접촉 버블 Bilayer 방법은 기존의 지질 양층에 대한 대체 기술이다. 이 방법을 사용하면 멤브레인을 통해 보다 다재다능한 진동이 가능합니다. CBB 방법은 Planar 지질 Bilayer 및 패치 클램프 방법의 이점을 통합합니다.
지질 이중층 기술로임의 지질 조성물을 가진 CBB가 형성될 수 있다. 신호 대 노이즈 비율이 높은 단일 채널 전류 녹음을 위한 CBB를 개발했습니다. 이 방법은 다양한 멤브레인 진동을 허용하고 채널 멤브레인 인터페이스에 대한 방대한 유형 플랫폼을 제공합니다.
모두가 비누 거품을 불고 경험했다. 입으로 불어오는 대신 가해지는 압력을 수동으로 미세 조정하여 CBB 형성을 위해 유사한 기동을 수행합니다. 연습과 CBB를 즐길 수 있습니다.
이 절차가 되는 것은 둥근 바닥 플라스크에서 원하는 농도에서 클로로포름에 인지질을 분산시한다. 질소 가스 실린더에 연결된 회전 증발기에 인지질 용액을 놓습니다. 얇은 인지질 필름이 나타날 때까지 실온에서 질소 흐름 하에서 플라스크를 회전시다.
다음으로 열린 플라스크를 진공 펌프에 연결된 데시카이터에 넣습니다. 진공 펌프를 사용하여 건조기 의 내부를 몇 시간 동안 흡인하여 클로로포형을 완전히 제거합니다. 이어서 플라스크에 적절한 양의 전해질 용액을 추가하고 인지질을 일시 중단하여 밀리리터 인지질 현탁액당 2밀리그마스를 얻습니다.
목욕 초음파 처리기를 사용하여 20~ 30초 동안 서스펜션을 손시아테하여 다층 소포 서스펜션을 얻습니다. 이온 채널 단백질을 함유한 프로테올리포좀의 제조를 위해 다층 소포 현탁액에 단백질 용액을 추가합니다. 그리고 목욕 초음파 를 사용하여 몇 초 동안 초음파 처리합니다.
큰 보어 유리 파이펫을 준비하려면 유리 모세관을 파이펫 풀러에 넣고 미세 한 테이퍼 팁으로 마이크로 피펫을 2 단계 당기는 것으로 조작합니다. 그런 다음 마이크로 단조에 마이크로 파이프를 설정하고 직경 30 ~ 50 마이크로 미터의 테이퍼 부분에 백금 필라멘트마이크로 마이크로 파이펫의 끝을 접촉. 필라멘트를 짧게 가열하고 즉시 끕니다.
증류수와 에탄올을 사용하여 유리 슬라이드의 표면을 얕은 우물로 청소합니다. 다음으로 실리콘 화시약을 유리 슬라이드에 바르고 시약이 완전히 공기 중으로 건조하게 합니다. 그런 다음 반전 된 현미경의 무대에 유리 슬라이드를 놓습니다.
실리콘 유리 슬라이드의 얕은 우물에 육사데카인 100 마이크로리터를 추가합니다. 결핵 주사기를 사용하여 마이크로 피펫의 절반 길이까지 전해질 용액을 채웁니다. 다음으로 압력 포트를 사용하여 마이크로 피펫 홀더에 마이크로 파이펫을 설치하여 은/은 염화물 와이어 전극이 파이펫 전해질 용액에 담글 수 있도록 합니다.
마이크로파이펫 홀더 중 하나를 패치 클램프 증폭기의 헤드 스테이지에 연결하고 다른 하나는 전기 접지에 연결합니다. 그런 후 마이크로피펫 홀더의 압력 포트에 마이크로인젝터를 연결합니다. 마이크로 피펫을 현미경 조작기를 사용하여 반전된 현미경의 단계 위에 적절한 위치로 조정합니다.
전극 오프셋 전위를 조정하려면 유리 슬라이드의 얕은 우물 주위의 평평한 표면에 마이크로 피펫을 채우는 데 사용되는 동일한 전해질 용액의 마이크로리터 1개를 배치하여 전해질 돔을 만듭니다. 전해질 돔에 두 마이크로파이펫의 끝을 담급니다. 그런 다음 패치 클램프 증폭기의 전극 오프셋 전위를 조정합니다.
팁에서 리포솜 용액을 그리려면 슬라이드 유리의 얕은 우물 주위의 평평한 표면에 리포솜 용액 1 마이크로리터를 추가합니다. 다음으로 마이크로피펫 끝을 돔이 들어 있는 리포솜에 넣습니다. 마이크로 인젝터를 사용하여 리포솜 함유 용액을 흡인.
다른 미르코피펫에 대한 절차를 반복하여 재구성된 리포솜을 증분하는 채널을 습살합니다. 이제 얕은 우물에 육사데칸에 마이크로 피펫의 배치. 거품이 원하는 크기에 도달할 때까지 압력을 증가시켜 천천히 물 거품을 날려 그 후 동일한 압력을 유지하십시오.
거품의 크기를 안정적으로 유지하기 어려운 경우 오일 에어 인터페이스를 통해 팁을 전달하여 거품을 폐기하십시오. 두 개의 안정적인 기포가 형성될 때까지 절차를 반복합니다. 두 거품 사이의 접촉을 설정합니다.
일정한 거품 압력에서도 크기가 점진적으로 변할 수 있기 때문에 거품 크기를 유지하기 위해 압력을 미세 조정합니다. 패치 클레임 증폭기를 사용하여 멤브레인 잠재력을 적절한 값으로 설정하고 채널 전류가 나타날 때까지 기다립니다. 안정적인 지질 이중 층 형성을 위해 블로터를 청소하는 것이 필수적입니다.
유리 모세관 또는 파이펫 제제는 철저히 세척되어야하며 세제 분자에 의한 오염을 피해야합니다. 일단 CBB는 수성 용액또는 리포솜에서 채널 분자를 형성하면 자발적으로 수십 분의 범위 내에서 이중 층으로 삽입되었다. 채널의 삽입은 적용된 멤브레인 전위 하에서 현재 진폭의 단계 현명한 증가에 의해 확인되었다.
CBB 방법에 의해 형성된 이중층은 두 개의 단층으로 분해될 수 있다. pTB 채널 전류는 두 개의 단층층을 부착한 직후 나타났다. 그리고 전류가 커지면서 전류의 진폭이 증가하여 CBB의 분리 부착 조작과 동기화되었다.
기포의 수가 불어나면 수성 용액의 지질 농도가 감소하고 단층이 형성되지 않는다. 그런 다음 리포솜 섹션에 대한 압력을 완화하십시오. 일단 CBB 형성 및 채널 재구성이 확립되면 증혈또는 소수성 물질을 주입하거나 주입을 통해 수성 용액 및 막의 조성물을 변화시키려고 시도할 수 있습니다.
CBB 방법은 채널 멤브레인 상호 연극을 탐구하는 다양한 방법을 열었습니다.
