Name: isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes
Uploaded: 2013-09-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
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우리는 교수의 명예 장 클로드 Perriard과 에블린 Perriard 신생아 쥐와 쥐 심근을위한 절연 기술에 도입 (기술, 스위스 스위스 연방 공업 대학)에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 그들의 지원을 위해 교수 후아 첸 교수 실비아 에반스 (UCSD, 미국)에게 감사의 말씀을 전합니다. EE의 실험실에서 작업 MRC 경력 설립 교부금에 의해 투자되었다. SL은 NIH / NHLBI (HL107744)에서 독립 수상에 K99/R00 경로에 의해 지원된다. TMM은 미국 심장 협회 (American Heart Association, 11POST7310066)에서 박사 학위 취득 후 친교에 의해 지원되었다.

다음 절차는 신생아 마우스 심근의 분리 및 문화에 대한 이틀간의 프로토콜 (16, 17)에 대해 설명합니다. 모든 솔루션은 살균 또는 멸균 필터링됩니다. 모든 공구는 75 %의 에탄올로 표면을 살균 소독한다. 초기 티슈 추출을 제외하고, 모든 단계는 무균 층류 세포 배양 후드에서 수행된다. 이 프로토콜은 하나, 둘, 쓰레기 (들)에서 신생아 마우스 마음의 분리를위한 것입니다 - 약 5-14 새끼,하지만 더 큰 쓰레기의 크기와 쥐 신생아 심근을 위해 구성 될 수있다. 적절한 규모의 미디어 / 효소 사용. 신생아 설치류와 작업의 경우, 의회 및 / 또는 동물 관리 프로그램에 의해 규정 된 지역 대학 지침 및 규칙을 참조하여 제도적으로 승인 된 동물 프로토콜을 준수. 이 프로토콜에 설명 된 모든 방법은 UC 샌디에고 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을, 그리고 FEDE에 부착 된RAL 및 주 규정. 1 일. 1. 신생아 쥐의 심장 조직의 분리 <ol><li> 20 mM의 BDM 6-8로 보충 (칼슘 2 +, Mg를 2 +없이) 1X PBS 50 ㎖를 준비하고, 얼음에 배치 된 두 개의 멸균 세균 요리에 분산. </li><li> 50 ㎖ 멸균 원뿔 팔콘 튜브에 격리 매체의 10 ㎖를 준비합니다. 얼음에 모든 솔루션을 유지합니다. 그리고 집게 (곡선, 뒤몽 7 번), 가위 (하나의 직선 곡선을) 소독. </li><li> 1-3일 된 신생아 마우스는 표면 살균에 대한 75 %의 에탄올 용액에 신속하게 세척된다. 새끼는 멸균 가위 (직선)을 사용하여 참수하고, 가슴은 흉강에 대한 액세스 및 심장 (그림 1A, 보충 영화 S1)을 허용하는 흉골을 따라 열립니다. 기술 코멘트 : 3 일 이전의 신생아 마우스는 사용하지만, 적은 가능한 세포 2 발생할 수 있습니다. </li><li> 하츠에서 추출곡선 가위로 몸과 20 mM의 BDM과 (칼슘 2 +, Mg를 2 +없이) 1X PBS를 포함하는 박테리아 접시에 즉시 전송, 얼음. 모든 다음 단계는 무균 세포 문화 후드에서 수행됩니다. </li><li> (원하는 경우, 및 심방) 폐 조직, 큰 혈관을 제거합니다. 1X PBS 용액에 세척 하트 (칼슘없이 2 +, Mg를 2 +) 20 mM의 BDM (얼음)와 혈액을 제거합니다. 전송 20 MM (얼음) BDM 집게를 사용하거나 구멍 스푼 (그림 1B)와 (칼슘 2 +, Mg를 2 +없이) 1X PBS를 포함하는 두 번째 박테리아 접시에 첫 번째 접시에서 마음을 씻어. </li><li> 전송 청소 / 절연 매체의 드롭 (약 250 μL, 그림 1C)에 마음을 세척 (얼음) 세 번째 박테리아 접시에 작은 조각 (약 0.5 mm 3 이하로 마음을 말하다 곡선 가위를 사용한다; 그림 1D, 1E). </li><li> 원추형으로 다진 마음을 전송튜브 (얼음) 절연 매체의 10 ㎖를 포함, 밤에 4 ° C에서 교반과 함께 배양한다. </li></ol> 2 일. 2. 세포의 효소 조직 소화 도금 <ol><li> 콜라게나 / 디스 파제 혼합물 (로슈)의 15 밀리그램의 무게를, 20 mM의 BDM (소화 매체)로 보충 10 ㎖ L15 매체 5 효소 믹스를 녹입니다. 살균 필터 새로운 멸균 50 ML 팔콘 튜브에 세포 배양 후드에서 소화 매체. </li><li> 30 ML L-15 20 mM의 BDM 보충 매체와 도금 매체를 준비합니다. </li><li> 1 시간의 최소 콜라겐 용액 (시그마 C-8919)를 가진 외투 세포 배양 플레이트. 멸균 층류 세포 문화 후드에 콜라겐 용액 (재사용 할 수있는) 건조 콜라겐 코팅 된 세포 배양 접시를 제거합니다. </li><li> 4 ℃에서 predigested 마음을 포함하는 원뿔 튜브를 제거 조직의 조각 (그림 1G)을 집계해야합니다. 조직 단편에 싱크하자튜브의 바닥 (모든 조직의 조각을 느슨하게하지 않도록하십시오., 일반적으로, 절연 매체의 약 1 ㎖ 튜브에 남아있을 수 있습니다) 뜨는을 제거합니다. 소화 배지 5 ㎖를 1 분 동안 산소 또는 공기를 이용하여 조직 절편 및 옥시 현탁액에 20mM의​​ BDM 보충 된 L-15 5 mL를 추가. </li><li> 소화 용액의 온도를 조절하기 위해 약 2 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 소화 매체에서 심장 조직의 조각을 포함하는 밀봉 원뿔 튜브를 전송합니다. </li><li> 20 ~ 30 분 동안 교반과 (60RPM 이하 이상으로 설정 37 ° C에서 예를 들어, 셰이커,)와 37 ° C에서 심장 조직의 조각을 품어. . 소화 시간은 크게 효소 혼합물 및 로트 번호주의에 따라 달라질 수 있습니다 : 더 이상 부화 기간 이상 효소의 농도는 세포 생존 능력을 감소시킬 수있다. </li></ol> 기술 코멘트 : 102696 : 우리는 (Cat.No. 로슈에서 콜라게나 / 디스 파제 혼합물의 사용을 추천합니다38001)이 아주 작은 로트의 변화가 있습니다. 마우스 심근의 분리를위한 고전적인 효소 트립신 및 / 또는 워딩 턴 (고양이 없음 CLS-2)에서 사용 가능한 콜라게나 제 II 형 3,16-20입니다. 그러나, 콜라게나 II의 성능은 로트에서 실질적으로 다를 수 있습니다. 워딩 턴은 일반적으로 소화 시간을 최적화하고 사용을 효소 몇 가지 콜라게나 많이 테스트 할 수 있습니다. 대안 적으로, 워딩은 사전 테스트 효소 혼합물로 심근 분리 키트를 판매하고 그 마우스 심장 근세포 17 (: NCIS 카탈로그 번호)의 분리를 위해 적응 될 수있다 포함. <ol start="7"><li> 신선한 멸균 50 ML 원뿔 팔콘 튜브에 멸균 세포 스트레이너 (40 ~ 100 μm의 나일론 메쉬)를 놓습니다. 20 mM의 BDM 보충 5 ㎖의 L-15와 사전 젖은 셀 스트레이너. 10 ~ 20 회 미리 침수 10 ㎖ 세포 배양 피펫을 사용하여 부드럽게 씹다 조직 조각. 조직 단편을 주로 suspensio로 세포를 방출이 단계 중에 분산해야N (그림 1H). </li><li> 큰 조직 파편이 침전하자 세포 스트레이너 (그림 1I)를 통해 신선한 원뿔 튜브에 중단 세포를 포함 뜨는 전송. </li><li> 5 ㎖의 소화 매체에 소화되지 않은 조직의 조각을 다시하면 일시 중지 및 교반과 함께 37 ° C에서 추가로 5 ~ 10 분 동안 품어. </li><li> 남아있는 조직 조각의 지속적인 소화 한 후, 가볍게 10 ~ 20 회 조직을 씹다 첫 번째 셀 스트레이너를 통해 다이제스트에서 원뿔 튜브 포함하는 셀을 추가 할 수 있습니다. 모든 소화 세포의 통과를 허용하는 20 mM의 BDM 보충 5 ㎖의 L-15 세포 스트레이너를 씻어. </li><li> Centrifugate 원뿔 튜브 300 rpm에서 5 분 (약 50 ~ 100 XG)에 대한 중단 심근을 포함. (대부분 섬유 아 세포와 내피 세포를 포함) 상층 액을 제거하고 매체를 도금 10 ㎖에 다시 중단 세포 펠릿. </li><li> 10cm의 세포 배양 접시 (그림 2A)로 1 부화 플레이트 세포세포 배양 인큐베이터에서 -3의 시간. 이 사전 도금 단계는 코팅되지 않은 세포 배양 접시 (그림 2C)에 부착되는 섬유 아세포와 혈관 내피 세포 (그림 2B)를 제거합니다. </li><li> 배양 후, 전송 재현 탁 세포는 멸균 원뿔 팔콘 원심 분리 관 (15 ㎖를 50 ㎖)에 (반복 접시 위에 도금 매체를 피펫으로 다시 중단 세포) 10cm 배양 접시에서 비 부착 심근을 씻어. 선택 사항 : 세포 현탁액에서 추가 섬유 아 세포를 제거하는 사전 도금 단계를 반복합니다. 필요하다면, 접착 섬유 아세포 및 내피 세포 배양 일 수있다. </li><li> (노이 바 우어의 혈구를 사용하여 예를 들어, 21를 염색 블루 배제 트리 판) 세포를 계산합니다. </li><li> cm 2 (그림 2D 당 약 1.5 × 10 5 세포의 밀도 콜라겐 코팅 된 세포 배양 접시에 플레이트 세포, 볼은 도금 표 1 코멘트및 코팅). 세포 배양 인큐베이터에 요리를 놓고 준수 및 심근의 확산 수 있도록 12 ~ 18 시간 동안 그대로 둡니다. </li></ol> 3 일 - 신생아 심근의 문화 <ol><li> 37 ° C의 물을 욕조에 유지 보수 매체 prewarm를 준비합니다. 신생아 마우스 심근의 리포좀 형질에 대한 증식 억제 또는 chronotropic 에이전트의 추가, 또는 절차에 대한 내용은 표 1을 참조하십시오. </li><li> 어느 날 도금 후 심근 세포의 배양 접시에 부착하고 최적의 계약을 자발적으로 시작해야합니다 (그림 2E, 2F를, 보충 영화 S2; 분리 / 배양 절차를 수행하는 동안 일반적인 문제에 대한 표 2 참조). 추가 1-5일에 대한 유지 보수 매체와 문화 매체를 도금 교체합니다. 필요에 따라 매체를 변경합니다. </li></ol>

심장 질환을 연구하는 동물 모델의 사용은 심장 혈관 연구에서 표준이되었습니다. 이 모델의 가까이 생화학 적 특성 (즉, 생화학 적 또는 생체 역학적 인 자극에 심장 세포의 직접 응답을 공부)은 일반적으로 심장 조직이나 심근의 분리가 필요합니다. 심장의 생리적 반응을 조사 연구는 생체 (예를 들어 40 아세틸 콜린, 또는 허혈 - 재관류 시나리오 41)은 일반적으로 ?...

쥐의 심장 세포의 성공적인 해리와 문화에 대한 최초의 보고서는 다시 1960 년대 1, 2로 거슬러 올라갑니다. 그렇다하더라도, Harary 및 팔리 배양 심근는 &quot;주기적인 수축의 요구 사항의 연구를위한 독특한 시스템을 제공 할 수있다 [월] [치는] 프로세스의 다양한 대사 경로의 기여를 결정하는 수단을 제공하는&quot;것으로 나타났습니다. 젊은 쥐, 원래의 프로토콜에서 Harary 및 팔리 격리 배양 심근 수년에 걸쳐 적응 많은 과학자들에 의해 수정되었지만, 일반적으로 분리 및 배양 과정은 크게 변경되지 않았습니다. 그러나, 더 나은 효소 3, 표준화 된 솔루션 4,5 및 분리 절차 동안 6-9 세포를 보호하기 위해 가역 채널 및 미오신 ATPase의 억제제 BDM의 첨가는 크게 휴대 수율 및 생존을 개선했다. 신생아 cardiomyo 대 성인cytes 신생아 생쥐 나 쥐에서 분리 배양 심근 성인 심근의 문화에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 성인 마우스 또는 쥐 10에서 심근의 분리에 비해 제일, 신생아 마우스 또는 쥐 마음의 분리 절차는 쉽고 적은 비용이다. 신생아 심근 크게 세포 수율을 증가하고, 분리 한 후 칼슘 함유 배지에 재 도입에 훨씬 덜 민감하다. 성인 심근는 일반적으로 수축을 유도하기 위해 서성 필요로하지만 일반적으로, 자발적으로 도금 한 후 세포를 20 시간을 치고 결과 재분화주기 - 또 다른 큰 장점은 신생아 마우스의 심근이 더 빠른 탈분화를 받아야한다는 것입니다. 성인 심근는 형질 전환 DNA의 성공적인 전달을 위해 바이러스 성 벡터를 필요로하는 반면 신생아 심근은 더 쉽게 또한 리포좀 형질 전환 방법과 형질이다. 신생아 심장 근세포 대조적의, 성인 쥐 심근 11-13의 문화는 근원 섬유 저하 및 수축성 장치의 궁극적 인 회복의 조사를 할 수 있습니다. 성인 심근에서 이러한 특성을 형태 학적 변화는 1-2 주 기간에 걸쳐 발생합니다. 탈분화 - 재분화주기함으로써 인간의 심근 병증이 14에서 관찰 된 병리학 적 변화를 흉내 낸, 태아 유전자 프로그램의 reexpression 함께합니다. 신생아 심근 세포의 배양을 통해 성숙한 래트 심근 세포의 또 다른 장점은 오랜 시간 동안 배양 할 수있는 능력이 세포이다. 마우스 심근 대 쥐 쥐 신생아 심근의 분리 및 배양 가능한 세포의 높은 수율 증가 형질 전환 속도 등의 마우스 신생아 심근의 그 이상 몇 가지 장점이 있습니다. 그러나, 심장 질환에 대한 유전자 변형 마우스 모델의 광범위한 사용 (예를 들어 &lt;/ 엠&gt; 확장 성 심근증 15 모델과 근육 임 단백질 녹아웃 마우스) 신생아 쥐에서 유래 심근 세포의 분리 절차의 적응되었다. 신생아 래트 심근 세포 및 마우스를 분리하는 데 사용되는 프로토콜은 거의 동일하지만, 그레이트 손질 후자위한 적절한 효소 믹스의 선택에주의해야한다. 사실, 신생아 마우스의 심근이 감소 된 세포 수율과 생존의 결과로, 일반적으로 overdigestion에 더 취약합니다. 신생아 생쥐 유래 심근 신생아 래트 심장 유래의 세포에 비해 다소 작은 때문에 또한, 도금 밀도는 조정되어야한다. 형태 학적, 전기 생리학, 생화학, 세포 생물학 및 생체 역학 매개 변수뿐만 아니라 myofibrillogenesis의 프로세스의 조사를 위해 많은 용도로, 배양 신생아 심근는 연구를위한 가장 다양한 시스템 중 하나가되고 있습니다체외에서 심장 세포 기능. 성공적인 분석의 첫 번째 단계는하지만, 신생아 마우스 심근를 분리 할 수​​있는 쉽고 안정적​​인 방법에 따라 달라집니다. 우리의 프로토콜은 다양한 소스에서의 방법론을 그리고 재현성 및 안정성을 위해 최적화되었다. 우리는 심근 세포 수율과 생존에 영향을 미치는 요인에 대해 설명하고, 분리 및 배양 조건의 최적화를위한 다양한 옵션을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>BDM (2,3-Butanedione monoxime) &lt;sup&gt;6-8&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma</td><td>B-0753</td><td>prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;), filter sterilize, can be kept at 4 &amp;#176;C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture&lt;sup&gt;46,47&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Collagenase/Dispase</td><td>Roche</td><td>10269638001</td><td>can be substituted with collagenase type II from Worthington</td></tr><tr><td>Collagenase type II&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;</td><td>Worthington</td><td>CLS-2</td><td>substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche</td></tr><tr><td>1x trypsin solution (0.25%) with EDTA</td><td>cellgro</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS</td><td>cellgro</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS (without Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td>e,g, cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Hank&amp;#8217;s balanced salt solution; without Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;) &lt;sup&gt;4&lt;/sup&gt;</td><td>cellgro</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM high glucose</td><td>cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>M-199</td><td>cellgro</td><td>10-060-CV</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovine serum</td><td>cellgro</td><td>35-011-CV</td><td>cell-culture grade</td></tr><tr><td>horse serum</td><td>cellgro</td><td>35-030-CV</td><td>cell-culture grade</td></tr><tr><td>Leibovitz L-15&lt;sup&gt;5&lt;/sup&gt;</td><td>cellgro</td><td>10-045-CV</td><td></td></tr><tr><td>AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride)</td><td>Sigma</td><td>C-6645</td><td>proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, filter sterilize, store at 4 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>phenylephrine</td><td>Sigma</td><td>P-6126</td><td>chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, filter sterilize, store at 4 &amp;#176;C or -20 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>isoproterenol hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>I-6501</td><td>chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, filter sterilize, store at 4 &amp;#176;C or -20 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>0.1% collagen solution</td><td>Sigma</td><td>C-8919</td><td>extracellular matrix for coating</td></tr><tr><td>3 mg/ml collagen type 1 solution</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5005-B</td><td>alternative to Sigma collagen solution</td></tr><tr><td>cell strainer</td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td><td>appropriate filter size:40 &amp;#956;m-100 &amp;#956;m</td></tr><tr><td>syringe filter 0.2 &amp;#956;m</td><td>Fisherbrand</td><td>09-719C</td><td>for sterile filtration of digestion medium</td></tr><tr><td>straight scissors</td><td>Fine Sciences Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>curved scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>91461-11</td><td></td></tr><tr><td>Dumont No. 7 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>perforated spoon</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-19</td><td>optional, for transfer of heart tissue</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>live cell staining</td></tr><tr><td>Neubauer hemocytometer</td><td>Prosource Scientific</td><td>3500</td><td>alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems</td></tr><tr><td>50 ml Falcon tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>14-432-23</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Falcon tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>20 ml syringe</td><td>BD Medical</td><td>14-820-19</td><td></td></tr><tr><td>10 ml serological pipette</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>30 mm cell culture dish</td><td>Nunc</td><td>153066</td><td>for standard culture of cardiomyocytes</td></tr><tr><td>30 mm cell culture dish, glass bottom</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td>for live cell imaging with inverted microscope</td></tr><tr><td>10 cm cell culture dish</td><td>Nunc</td><td>172958</td><td>for preplating</td></tr><tr><td>Escort III</td><td>Sigma</td><td>L3037</td><td>for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>52887</td><td>substitute for Escort III</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Buffers and media: &lt;/strong&gt; &lt;ul&gt; &lt;li&gt;&lt;strong&gt;Isolation medium (filter sterilize)&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 20 mM BDM&lt;br/&gt; 0.0125% trypsin&lt;br/&gt; in HBSS&lt;sup&gt;4&lt;/sup&gt; (without Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;&lt;strong&gt;Digestion medium (filter sterilize)&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 20 mM BDM&lt;br/&gt; 1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix&lt;br/&gt; in L15 medium&lt;/li&gt; &lt;li&gt;&lt;strong&gt;Plating medium&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 65% DMEM high glucose&lt;br/&gt; 19% M-199&lt;br/&gt; 10% horse serum&lt;br/&gt; 5% fetal calf serum&lt;br/&gt; 1% penicillin/streptomycin&lt;/li&gt; &lt;li&gt;&lt;strong&gt;Maintenance medium&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 78% DMEM high glucose&lt;br/&gt; 17% M-199&lt;br/&gt; 4% horse serum&lt;br/&gt; 1% penicillin/streptomycin&lt;br/&gt; &lt;em&gt;optional:&lt;/em&gt;&lt;br/&gt; 1 &amp;#956;M AraC&lt;br/&gt; 1 &amp;#956;M isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt; The plating and maintenance medium can be stored at 4 &amp;#176;C for up to 6 months.</td></tr></tbody></table>

isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes

교양 신생아 심근 긴 myofibrillogenesis와 근원 섬유의 기능을 연구하는 데 사용되었습니다. 배양 심근 쉽게 조사 및 조작 생화학 경로, 그리고 자발적으로 심근 박동의 생 역학적 특성에 미치는 영향에 대해 수 있습니다. 다음 2 일간의 프로토콜은 신생아 마우스 심근의 격리와 문화를 설명합니다. 우리는 쉽게, 신생아에서 마음을 해부 심장 조직을 떼어 놓다 및 심장 세포 집단에서 심근을 풍부하게하는 방법을 보여줍니다. 우리는 세포 분리에 대해 서로 다른 효소 혼합물의 사용, 세포 생존 능력에 미치는 영향에 대해 설명합니다. 고립 된 심근 이후에 형태 학적, 전기 생리학, 생화학, 세포 생물학 또는 생체 역학 분석의 다양한 사용할 수 있습니다. 우리는 단지 시판되는 용액을 사용하여, 견고성과 재현성을위한 프로토콜을 최적화 효소 혼합물이 SH오우 작은 로트의 변화. 우리는 또한 심근의 분리 및 문화와 관련된 일반적인 문제를 해결하고, 분리 및 배양 조건의 최적화를위한 다양한 옵션을 제공합니다.

이 프로토콜을 사용하여, 우리는 8 햇 신생아 생쥐 (그림 1A, 1B, 보충 영화 S1)에서 마음입니다. 세척 및 가위 (그림 1C-1 층)과 마음을 닦지 후, 조직 단편을 교반과 함께 4 ° C에서 밤새 절연 매체에 predigested했다. predigestion (그림 1G)에 따라, 우리는 갓 소화 매체로 조직 조각을 전송하고, 교반과 함께 37 ° C에서 20 분 동안 조직의 조각을 배양 하였다. 얻어진 세포 ?...

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Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

기본 마우스 심근 문화는 근원 섬유 조직과 기능의 조사를 위해 중요한 도구 중 하나입니다. 다음 프로토콜은 신생아 마우스 마음에서 차 심근의 격리와 문화를 설명합니다. 얻어진 심근 배양 이후 역학적, 생화학 및 세포 생물학의 다양한 분석을 위해 사용될 수있다.

분리 및 문화 신생아 마우스 심근

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

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Research

JoVE Journal

Biology

62.5K 조회수.  King’s College London.  기본 마우스 심근 문화는 근원 섬유 조직과 기능의 조사를 위해 중요한 도구 중 하나입니다. 다음 프로토콜은 신생아 마우스 마음에서 차 심근의 격리와 문화를 설명합니다. 얻어진 심근 배양 이후 역학적, 생화학 및 세포 생물학의 다양한 분석을 위해 사용될 수있다. 

비디오: Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is difficult and time consuming. The most commonly used cells are neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs), which require isolation every time cells are needed. The birth of the rats can be unpredictable. Cryopreservation is proposed to allow for cells to be stored until needed, yet freezing/thawing methods for primary cardiomyocytes are challenging due to the sensitivity of the cells. Using the proper cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), cryopreservation was achieved. By slowly extracting the DMSO while thawing the cells, cultures were obtained with viable NRCMs. NRCM phenotype was verified using immunocytochemistry staining for &#945;-sarcomeric actinin. In addition, cells also showed spontaneous contraction after several days in culture. Cell viability after thawing was acceptable at 40-60%. In spite of this, the methods outlined allow one to easily cryopreserve and thaw NRCMs. This gives researchers a greater amount of flexibility in planning experiments as well as reducing the use of animals.

The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.

분리 및 신생아 쥐 심근 세포의 냉동 보존

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is ...

연구

발생학

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

신생아 마우스의 폐 내피 세포의 분리 및 문화

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

생물학

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

신생아 생쥐의 척수 신경 세포 분리 및 배양

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

신경과학

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

절연, 문화, 그리고 성인 마우스 된 심근의 기능적 특성

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

신생아 쥐의 폐 동맥 평활근 세포의 분리

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

분리 및 문화 성인 마우스 세포 신호 전달 용의 Cardiomyocytes과의<em&gt; 시험관</em&gt; 심장 비대

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

격리, 문화 및 성인 마우스 심근 세포의 형질 도입

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and molecular functional experiments (e.g., contraction, electrophysiology, calcium cycling, etc.) on cardiomyocytes are the gold standard for establishing mechanism(s) of disease. The mouse is the species of choice for functional experiments and the described technique is specifically for the isolation of mouse cardiomyocytes. Previous methods requiring a Langendorff apparatus require high levels of training and precision for aortic cannulation, often resulting in ischemia. The field is shifting toward Langendorff-free isolation methods that are simple, are reproducible, and yield viable myocytes for physiological data acquisition and culture. These methods greatly diminish ischemia time compared to aortic cannulation and result in reliably obtained cardiomyocytes. Our adaptation to the Langendorff-free method includes an initial perfusion with ice-cold clearing solution, use of a stabilizing platform that ensures a steady needle during perfusion, and additional digestion steps to ensure reliably obtained cardiomyocytes for use in functional measurements and culture. This method is simple and quick to perform and requires little technical skill.

The gold standard in cardiology for cellular and molecular functional experiments are cardiomyocytes. This article describes adaptations to the non-Langendorff technique to isolate mouse cardiomyocytes.

마우스 심근 세포를 일관되게 분리하는 간단하고 효과적인 방법

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

의학

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. Adult mammalian CMs are terminally differentiated cells with minimal proliferative capacity. The post-mitotic state of adult CMs not only restricts cardiomyocyte cell cycle progression but also limits the efficient culture of CMs. Moreover, the long-term culture of adult CMs is necessary for many studies, such as CM proliferation and analysis of gene expression.
The mouse and the rat are the two most preferred laboratory animals to be used for cardiomyocyte isolation. While the long-term culture of rat CMs is possible, adult mouse CMs are susceptible to death and cannot be cultured more than five days under normal conditions. Therefore, there is a critical need to optimize the cell isolation and long-term culture protocol for adult murine CMs. With this modified protocol, it is possible to successfully isolate and culture both adult mouse and rat CMs for more than 20 days. Moreover, the siRNA transfection efficiency of isolated CM is significantly increased compared to previous reports. For adult mouse CM isolation, the Langendorff perfusion method is utilized with an optimal enzyme solution and sufficient time for complete extracellular matrix dissociation. In order to obtain pure ventricular CMs, both atria were dissected and discarded before proceeding with the disassociation and plating. Cells were dispersed on a laminin coated plate, which allowed for efficient and rapid attachment. CMs were allowed to settle for 4-6 h before siRNA transfection. Culture media was refreshed every 24 h for 20 days, and subsequently, CMs were fixed and stained for cardiac-specific markers such as Troponin and markers of cell cycle such as KI67.

Here, we present a protocol for the isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes.

성인 마우스및 쥐 심근세포의 격리, 트랜스페션 및 장기 문화

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

성인용 마우스 심장에서 심방 심근 세포, 심실 심근 세포 및 비근구의 동시 격리 및 문화

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...