이 작품은 국립 심장, 폐, 혈액 연구소 부여 HL-36573에 의해 지원되었다. 우리는이 원고를 편집 데이비드 씨 Sowa의 감사합니다.

마우스의 모든 연구는 절차와 건강의 국립 연구소의 가이드 라인에 따라 수행하고, 프로토콜은 톨레도 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회, 의학 및 생명 과학 대학에 의해 승인되었습니다. 1. 관류 시스템 준비 <ol><li> 격리 전날, 빠른 알칼리 잔류 물이없는 세제와 (저수지 포함) 전체를 관류 시스템을 입력합니다. 이 솔루션은 몇 시간 또는 밤새 시스템에 흡수 할 수 있습니다. </li><li> 다음 날 아침, 37 ° C의 열 순환기 온도를 조정하고 솔루션을 따뜻하게 할 수 있습니다. 세제 액을 제거하고 멸균 증류수로 철저히 시스템을 세척하십시오. 모든 측면 가지를 잊지 말라. </li><li> 일정한 연동 펌프를 통해 관류 버퍼 시스템을 입력하고 모든 공기 보호 측면에 장착 된 주사기와 대동맥 챔버 (버블 트랩)으로부터 거품 그리기관상 동맥 폐색의 마음. 연동 펌프의 유량은 정기적으로 점검해야한다. </li></ol> 2. 버퍼의 준비, 문화, 미디어 및 요리 <ol><li> 관류 버퍼 : 1X 관류 버퍼 500 ㎖ 사용하기 전에 확인합니다. 이 칼슘 무료 버퍼는 113 mM의 NaCl을 4.7 밀리미터의 KCl, 0.6 mM의 KH 2 PO 4, 0.6 ㎜ 나 2 HPO 4, 1.2 ㎜ 망초, 10 mM의 NA-HEPES, 12 mM의 탄산 수소 나트륨, 10 mM의 KHCO 3를 포함 0.032 빨간색 mM의 페놀, 30 mM의 타우린, 10 mM의 BDM, 5.5 mM의 포도당. 2 M 염산으로 7.0으로 산도를 조정하고 4 ℃에서 0.2 μm의 필터, 매장을 통해 필터링 주 :이 사용될 때) 관류 용액 당일에 준비되어야한다. 경우에 따라서는 4 ° C. 미만 3 일간 용액을 저장하는 수용 B)이 버퍼는 ATP의 C에게 감소, 대기 심근을 유지할 수 있습니다 15.3 mm로 높은 칼륨 농도를 위로,가onsumption 및 CA 2 + 허용 능력을 향상시킬 수 있습니다. </li><li> 소화 버퍼 (300 U / ㎖, 25 ~ 50 ㎖ / 마음) : 직전 관류에 준비합니다. 문화 후드에서 50 ㎖ 관류 버퍼에 용해, 유형 II 콜라게나 제의 전체 활동의 15,000 U 무게. 최종 칼슘 농도 50 μM을 만들기 위해 100 ㎜ 염화칼슘의 25 μL (살균 원액, 필터)를 추가합니다. 분리를위한 준비 37 ° C의 버퍼를 따뜻하게. 트립신과는 달리, 콜라게나 제는 50 ~ 100 μm의 칼슘 2 +의 존재에 가장 잘 작동합니다. </li><li> 정지 버퍼 (50 ㎖ / 하트) : 문화 후드에서 작동합니다. 5 ㎖ 멸균 FBS와 관류 버퍼 45 ㎖를 혼합. <ol><li> 칼슘 2 + 솔루션은 I (12.5 μM 칼슘 2 +) : 정지 버퍼 20 ㎖에 100 ㎜ 염화칼슘 2.5 μl를 추가하고 혼합한다. </li><li> 칼슘 2 + 솔루션 II (100 μM 칼슘 2 +) : 정지 버퍼 10 ㎖에 100 ㎜ 염화칼슘의 10 μl를 추가하고 혼합한다. </li><li> 칼슘 2 + 솔루션 III (400 μM 칼슘 2 +) : 정지 버퍼 10 ㎖에 100 ㎜ 염화칼슘의 40 μl를 추가하고 혼합한다. </li><li> 칼슘 2 + 솔루션 IV (900 μM 칼슘 2 +) : 정지 버퍼 10 ㎖에 100 ㎜ 염화칼슘의 90 μl를 추가하고 혼합한다. </li></ol></li><li> 전송 문화 후드에서 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 2 밀리미터 L-글루타민과 1.26 mM의 염화칼슘을 포함하고 FBS 5 ㎖를 추가 MEM 43 ㎖, BDM 원액 1 ㎖ (: (50 ㎖ / 하트) 매체를 도금 500 mm의 필터 살균), 0.5 ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신 (10,000 U / ㎖). 혼합 2 %의 CO 2, 느슨한 모자와 37 ° C 배양기에서 이전의 심근 세포 분리에 2 ~ 3 시간 동안 평형. 오른쪽 심근 도금 전에 배지로 200 mM의 ATP 0.5 ㎖ (pH를 7.2, 스톡 용액, 멸균 필터)를 추가한다. </li><li> 문화 매체 (50 ㎖ / 하트) : 이전 48 문화 후드에서 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 2 밀리미터 L-글루타민과 1.26 mM의 염화칼슘을 포함하는 MEM ㎖ 및 BDM 원액 (500 mm의 1 ㎖, filte를 추가r)로 멸균하고, 0.5 ㎖의 페니실린 / 스트렙토 마이신 (10000 U / ㎖). 혼합 2 % CO 2, 37 ° C 배양기 이전에 심근 세포 분리에 평형. 사용 전에 배지에 100 ㎎ / ㎖ BSA 0.5 ㎖ (멸균 필터)를 추가한다. 참고 : 2 % CO 2 배양기를 사용하여 myoctyes은 24 시간까지 자신의 막대 모양의 형태를 유지하는 데 도움이 6.9-7.0의 배양액의 pH를 유지 용이하게한다. </li><li> 라미닌 (1-2 ㎍ / cm 2) 코팅 요리 또는 플레이트 : 멸균 PBS (w / 칼슘과 마그네슘 O) 20 ㎖를 혼합로 전송 / ㎖ 자연 마우스 라미닌 1 mg을 200 μl를. 100-mm 요리에 35-mm 요리, 60-mm 요리에 2.5 ㎖, 또는 5 ㎖에 1 ML을 추가 균일하게 표면을 커버하는 악수, 장소 CO 2 2 %에서, 37 ° C 배양기 심근 도금까지. 참고 : 요리 나 플레이트가 코팅 된 날에 사용하지 않으면, 그들은 파라 필름으로 밀봉하고 4 ° C 하룻밤 (느린 코팅)에 저장할 수 있습니다. 씰링 requ에있다IRED 증발 및 오염을 방지한다. 코팅 된 플레이트는 최대 1 주일 동안 4 ° C에 보관하실 수 있습니다. </li></ol> 3. 마우스 심장 제거 및 삽관 <ol><li> 30 분 동안 70 % 에탄올에 가위와 집게를 만끽하고 건조 할 수 있습니다. </li><li> 가장 가까운 0.1 그램으로 마우스의 무게를. 몸 무게, 변형, 성별, 생년월일을 기록합니다. </li><li> 200 ㎕의 헤파린을 주입 (100 IU / 마우스) IP 10 분 이전에 관상 동맥에서 혈액의 응고를 방지하기 위해 마취. 200 케타민 (ketamine) / kg 체중 MG 및 IP 주사 자일 라진 10 ㎎ / ㎏ 체중으로 마우스를 마취하고 마우스 꼬리 / 발가락 핀치에 응답을 중지 할 때까지 5 ~ 10 분 동안 기다립니다. </li><li> 부드럽게 관류 시스템 근처 동물 수술 트레이 또는 테이블 벤치에 pinnable 작업 표면 (예 : 스티로폼)에 앞발과 hindpaws를 고정하여 누운 위치에 마우스를 고정합니다. </li><li> 70 % 에탄올로 가슴과 복부를 닦아주십시오. 중간 선 피부 나 만들기수술 가위와 다이어프램 중순 복부 ncision. </li><li> 다른 수술 가위로 다이어프램을 잘라 곡선 톱니 모양의 집게와 흉골을 누르고 있습니다. 양측 잘라 마음을 노출 가슴 케이지를 retroflect. </li><li> 미세한 톱니 모양의 곡선과 atraumatic 집게를 사용하여 약간의 마음을 들어 올려 등의 흉부 벽에 최대한 가깝게 흉강 밖으로 마음을 해부하다. </li><li> 차가운 관류 버퍼를 포함하는 100-mm 요리에 마음을 전송합니다. 조심스럽게 이러한 폐, 흉선, 그리고 기관지 등의 결합 조직을 멀리 트림. </li><li> 일반적으로 흉선 및 지방 패드에 의해 숨겨진 대동맥과 뇌 지점을 확인합니다. 마음을 들어 올려, 대동맥 벽을 파악, 최초의 지점 (13) 아래의 대동맥을 절단하고, 약간 관류 액으로 채워진 대동맥 캐뉼라 (평면 / 무딘 팁과 노치 1 위 2mm 1.0 mm 외경 스테인레스 스틸 캐 뉼러에 맵시 두 초 미세 팁 F를 사용하거나 22 G 재사용 먹이 바늘) 팁orceps. 주 : a) 관류 유체가 관상 동맥 들어가는 기포를 방지하는 심장 삽관 중에 적하한다; B) 바로 대동맥 판막 이상으로 정맥의 끝을 유지합니다. </li><li> 정맥에 대동맥 클램프와 6-0 수술 실크 정맥에 대동맥 결찰. 전체 삽관은 120 초 이하로해야한다. </li></ol> 4. 심장 관류 및 소화 <ol><li> 4 ML의 유속으로 칼슘이없는 관류 버퍼 마음을 Perfuse / 분 약 4 ~ 5 분 폐수가 명확해질 때까지, 다음 50 μm의 염화칼슘을 포함하는 소화 버퍼로 전환 마우스의 변형에 따라 3.5-20 분 동안 perfuse, 관류 압 및 콜라게나 제 활성. 해당되는 경우 소화 할 때, 70 ~ 80 mmHg로 대동맥 압력을 증가시킨다. 필요한 경우, 효소 관류 소화를 위해 재순환 될 수있다. 전형적으로, 300 U / ml의 효소 버퍼 ㎖ / 분 (4)의 유속으로 10-12 분에서 심장을 소화 할 것이다;70 mmHg로 후 부하에 압력을인가하는 경우, 300 U / ml를 4 ml / 분의 유속으로 만 3.5-5.5 분 걸릴 것이다. </li><li> 마음이 약간 창백하고 이완 될 때 소화를 중지합니다. 부드럽게 끼 때 스폰지해야한다. </li></ol> 오. 세포 해리 칼슘 재 도입 <ol><li> 70 % 에탄올을 묻힌 집게와 정맥에서 대동맥을 당겨 2.5 ml의 소화 버퍼를 포함하는 멸균 60 mm 접시에 담아. 이 멸균 기술을 염두에 머물고 및 후속 단계 살균 용품을 사용하여 문화 후드로 이동합니다. </li><li> 미세 수술 가위로 대동맥, 심방과 큰 혈관을 제거합니다. 조심스럽게 두 미세 팁 집게로 10-12 작은 조각으로 심실을 애타게. </li><li> 조심스럽게 10 ML 전송 피펫으로 심장 조각 셀 위로 ~ 10 배 아래로 피펫 후 15 ㎖의 폴리 프로필렌 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다. I는 12.5 μM 염화칼슘 및 전송을 포함하는 7.5 ㎖의 칼슘 용액으로 요리를 씻어이 튜브에, 10 ㎖의 최종 부피의 결과. </li><li> 살짝 위로 심장 조직의 큰 조각을 분산하기 위해 미세 팁 전송 피펫을 사용하여 아래로 세포 현탁액을 피펫. </li><li> 다음과 같은 내피 세포와 섬유 아세포와 같은 작은 비 심근 세포를 분리하기 위해 20 XG에서 3 분 동안 원심 분리. </li><li> 뜨는 대기음 및 10 ㎖의 칼슘 용액에 심근 세포 펠렛을 재현 탁 200 mM의 ATP 100 μL (산도 7.2, 원액, 살균 필터)의 보충과 I. 3 ~ 5 분 동안 후드에 튜브를 남겨주세요. </li><li> 전송 막대 모양의 둥근 근육 세포를 계산하는 hemacytometer에 10 μL 씩 분주 중복. 심근 세포의 총 수를 계산하고 봉상 심근 세포의 비율을 계산한다. </li><li> 20 X g에서 3 분의 근육 세포를 원심 분리기. 뜨는을 제거하고 100 μM 염화칼슘을 포함하는 10 ㎖의 칼슘 솔루션 II의 펠렛을 재현 탁. 피펫 팅에 의해 미세 팁 전송 피펫과 근육 세포를 분산상하. </li><li> 각각 칼슘 용액 III (400 μM 염화칼슘)와 IV (900 μM 염화칼슘)를 사용하여 상기 단계 (5.8)를 반복합니다. </li><li> 쥐 심근 일차 배양을 위해, 배지를 도금 5ml에 심근 최종 펠렛을 재현 탁. 심근 세포의 총 수를 계산 및 막대 형상 심근 세포의 비율을 계산한다. </li></ol> 6. 세포 배양 <ol><li> 50 ㎖의 튜브에서 25,000 봉상 심근 세포 / ㎖로 막대 모양의 심근 세포의 농도를 조정. 부드럽게 잘을 일시 중지 10 ML의 피펫을 사용하여 근육 세포를 피펫. 각 접시 또는 플레이트 같은 세포의 밀도를 보장하기 위해 피펫 및 튜브에 세포의 침전을 피하십시오. </li><li> 라미닌의 코팅 용액을 흡입 한 후, 그 그릇이나 접시에 근육 세포를 접시. 조심스럽게 문화 후드의 표면에 접시 또는 플레이트 전후 및 좌우 크로스와 같은 패턴 3 4 시간을 밀어 넣습니다. </li><li> 2 %의 CO에서 요리 나 플레이트를 배치37 ℃에서 2 배양기 약 80 %의 비율로 심근 세포의 부착을 허용하는 1-3 시간 동안 배양한다. </li><li> 부착 후, 온화 무소속 근세포 및 세포 파편을 포함하는 매체를 대기음. 부드럽게 요리 나 플레이트의 측면에 배지를 추가합니다. 하나이 매체 변경을 수행합니다. 즉시 인큐베이터에 요리 또는 번호판을 반환합니다. </li><li> O / N 배양 후, 근세포 ​​단기간 세포 신호의 연구 전에 BDM없이 동일 매체에 변경할 수있다. 비대 또는 세포 사멸 분석을위한 장기 문화 BDM을 유지합니다. 참고 : BDM (2,3 - 부탄 디온 monoxime)는 마이 오신 ATPase의 활성도를 억제하고 수축을 방지 할 수 있습니다. 마이 오신 기반 수축의 억제는 쉽게 뒤집을 수있다. 그것은 BDM는, 비특이적 포스파타제 역할 SR로부터의 칼슘 방출을 증가시키고 자유 칼슘 농도 및 셀룰러 전기 prope의 변질 등의 일부 잠재적 인 부작용을 가질 수 있다는 것을보고rties 때문에 치료 전, BDM은 제거되어야한다. 더욱이, 어떤 경우에는, 특정 미오신 II 억제제 Blebbistatin은 심근 수축을 억제하는 8,9 대체 약물이 될 수있다. 그러나, 우리의 경우에, BDM은 심근의 질과 양을 위해서 Blebbistatin보다 낫다. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

최선의 준비를 위해, 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 1) 즉시 절제 후 정맥에 마우스 마음을 접선; 2) 적절한 심장 관류. 또한, 물 품질, 관류 온도, 버퍼의 산도, 살균, 화학 순도, 깨끗하고 오염되지 않은 튜브와 챔버도 중요한 요소를 확인합니다. 18.2 mΩ의 분자 생물학 수준의 H 2 O는 높은 버퍼를 준비하는 것이 좋습니다. 200 mM의 ATP 스톡 용액의 pH는 7.2, 쉽게 놓치는 단계로 조정되어야한다. ...

심근 증식하지 않습니다. HL-1 및 마우스 심방 종양 유래 AT-1 세포와 같은 일부 심방 심근 세포주가있다; 그러나, 연구에는 성인 심실 심근 세포주가 없다. 성인 마우스 심근의 기본 세포 배양은 세포 및 분자 수준에서 심장 연구를위한 강력한 모델을 제공합니다. 지금까지, 그들은 생화학 생리 및 약리학 적 연구 1에 광범위하게 사용되어왔다. 또한, 유전자 변형 생쥐의 빈번한 사용은 심근 분리의 효과적인 방법을 필요하게되었다. 순수 배양은 다른 기관과의 상호 작용이없는 상태와 같은 내인성 신경 호르몬 및 호르몬과 같은 요인에 2,3를 통해 같은 전신 순환 할 수 있습니다. 그러나 심근을 성공적으로 격리 도전하실 수 있습니다. 우리가 여기에서 소개하는 프로토콜은 성인 쥐 cardiomyocyt와 우리의 경험을 기반으로합니다에스 오코넬 등 4,5에서 설명하는 방법. 특히 2007 5, 그들은 세포 배양 및 기능 분석에 버퍼 준비에서 자세한 방법을 설명했다. 마우스의 근육 세포가 쥐의 심근에 비해 구축에 매우 민감하기 때문에, 마우스 프로토콜의 관류, 소화, 칼슘 2 + 관용, 도금 및 문화에 사용되는 버퍼 나 미디어는 비특이적 여기 수축 커플 링 억제제, 2 보충된다 자신의 자발적인 수축을 억제하는 3 - 부탄의 monoxime (BDM)가, 따라서 생존과 막대 모양의 근육 세포의 수율을 크게 향상시킬 수 있습니다. 여기에 소개 된 프로토콜에서 근육 세포는 타입 II 콜라와 수정 랑겐 재관류에 의해 고립 된 마음에서 고 칼륨 버퍼에 구분됩니다. 콜라게나 II 효과적으로 간 매트릭스 해제 세포를 분해. 관류 솔루션은 낮은 레벨 6에서 세포의 신진 대사를 유지합니다. 책상 외에도에서에, 우리는 여기에 사용 된 하버드 장치에서 분리 된 심장 시스템은 정확한 온도와 일정한 압력 제어 7 잘 설계되어 있습니다. 이러한 접근법은 높은 재현성 제제 및 심장 비대 분석법위한 신호 단백질 또는 2~3일 배양을 측정 밤새 배양에 사용할 수있는 단일 셀 타입의 균일 한 집단을 제공한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="774">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:257px;">Isolated heart system for small rodent</td>
			<td style="width:131px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:99px;">IHSR-mouse 73-4019</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Aortic Cannula, OD 1.0 mm</td>
			<td style="width:131px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:99px;">73-2816</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Dumont #4 Forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11294-00</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Straight sharp serrated scissors</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">14070-12</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Serrated Graefe forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11050-10</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Curved, serrated Graefe forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11052-10</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Straight Mini Serrefines clamps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">18054-28</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">MEM</td>
			<td style="width:131px;">Gibco</td>
			<td style="width:99px;">11575-032</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:131px;">Worthington</td>
			<td style="width:99px;">4176</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mucosal universal detergent</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">Z637181</td>
			<td>Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent.</td>
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isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy

기술의 발전은 유전자 변형과 유전자 녹아웃 마우스, 많은 연구 분야에서 필수적인 도구를 포함하여, 유 전적으로 변형 된 쥐를 만들었습니다. 성인 심근 널리 좋은 심장 세포 생리학 및 병태 생리에 대한 모델뿐만 아니라 제약의 개입으로 사용할 수 있습니다. 유전자 변형 마우스에 의한 심근 &#39;말단 분화 비효율적 원하는 유전자형을 생성하는 복잡한 심근 감염 프로세스에 대한 필요성을 배제. 높은 수량과 품질 기능 심근의 분리 및 문화 극적으로 심장 혈관 연구를 혜택을 세포 신호 전달 연구 및 약물 개발을위한 중요한 도구를 제공합니다. 여기에서, 우리는 약간의 훈련으로 구현 될 수있는 어른 쥐의 심근 세포의 분리를 위해 잘 확립 된 방법을 설명합니다. 마우스 마음이 절제와 격리 된 심장 시스템에 유관 된 다음 칼슘이없는 높은 P와 관류otassium 랑겐 역 행성 관류 모드에서 유형 II 콜라게나 소화 다음 버퍼. 이 프로토콜은 유전자 변형 마우스의 다양한 기능에서 성인 마우스 심근의 컬렉션에 대한 일관성있는 결과를 얻을 수 있습니다.

1. 성공적인 분리 정량 두 가지 기준은 절연 성공을 정량화하기 위해 사용된다 : 첫째, 전체 절연 심장 근세포의 개수, 및 제, 봉상 칼슘 내성 반올림 비 내성 근세포의 비율. 일반적으로이 프로토콜은 심장 제거에서 심근 도금 한 성인 마우스 마음에서 수율 약 1 백만 막대 모양의 심근 (수확 전체 근육 세포 70 ~ 90 %)을 주위에 75 ~ 90 분입니다. 이 기능은 마우스의 체중과 변형에 ?...

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Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

우리는 성인 마우스 심근의 분리를 위해 신뢰할 수있는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 유전자 변형 마우스의 다양한 기능에서 성인 심근의 문화에 대한 일관성있는 결과를 얻을 수 있습니다.

분리 및 문화 성인 마우스 세포 신호 전달 용의 Cardiomyocytes과의<em&gt; 시험관</em&gt; 심장 비대

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

47.3K 조회수.  University of Toledo College of Medicine and Life Sciences.  우리는 성인 마우스 심근의 분리를 위해 신뢰할 수있는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 유전자 변형 마우스의 다양한 기능에서 성인 심근의 문화에 대한 일관성있는 결과를 얻을 수 있습니다. 

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Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

공촛점 이미징에 대한 분리 및 성인 심장 Myocytes의 유전자 조작

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

연구

생물학

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

성인 마우스 Cardiomyocytes의 단세포 Transcriptional 프로파일

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

성인 골격근의 개인 Myofibers 및 위성 세포의 분리와 문화

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

분리 및 문화 신생아 마우스 심근

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

절연, 문화, 그리고 성인 마우스 된 심근의 기능적 특성

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

마우스 심근의 분리 및 생리 학적 분석

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

성인 마우스 앞니의 치아 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

격리, 문화 및 성인 마우스 심근 세포의 형질 도입

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

신생아 및 성인 마우스 피부의 1 차 마우스 각질 세포의 분리 및 배양

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately 30 x 106 viable cells per mouse. Primary adult mouse keratinocytes are harvested from the dorsal skin of female mice. Male mice (~6 weeks old) can be used for keratinocyte harvesting depending on the requirements of the experiment. Euthanized mice are shaved and sterilized with serial washes in povidone iodine and ethanol solutions (70% alcohol). After disinfecting the mice, the dorsal skin is removed and the subcutaneous fat and muscle are removed with a scalpel and discarded. The skins are cut into small pieces and treated with a mild, low temperature trypsinization to detach the lower dermis from the epidermis. The scraped epidermises are stirred at low speed, filtered to remove the hairs, counted, and re-suspended in culture medium. This method provides an excellent single cell suspension of highly culturable cells for many downstream applications.

The goal of this protocol is to isolate epidermal keratinocytes from the dorsal skin of adult mice for a variety of downstream applications such as molecular biology, biochemistry, fluorescence activated cell sorting, and primary in vitro uses (e.g., clonogenic keratinocytes).

마우스 표피 각질 세포와 체외 클로노겐 문화의 격리

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...