이 프로토콜은 캐리어 시스템이 세포와 상호 작용하는 방식에 대한 정량적 데이터를 제공합니다. 정량적 데이터는 엔지니어링 및 최적화의 핵심입니다. 그것은 우리가 예 또는 아니오 생물학적 질문에서 얼마나 많은 질문으로 이동할 수있게합니다.
이 기술은 정성적이었던 전임상 약물 운반체 성능의 결과를 정량적 결과로 변환하는 데 유용합니다. 그리고 이것은 세포를 특성화하는 것과 다른 시스템에서 캐리어를 특성화하는 경우에도 작동합니다. 나노 측의 선형 또는 정량적 범위 내에 속하는 최적의 캐리어 희석을 찾기 위해 몇 번의 반복이 필요할 수 있습니다.
올바른 조건을 찾는 데 시간을 할애하십시오. 시작하려면 플로우 셀을 레이저 모듈에 장착하십시오. 1 밀리리터의 증류수로 초당 0.1 밀리리터의 속도로 플로우 셀을 천천히 세척하십시오.
플로우 셀 내에 기포가 형성되면 진행하기 전에 현탁액을 부분적으로 수축시켜 기포를 공기-액체 계면과 병합합니다. 그런 다음 전체 레이저 모듈을 기기 내부의 제자리에 잠급니다. 플러싱의 중간쯤에 카메라를 시작합니다.
캐리어 파편이 씻겨 나갔는지 확인하십시오. 캡처를 선택하여 캡처 설정 탭을 열고 카메라 시작을 클릭합니다. 1 밀리리터의 공기로 시스템을 구동하십시오.
화면에 정전기 캐리어가 보이면 제조업체의 지침에 따라 플로우 셀을 청소하십시오. 관련된 캐리어 시스템에 따라 캐리어가 초음파 처리 또는 와류를 통해 잘 중단되도록 하여 나노입자 추적 분석을 위한 캐리어를 준비합니다. 담체를 물에 희석하여 밀리리터당 1x10 내지 7번째 담체 및 1x10 내지 9번째 담체 농도를 갖는 각 샘플의 적어도 0.6 내지 1 밀리리터를 제조한다.
레이저 모듈을 꺼내 똑바로 세우십시오. 첫 번째 캐리어 샘플을 1 밀리리터 주사기에 떨어 뜨리고 주사기를 튜브 입구에 부착합니다. 그런 다음 샘플을 플로우 셀에 조심스럽게 로드합니다.
플로우 셀 내에 기포가 형성되면 계속하기 전에 현탁액을 부분적으로 수축시켜 기포를 공기-액체 인터페이스와 병합합니다. 전체 플로우 셀이 액체로 채워져 있는지 확인한 다음 로딩을 일시 중지합니다. 개별 캐리어를 시각화하기 위해 필요한 경우 카메라 초점을 조정합니다.
악기의 오른쪽에 있는 회전 손잡이로 초점을 거칠게 조정합니다. 하드웨어 탭을 선택하여 더 세밀하게 조정합니다. 초점 슬라이더를 조정하여 초점을 변경합니다.
과포화가 없는지 확인하려면 캡처 탭에서 슬라이더를 조정하여 최적의 카메라 레벨을 선택합니다. 기기에 이 액세서리가 장착되어 있는 경우 캐리어 샘플이 포함된 주사기를 주사기 펌프에 로드합니다. SOP 탭에서 표준 측정을 선택하여 각각 30초씩 5회 캡처합니다.
기본 파일 이름을 입력하고 원하는 경우 고급 버튼을 클릭하여 샘플 정보를 추가하면 다양한 선택 항목이 있는 모달 대화 상자가 열립니다. 스크립트 만들기 및 실행을 누르고 샘플을 진행하라는 팝업이 나타날 때까지 기다립니다. 주사기 펌프를 사용하는 경우 하드웨어 탭을 선택한 다음 주사기 펌프 탭을 선택합니다.
원하는 주입 속도를 설정하고 주입을 누릅니다. 주사기 펌프를 사용하지 않는 경우 샘플을 수동으로 진행하십시오. 팝업 창에서 확인을 선택하여 캡처를 시작합니다.
5개의 캡처 각각이 완료된 후 고급 샘플 팝업이 다시 나타나면 샘플이 여전히 플로우 셀을 통해 이동하고 있는지 확인합니다. 그런 다음, 확인을 선택하여 다음 캡처를 진행합니다. 프로세스 탭에서 감지 임계값 슬라이더를 4에서 8 사이로 조정하여 화면에 표시되는 개별 캐리어를 올바르게 식별합니다.
시각화를 돕기 위해 화면 게인을 조정할 수 있으며 다운스트림 분석에는 영향을 미치지 않습니다. 팝업에서 확인을 눌러 추적 분석을 시작합니다. 단일 분석에서 분석 탭을 클릭하여 분석 진행률을 모니터링합니다.
분석이 완료되면 내보내기 설정 프롬프트가 나타나는지 확인합니다. PDF 포함 및 실험 요약 포함이 선택되어 있는지 확인합니다. 원하는 대로 다른 내보내기 형식을 선택합니다.
PDF 데이터 내보내기의 결과 섹션에서 측정된 농도를 신뢰할 수 있는지 확인하려면 측정된 캐리어 농도가 밀리리터당 1x10에서 7번째, 1x10에서 9번째 캐리어 사이인지 확인하고 농도 측정 결과 아래에 오류 메시지 또는 주의 메시지가 있는지 확인합니다. 스톡에서 다른 희석액으로 절차를 두 번 이상 반복하고 각 샘플의 농도가 기기의 선형 범위 내에 있는지 확인하십시오. 텍스트 원고에 설명된 대로 재고 운반선 농도를 계산합니다.
유리 또는 항체 접합 형광 색소 용액을 텍스트 원고에 기재된 대로 준비한다. 방정식과 같이 농도, 분자량 및 Avogadro의 수로부터 원액의 농도를 계산하십시오. 그런 다음 캐리어 희석제에서 염료의 연속 희석을 수행하여 표준 곡선 샘플을 생성합니다.
그런 다음 캐리어 샘플을 측정 플레이트에 추가하고 마이크로플레이트 리더를 사용하여 형광을 측정합니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 표준 곡선을 생성합니다. 운반체당 절대 형광 강도는 벌크 형광을 운반체 농도로 나누어 계산합니다.
관련 채널에서 최적의 PMT 전압 설정을 결정하여 최종 캐리어 셀 실험을 위한 유세포분석기를 설정합니다. 배경 형광을 결정하기 위해 세포가 담체와 함께 배양되지 않은 음성 대조군 샘플을 실행합니다. 유세포분석 정량 비드를 준비하고 다시 현탁시킨다.
세포 샘플에 사용된 것과 동일한 완충액을 사용합니다. 비드 개체군이 별도로 제공되는 경우 함께 당깁니다. 유세포 분석 비드 및 담체 세포 샘플을 실행하여 세포 당 형광 강도를 결정한다.
유세포분석기 정량 비드를 실행하여 표준 곡선을 생성하고 절대 형광 강도를 MFI로 변환합니다. 이것을 사용하여 텍스트 원고에 설명 된대로 캐리어의 이론적 MFI를 계산합니다. 세포 담체 샘플을 실행하여 각 샘플의 셀당 형광 강도를 결정합니다.
마지막으로, 측정된 샘플의 형광에서 배경 형광을 뺀 다음 입자당 형광으로 나누어 각 샘플에 대한 세포당 운반체 수를 계산합니다. 633 나노미터 폴리메타크릴산 코어 쉘 입자의 경우, 담체당 농도 및 형광 강도를 세포분석기 스트림을 사용하여 직접 정량화할 수 있었다. 대조적으로, 100 나노 미터 초 상자성 산화철 나노 입자는 너무 작아서 개별적으로 검출 할 수 없었고 벌크 스트림을 사용하여 분석되었습니다.
표지된 정량 비드를 유세포분석기 상에서 표준 곡선을 생성하기 위해 여러 날에 걸쳐 사용하였다. 측정된 MFI와 정량 비드의 MESF 값 사이의 상관관계는 선형이었고 측정된 날짜 간에 대체로 유사했습니다. 형광 표지된 HeLa 세포를 235나노미터 폴리메타크릴산 캡슐과 함께 0시간에서 24시간까지 사용한 시간 과정 실험은 시간이 지남에 따라 MFI의 증가를 보여주었고, 이는 캡슐이 HeLa 세포와 결합하고 있음을 나타냅니다.
운반체에 대한 명백한 세포 반응의 차이는 상대적 또는 절대적 정량화에 따라 뚜렷했습니다. 절대 정량화는 라벨링 강도와 무관하여 더 비교할 수 있습니다. 이러한 기술은 입자 성능의 심층 분석 및 비교를 위한 기초입니다.
우리는 이러한 기술을 사용하여 특정 실험과 독립적으로 입자 성능을 특성화할 수 있는 수학적 모델을 매개변수화하게 되어 기쁩니다.
