 방지하기 위해 항공 경로를 설정합니다. 녹색 빛 (546 nm의 중심 λ)와 대뇌 피질의 표면 혈관의 디지털 참조 이미지를 기록을 통과 필터를 사용합니다. </li><li> 대뇌 피질의 표면 아래 500 μm로 Z 포커스를 이동합니다. 고유 신호를 측정하는 피질을 밝히는 빨간색 필터 (630 nm의 중심 λ)를 사용합니다. 대뇌 피질의 표면이 균일하게 조명되는 등의 빛 가이드를 배치합니다. 시각적 자극 디스플레이에 의​​해 발생 된 빛에서 craniotomy을 보호. 시각적 자극과 기록 반사율 데이터 이미지의 순서를 제시한다. 10 분 내에 오리엔테이션지도를 생성하려면, 8 자극 (각 방향 4 방향 및 두 방향)의 순서 4 반복에 해당하는 데이터를 수집합니다. </li><li> 거짓 컬러 방향지도를 생성하는 고유 신호 데이터를 분석합니다. 뉴런의 두 광자 라벨, 예를 들어, 오리엔테이션 바람개비의 이론에 대한 잠재적 타겟 지역 선택 -지도에서 지점 위치모든 기본 방향은 (그림 2A) 수렴. 오리엔테이션지도와 대뇌 피질의 표면 vasculature (그림 2B-C)의 이미지를 입혀 라. 대형 혈관과 arterioles 15 위치를 피하고 대상을 선택 기능 도메인 및 대형 표면 선박의 위치의 레이아웃을 사용합니다. </li></ol> 3. 형광등 칼슘 지표의 대량로드 <ol><li> 5 μl DMSO에 1g의 Pluronic을 추가하여 20 % Pluronic / DMSO의 솔루션을 준비합니다. 완전히 Pluronic를 해산하기 위해 10 분 동안 60 ° C에서 혼합물을 가열. 혼합물이 실내 온도에 냉각 할 수 있습니다. 형광 칼슘 표시기 오레곤 그린 488 Bapta-1시 (AM OGB-1)의 50 μg의 유리 병에 Pluronic / DMSO 혼합물의 4 μl를 추가합니다. 그런 다음 빨간색 염료 (알렉사 형석 594, 2 MM 주식 솔루션) 1 μl와 OGB - 새벽 1 시까 지 1 ㎜의 최종 농도에 대한 피펫 솔루션의 35 μl를 (자료 참조) 추가 할 수 있습니다. 에 ½ 시간에 대한 솔루션을 Sonicate차가운 물 목욕 후 불순물을 제거 할 필터 0.45 μm와 원심 분리기. </li><li> 2.0-2.5 μm의 외부 팁 직경 긴 테이퍼 피펫을 당겨. 피펫으로 염료 혼합물의 5 μl를로드합니다. </li><li> 피펫 삽입을 용이하게하고 최고 품질의 두 광자 이미지를 얻을 경질의 마지막 층을 제거합니다. </li><li> 피펫은 대뇌 피질의 레이어 3분의 2 년에 목표에 도달하기 위해 배치해야하는 대뇌 피질의 표면에 정확한 위치를 결정합니다. 우리 미리 대뇌 피질의 목표는 방향지도 (그림 2)에 바람개비 특이점입니다. 피펫은 챔버 벽과 목적 사이를 통과하기 위해 30 ° 각도로 피질로 구동해야합니다. 따라서, 200 μm 대뇌 피질의 표면 아래에 대상 지역을 라벨, 대뇌 피질의 표면에 피펫 항목 위치가 대상 위치 (그림 3 AB)에 측면 약 350 μm 될 것입니다. </li><li> (XY 스테이지를 이동하는 동물과 Pipette의 micromanipulator은 센터 목적 (그림 3C)에서 대뇌 피질의 표면 입력 위치에) 배치됩니다. 피펫 쉽게 craniotomy의 벽을 따라 목적이나 뼈를 건드리지 않고도 피질을 입력 될 수 있도록 최소 3 ㎜ (자료 참조) 작동 거리 (WD)으로 20x 또는 40x 목표를 사용합니다. 항목의 위치는 목표 아래 중앙되면, 2mm (그림 3D)에 의해 목표의 Z 위치를 올립니다. 녹색 에피 형광 빛이 피펫에 빨간색 알렉사 염료를 시각화에 대한 설정으로, (그 팁을 중심으로 될 때까지 직접 대뇌 피질의 표면 항목 위치 위의 목적에 따라 (그리고 집중) 피펫을 이동 micromanipulator의 대각선 축를 사용하여 그림 3E). </li><li> 지속적으로 ocu을 통해 피펫 팁을 보면서 피펫은 대뇌 피질의 표면 (그림 3 층)에 도달 할 때까지 피펫 수직을 (Z 축을 따라) 낮 춥니 다현미경의 라스 요. 밝은 분야 조명을 사용하여 대뇌 피질의 표면 혈관과 남아있는 수막 멤브레인 (피아와 거미집 모양의)는 피펫은 대뇌 피질의 표면을 접근으로 쉽게 볼 수 있습니다. 피펫가 원하는 항목 위치에 도달하지 않는 경우, 피펫을 마련하고 대뇌 피질의 표면에 혈관 랜드 마크를 기반으로 타겟팅을 재조정. </li><li> 목표를 제거 craniotomy에서 초과 중추 신경계를 등심과 보푸라기가없는 흡수 창을 사용하여 인접한 뼈를 건조. craniotomy (그림 3G)를 통해 볼 수 있습니다 피질을 안정하는 따뜻한 3퍼센트 아가로 오스 (ACSF에 용해)의 방울을 적용합니다. 비 설치류에서 3% 아가로 오스는 뉴런의 형광 염료의 성공적인 이해에 pulsations을 저해 할 필요가 있습니다. 2퍼센트 아가로 오스와 coverglass의 조합에 필요한 안정성을 제공하기 때문에 고유 신호를 광 이미징의 경우 불과 2 %의 아가로 오스가 필요합니다. 여기 더 coverglass는 3% 아가로 오스 그래서 염료로드 단계를위한 것입니다 사용되지 않습니다필요. 아가로 오스가 확정 된 후 ACSF과 챔버를 40x 목표를 삽입 (0.8 NA, 3.3 mm WD)하고 다시 작성하십시오. </li><li> 밝은 분야의 두 광자보기로 전환하여 피펫 팁을 찾습니다. 그 끝이 피질 (그림 3H)에서 원하는 깊이를 도달 할 때까지 micromanipulator의 대각선 축를 사용하여 피펫 이동합니다. 염료 혼합물 (몇 PSI, 각 펄스 0.1 초)의 수시 압력 분출 퍼프는 막힘에서 피펫 팁을 방지하는 데 도움이됩니다. OGB-1은 세포를 입력시 표시됩니다 AM 때문에, 붉은 알렉사 염료는 피질 내부의 피펫 팁의 시각화를 위해 중요합니다. </li><li> 피펫 팁의 깊이를 확인하는 대뇌 피질의 표면에 재 집중, 염료의 전체 용량과 목표를 대뇌 피질의 층 3분의 2의 뉴런을로드하고 끝이의 레이아웃에 따라 대상 위치에 있는지 확인하기 전에 표면 혈관. 피펫은 레이어 3분의 2 인 경우, 염료 혼합물의 작은 퍼프가를 조명한다세포 공간과 어두운 그림자처럼 원형 세포 기관의 조밀 한 조립을 알 수있다. </li><li> 대뇌 피질 300-600 μm 직경의 영역에 neuronal 세포의 시체를로드를 들어, 30-90 펄스, 각 펄스 1.0 초, 2-10 PSI를 사용하여 세포 공간으로 염료 혼합물을 주입. 압력 펄스는 조직 움직이 너무 강한 안됩니다. 주입이 완료되면, 몇 분 기다린 다음 피펫과 목표를 제거합니다. OGB-1 뉴런에 의해 완벽하게 촬영 업 할 수 있도록 오전 1 시간 기다립니다. </li><li> 염료로드에 사용 된 아가로 오스를 제거하고 녹음 챔버를 씻어. 표면에 2~3% 아가로 오스의 작은 방울을 넣고 빠르게 craniotomy을 통해 coverglass를 놓습니다. 형광 염료가 빛에 민감한 때문에, 밝은 필드 또는 에피 형광등에 피질이 과잉 노출하지 마십시오. XY 단계를 사용하여 목적에 따라 목적 홀더 및 재 중심이라는 대뇌 피질의 영역으로 높은 NA (1.0) 20x 목표를 넣습니다. 예에서 craniotomy을 보호traneous 광원, 예를 들어, 시각 자극 디스플레이, 정전 소재의 여러 레이어를 사용합니다. </li></ol> 4. 형광 염료의 단일 셀 Electroporation <ol><li> 수지상 형태를 연구의 경우, 100 μM 알렉사 형석 594 (2 MM 알렉사 형석 594 주식 ACSF에 1시 20분 희석)의 솔루션을 준비합니다. 수석의 기능 이미징을위한 OGB 소금은 16,17을 사용할 수 있습니다. </li><li> 1 μm의 끝 크기가 긴 테이퍼 피펫을 뽑아 피펫으로 염료의 5 μl를로드합니다. 기능 도메인을 타겟팅하는 다른 모든 단계를 대량로드 방법 (그림 1-3)과 동일합니다. neuronal 전지 본체 막에 인접한 피펫 팁을 위치, 전극 임피던스의 증가를 모니터링하고 세포 공간을 조명하고 두 광자 이미징 동안 그림자처럼 세포의 시체를 볼 수있는 염료의 압력 퍼프를 적용 할 수 있습니다. </li><li> 피펫 팁은 neuronal 전지 본체 막에 인접한 경우, 적용 할 Axoporator 800A를 사용1-3 펄스 (-8에 -10 V, 10 밀리 초 펄스). 염색과 신경의 즉각적인 충전이 두 광자 현미경으로 쉽게 시각화입니다. 피펫를 제거하고 생체의 수석과 axons의 고해상도 이미지를 수집합니다. </li></ol>

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

우리는 네크로의 미리 정해진 기능 마이크로 도메인에 neuronal 세포 기관 (또는 수석과 axons)의 라벨을 타겟팅하는 방법을 제시한다. 두 광자 현미경과 고유 신호 광학 이미징을 병합하는 시냅스와 세포가 어떤 기능지도의 마이크로 도메인에 기여하는 결정의 가능성을 제공 여부 기능지도에서 뉴런의 위치, 그리고 neuronal 회로와 neuronal 선택성의 상호 구성 요소를 시각적 경험 7 임상 치료 ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 1. 생활 지원 / 실험 사립 </td></tr><tr><td> Isoflurane </td><td> 웹스터 뇌려 </td><td> NDC 57319-474-05 </td><td></td></tr><tr><td> Isoflurane vaporizer </td><td> Midmark </td><td> VIP 3000 </td><td></td></tr><tr><td> 의견 조절 난방 담요 </td><td> 하버드 장치 </td><td> 50 7079F </td><td></td></tr><tr><td> ECG 모니터 </td><td> Digicare 생명 </td><td> LifeWindow 라이트 </td><td></td></tr><tr><td> EEG 증​​폭기 </td><td> AM 시스템 </td><td> 1800 </td><td></td></tr><tr><td> EEG 디스플레이 모니터 </TD&gt; <td> 휴렛 패커드 </td><td> 78304A </td><td></td></tr><tr><td> 갯벌 CO 2 모니터를 종료 </td><td> Respironics </td><td> Novametrix Capnoguard 1265 </td><td> 환기를 최적화 </td></tr><tr><td> 드릴링 뼈에 초경 드릴 burrs </td><td> 헨리 Schein </td><td> 고급 (0.5 mm 팁) 및 정밀 (1.25 mm 팁) </td><td></td></tr><tr><td> headplate / 챔버 용 시멘트 </td><td> Dentsply </td><td> 675571, 675572 </td><td></td></tr><tr><td> 블랙 파우더 온도 그림판 </td><td> 사전 트 아트 주식회사 </td><td> 22-7185 </td><td> 빛 차폐을 개선하기 위해 시멘트 반사를 줄이기 위해 추가 </td></tr><tr><td> 아가로 오스 - 유형 III-A </td><td> 시그마 </td><td> A9793 </td><td> 고유 신호와 두 광자 이미징 동안 pulsations을 최소화하기위한 </td></tr><tr><td> Coverglass : 5 또는 8 밀리미터 직경 0.17 mm의 두께 </td><td> 의 세계 정밀struments </td><td> 502040, 502041 </td><td> 영상 중에 pulsations을 최소화 들어, coverglass이 필요로 절단 할 수 있습니다 </td></tr><tr><td> Brudon의 curettes </td><td> 조지 Tiemann </td><td> 105-715-0, 105-715-3 </td><td> 두개골 표면을 청소 </td></tr><tr><td> 뼈 왁스 </td><td> Ethicon </td><td> W31G </td><td> 신속하게 출혈이 멈추지 </td></tr><tr><td> 면화는 작은 주걱 줬 </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 72308-05 </td><td> 깨끗하고 마른 뼈 표면 </td></tr><tr><td> 뒤몽 # 5CO 집게 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 11295-20 </td><td> 경질 또는 PIA의 개별 레이어를 잡아 </td></tr><tr><td> Vannas 봄 가위 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 15000-03 </td><td> 컷 경질 </td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> 화이자 </td><td> 09-0396-05 </td><td> 경질에 출혈을 중지하려면 </td></tr><tr><td> 흡수 스피어스</td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 18105-01 </td><td> CSF의 초 신속하고 보푸라기가없는 wicking </td></tr><tr><td> 정전 재료 </td><td> Thorlabs </td><td> BK5 </td><td> 방패 craniotomy </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 2. 준비 / 주사를 물들이다 </td></tr><tr><td> 디메틸 Sulphoxide (DMSO) </td><td> 시그마 </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic </td><td> 시그마 </td><td> P2443 </td><td></td></tr><tr><td> 오레곤 그린 488 Bapta - 오전 1시 </td><td> Invitrogen </td><td> O6807 </td><td> 칼슘 표시기 </td></tr><tr><td> 알렉사 형석 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A10438 </td><td></td></tr><tr><td> 원심 필터 (0.45 μm의 기공 크기) </td><td> Millipore </td><td> UFC30HV00 </td><td> 주사하기 전에 불순물을 제거하려면 </td></tr><tr><td> 유리 피펫 풀러 </td><td> 셔터 악기 </td><td> P97 </td><td></td></tr><tr><td> 붕규산 유리는 (1.5 mm 외경) 모세관 filamented </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 1B150F-4 </td><td> 염료 분출 피펫 </td></tr><tr><td> Microloader </td><td> Eppendorf </td><td> 5242 956 003 </td><td> 피펫으로 염색을로드하는 동안 </td></tr><tr><td> Micromanipulator </td><td> 셔터 악기 </td><td> MP-285 </td><td> 피펫을 배치하려면 </td></tr><tr><td> 압력 펄스 컨트롤러 </td><td> 파커 Hannifin </td><td> PicoSpritzer III </td><td> 염료의 압력 분사에 대한 </td></tr><tr><td> 단일 셀 electroporator </td><td> 분자 장치 </td><td> Axoporator 800A </td><td> 염료의 electroporation에 대한 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 3. 고유 한 IMAging </td></tr><tr><td> 4 배 목표 (0.13 NA, 17mm WD) </td><td> 하늘 </td><td> UPLFLN4X </td><td></td></tr><tr><td> 내장 하드웨어 / 소프트웨어 </td><td> 광학 이미징 주식회사 </td><td> 영상 3001 / VDAQ </td><td> VDAQ 소프트웨어는 삽화 이미지에 사용됩니다 </td></tr><tr><td> CCD 카메라 </td><td> Adimec </td><td> Adimec-1000 </td><td></td></tr><tr><td> 광원 전원 공급 장치 </td><td> 한전 </td><td> 15 15M를 ATE </td><td></td></tr><tr><td> 광원 </td><td> 광학 이미징 주식회사 </td><td> HAL 100 </td><td> 대뇌 피질의 표면에서 빛의 세기 3-5 MW입니다 </td></tr><tr><td> 그린 필터 (혈관 이미지) </td><td> 광학 이미징 주식회사 </td><td> λ = 546 nm의 (밴드 패스 30 nm의) </td><td> 표면 vasculature의 참조 이미지 </td></tr><tr><td> 레드 필터 (고유 신호) </td><td> 광학 ImagiNG 주식회사 </td><td> λ = 630 nm의 (밴드 패스 30 nm의) </td><td> 고유 신호를 수집하려면 </td></tr><tr><td> 열 필터 </td><td> 광학 이미징 주식회사 </td><td> KG-1 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 4. 두 광자 장비 / 영상 </td></tr><tr><td> 두 광자 현미경 및 소프트웨어 </td><td> 프레리 기술 </td><td></td><td> 빛 경로, 필터 및 레이저 힘이 센지 외. 2,012을 참조하십시오 </td></tr><tr><td> 티 : 사파이어 레이저 </td><td> 스펙트럼 - 물리 </td><td> 마이 타이 XF </td><td></td></tr><tr><td> 20x (0.5 NA, 3.5 mm WD) </td><td> 하늘 </td><td> UMPLFLN20X </td><td> 0.5 NA 목표는 (아니라 2 광자 이미징 용) craniotomy을 통해 피펫을 정렬으로 만 사용됩니다 </td></tr><tr><td> 20x (1.0 NA, 2.0 mm WD) </td><td> 하늘 </td><td> XLUMPLFLN20X </td><td></td></tr><tr><td> 40x (0.8 NA, 3.3 mm WD) </td><td> 하늘 </td><td> LUMPLFLN40X/IR </td><td></td></tr><tr><td> 에어 테이블 </td><td> 뉴 포트 (Newport) </td><td> ST-200 </td><td> 외부 진동의 준비를 분리 </td></tr><tr><td> XY 스테이지 </td><td> 마이크의 기계 (주) (Attleboro, MA) </td><td></td><td> XY 스테이지에 배치 실험 주제와 셔터의 micromanipulator </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> 요리법 </td></tr><tr><td> 인공 Cerebro - 척수 </td><td> NaCl (135 ㎜), KCl (5.4 ㎜), MgCl 2 (1.0 ㎜), CaCl 2 (1.8 ㎜), HEPES (5 ㎜), pH를 7.4 </td></tr><tr><td> 피펫 솔루션 14 </td><td> NaCl (150 ㎜), KCl (2.5 ㎜), HEPES (10 ㎜), pH를 7.4 </td></tr></tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted labeling of neurons in a specific functional micro-domain of the neocortex by combining intrinsic signal and two-photon imaging

비 쥐 포유류의 주요 시각 피질에서 뉴런은 같은 방향 1-4, 방향 5-7, 안구 지배력 8,9와 쌍안경 격차 구 등의 자극 기능에 대한 자신의 선호에 따라 클러스터됩니다. 오리엔테이션 선택성이 가장 널리 연구 기능 및 원하는 방향의 준주기적인 레이아웃과 지속적인지도 전체 기본 시각 피질 10,11에 걸쳐 존재합니다. 이 기능지도에 자극 선택적 응답을 초래할, 신경 세포 및 네트워크 기여를 통합하면 mm 공간적 스케일로 하위 미크론에 걸쳐 이미징 기술의 하이브리드가 필요합니다. 기존의 고유 신호를 광 이미징을 통해 시각 피질의 전체 표면에 걸쳐 기능지도의 전체적인 레이아웃은 12 결정될 수있다. 칼슘 민감한 염료를 사용하여 생체 내 두 광자 현미경의 개발은 synapt을 결정하는 하나를 수IC의 입력은 개별 neuronal 세포 기관 6,14 수백에서 동시에 각각의 수지상의 쪽에서 13 또는 기록 활동을 도착. 따라서, 두 광자 현미경의 하위 마이크론 공간 해상도로 고유 신호 영상을 결합하는 것은 수지상 세그먼트 및 세포 네크로의 모든 기능지도의 마이크로 도메인에 기여하는 정확히 결정의 가능성을 제공합니다. 여기 빠르게 대뇌 피질의 방향지도를 취득하고 비 쥐 포유류에 형광 염료와 뉴런을 라벨이 기능지도의 특정 마이크로 도메인을 타겟팅 할 수있는 높은 수율 방법을 보여줍니다. 두 광자 이미징에 사용 된 것과 같은 현미경으로, 우리는 먼저 고유 신호 광학 이미징을 사용하여 오리엔테이션지도를 생성합니다. 그럼 우리가 어느 라벨을 염료로로드 micropipette를 사용하여 관심있는 마이크로 도메인을 타겟팅하는 방법을 보여 neuronal 세포 기관 또는 라벨 수석, 쪽과 axons은에서 볼 수있는 그러한 하나의 뉴런을의 인구생체. 앞의 방법을 넘어 개선이 neocortical 기능 아키텍처의 프레임 워크의 하위 세포 해상도 neuronal 구조 - 기능 관계의 시험을 용이하게합니다.

우리 염료 라벨 방법의 정밀도를 설명하기 위해, 우리는 비 쥐 네크로에 알려진 기능지도의 가장 작은 마이크로 도메인을 대상으로. 띄엄 띄엄 이론은 기본 영상 피질의 방향지도를 통해 끝까지. 이들은 모두 원하는 방향 이러한 수렴 지점에서 발생하는 선호하는 취향, &quot;풍차&quot;(그림 2A-B)와 같은 특이한 모양 주변 지역의 위색지도 인치 craniotomy 당 하나의 바람개비는 특히 15<...

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Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

방법은 네크로의 미리 결정된 기능 마이크로 도메인에 형광 염료와 뉴런을 라벨에 설명되어 있습니다. 첫째, 고유 신호 광학 이미징은 기능지도를 얻을하는 데 사용됩니다. 그런 다음 두 광자 현미경은지도의 마이크로 도메인 내에서 라벨 및 이미지 뉴런하는 데 사용됩니다.

특정 기능 내장 신호를 결합하여 네크로의 마이크로 도메인과 투 광자 영상에서 뉴런의 대상 라벨링

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K 조회수.  Medical University of South Carolina. 방법은 네크로의 미리 결정된 기능 마이크로 도메인에 형광 염료와 뉴런을 라벨에 설명되어 있습니다. 첫째, 고유 신호 광학 이미징은 기능지도를 얻을하는 데 사용됩니다. 그런 다음 두 광자 현미경은지도의 마이크로 도메인 내에서 라벨 및 이미지 뉴런하는 데 사용됩니다.

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In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

두 광자 현미경을 사용하여 마우스 척수의 생체내 이미징에

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

연구

신경과학

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

내생 NADH 형광의 2 광자 이미징에 의한 마우스 대뇌 피질의 Microregional Hypoxia의 탐지

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

역행 형광 라벨이 확인 된 신경 세포의 표적 세포 외 단일 단위 기록을 허용<em&gt; 생체 내</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

마우스 척수의 세포 역학의 두 광자 이미징

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

두뇌 조각에서 신경 모 수석에서 2 광자 칼슘 이미지

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

두 광자 레이저와 Zebrafish 애벌레의 칼슘 이미징 및 행동 녹화를 사용 하 여 평가 사용 하 여 신경 인구의 제거

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Vivo에서 신생아 쥐에 있는 대뇌 피 질의 뉴런의 두 광자 영상

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous variability and heterogeneity (age, gender, type of trauma, other possible pathologies, etc.), animal models play a key role in unraveling factors that are limitations in clinical research. They provide a standardized and controlled setting to investigate the biological mechanisms of injury and repair following TBI. However, not all animal models mimic the diffuse and subtle nature of mTBI effectively. For example, the commonly used controlled cortical impact (CCI) and lateral fluid percussion injury (LFPI) models make use of a craniotomy to expose the brain and induce widespread focal trauma, which are not commonly seen in mTBI. Therefore, these experimental models are not valid to mimic mTBI. Thus, an appropriate model should be used to investigate mTBI. The Marmarou weight drop model for rats induces similar microstructural alterations and cognitive impairments as seen in patients who sustain mild trauma; therefore, this model was selected for this protocol. Conventional computed tomography and magnetic resonance imaging (MRI) scans commonly show no damage following a mild injury, because mTBI induces often only subtle and diffuse injuries. With diffusion weighted MRI, it is possible to investigate microstructural properties of brain tissue, which can provide more insight into the microscopic alterations following mild trauma. Therefore, the goal of this study is to obtain quantitative information of a selected region-of-interest (i.e., hippocampus) to follow up disease progression after obtaining a mild and diffuse brain injury.

The overall goal of this procedure is to obtain quantitative microstructural information of the hippocampus in a rat with mild traumatic brain injury. This is done using an advanced diffusion-weighted magnetic resonance imaging protocol and region-of-interest based analysis of parametric diffusion maps.