이 프로토콜은 운송 시간 후에도 인간과 동물의 심장 샘플과 함께 작동합니다. 밀리그램당 최대 200개의 근세포가 진동편 절단 조직 조각으로부터 분리될 수 있습니다. 심근세포의 전기생리학적, 구조적 및 생화학적 분석은 심장 질환의 메커니즘을 발견하고 더 잘 이해하는 데 도움이 됩니다.
100밀리미터 의 조직 배양 접시를 채운 후, 20 밀리리터의 냉삭한 용액을 사용하여 조직 샘플을 배양 접시에 놓습니다. 접시에 문화 접시를 섭씨 4도까지 식힙니다. 동물과 특히 인간에게서 살아있는 조직 견본이 잠재적으로 전염성이 있다는 것을 명심하십시오.
가위 또는 메스를 사용 하 여, 샘플에서 과잉 섬유 조직 및 상피 지방을 제거 합니다. 더 큰 조직 샘플의 최적의 진동 처리를 위해 메스를 사용하여 조직에서 8 밀리미터 큐브를 자른다. 생검에서 더 작은 견본을 위해, 이것은 필요하지 않습니다.
하나는 상피 지방 층에 의해 에피카르늄을 식별 할 수 있습니다. 과도한 지방을 제거한 후, 티슈 블록을 접시에 넣고, 에피카르듐을 아래로 향합니다. 조직 포함을 준비하려면 400 밀리그램의 낮은 융점 아가로즈를 절단 용액 10밀리리터로 끓입니다.
뜨거운 용존 아가로즈 젤로 10 밀리리터 주사기를 채웁니다. 주사기를 밀봉하고 아가로즈가 평형화 할 수 있도록 적어도 15 분 동안 섭씨 37도의 수조에 놓습니다. 집게를 사용하여 트림 시편을 깨끗한 35mm 조직 배양 접시로 옮기고, 에피카르듐은 아래쪽으로 향합니다.
그런 다음 멸균 면봉으로 시편에서 과도한 유체를 제거합니다. 집게를 들고 이동에 대한 표본을 확보하십시오. 그리고 아가로즈의 주사기를 그 위에 비우고 표본을 완전히 몰입시게 하십시오.
즉시 접시를 얼음 위에 놓고 아가로즈가 10 분 동안 굳어지게합니다. 사용하지 않은 면도날을 진동의 블레이드 홀더에 장착합니다. 가능하면 블레이드의 Z 편향을 조정하여 진동을 보정합니다.
메스를 사용하여 진동의 시편 홀더에 맞는 아가로즈 조직 블록을 절제합니다. 안정성을 보장하기 위해 조직이 여전히 아가로즈에 충분히 침지되어 있는지 확인하십시오. 아가로즈 마진, 적어도 8 밀리미터.
시편 홀더에 얇은 시아노아크라일트 접착제를 발라주세요. 그리고 아가로즈 티슈 블록을 홀더에 부드럽게 누릅니다. 절단 용액으로 진동 목욕을 구축 할 수 있습니다.
그런 다음 진동의 외부 냉각 탱크를 분쇄 된 얼음으로 채우고 절단 공정 전반에 걸쳐 섭씨 4 ~ 6도의 온도를 유지합니다. 아가로즈 티슈 블록을 포함하는 표본 홀더를 진동 욕조에 넣습니다. 원고에 설명된 진동 설정을 사용하여 300개의 마이크로리터 두께의 슬라이스를 생성합니다.
심근세포 섬유가 심실 벽에 정렬되는 방식이기 때문에 병렬 에피카르듐으로 섹션을 만드는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면, 너무 많은 피해가있을 것입니다. 표준 광 현미경을 사용하여 심근세포와 조직 조각의 정렬을 확인하십시오.
조직을 손상시키지 않으려면 조직 자체 대신 아가로즈를 잡으세요. 심근세포 섬유는 균일하게 정렬되어야하며 근구는 수축해서는 안됩니다. 실험실 셰이커에 열판을 놓고 섭씨 37도까지 데우십시오.
65 RPM에서 실험실 셰이커를 시작합니다. 단백질을 용액 1의 2 밀리리터에 녹입니다. 그리고 콜라게나아제, 용액 1의 2 밀리리터로 용해하십시오.
그러나 단백질과 콜라게나아제는 혼합하지 마십시오. 콜라게나제 용액에 염화칼슘을 추가하여 5개의 마이크로몰라를 최종 농도로 유지합니다. 두 솔루션을 섭씨 37도에서 배양합니다.
집게를 사용하여 조직 조각을 깨끗한 60mm 조직 배양 접시로 옮기하십시오. 5밀리미터의 사전 냉각 절삭 용액을 제공합니다. 얼음이나 차가운 접시에 접시를 보관하고 블레이드 나 집게를 사용하여 조직에서 아가로즈를 조심스럽게 제거하십시오.
조직 슬라이스의 초기 세척을 수행하려면, 열 블레이드에 깨끗한 35 밀리미터 조직 배양 접시를 놓습니다. 그리고 미리 데워진 용액 1개로 2밀리미터를 채우게 하십시오. 제조 된 접시에 하나 또는 두 개의 조직 조각을 전송합니다.
그런 다음 세척 단계에 1 밀리미터 파이펫을 사용합니다. 슬라이스를 세척한 후, 접시에서 용액을 하나씩 제거하고 단백질제 용액의 2밀리리터를 추가합니다. 65 RPM의 셰이커와 함께 열블레이드에서 12분 동안 슬라이스를 배양합니다.
미리 데워진 용액 2밀리리터로 티슈 슬라이스를 두 번 더 씻으시면 됩니다. 다음으로, 식기에서 용액을 하나씩 제거하고 콜라게나제 용액 2밀리리터를 추가합니다. 65 RPM에서 흔들리면서 열블레이드에서 적어도 30분 동안 슬라이스를 배양합니다.
잠복 15 분 후, 가벼운 현미경으로 접시를 검사하여 무료 개별 심근세포에 대한 확인. 개별 심낭이 보일 때까지 5분마다 계속 확인합니다. 그런 다음, 미리 데워진 용액 2밀리리터로 슬라이스를 두 번 세척하여 대체 소화.
그리고 2 개의 밀리리터용액으로 접시를 리필하십시오. 미세 한 집게를 사용하여 조심스럽게 티슈 슬라이스의 섬유를 분리합니다. 심근 세포에 손상을 피하기 위해 신중하게 계속 작동합니다.
그리고 파이펫을 여러 번 피펫으로 사용하며 파이펫을 지나면 됩니다. 그런 다음, 막대 모양의 심근세포가 가벼운 현미경으로 접시를 검사하여 분리된 것을 확인합니다. 접시를 다시 37°C의 열판에 놓고 흔들어 서 동요합니다.
10 밀리몰러와 100 밀리머 칼슘 염화물 재고 솔루션을 추가하여 조직 현탁액의 칼슘 농도를 5 마이크로몰어에서 1.5 밀리몰러로 천천히 증가시면 됩니다. 칼슘 증가가 완료되면, 남은 소화되지 않은 조직 덩어리를 제거하기 위해 집게를 사용합니다. 먼저 서스펜션의 동요를 중지합니다.
다음으로, 1000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 서스펜션 상단에서 용액의 1/3을 천천히 제거합니다. 심근 세포의 포부를 피하십시오. 그런 다음 3개의 용액의 마이크로리터를 세포에 추가합니다.
10분간의 교반 후, 이 세척 단계를 반복하십시오. 서스펜션을 15밀리리터 원심분리튜브로 옮기. 그리고 심근세포가 실온에서 퇴적물을 최소 10분, 최대 30분 동안 허용합니다.
상체를 완전히 제거합니다. 그리고 수정된 티로드 용액 또는 원하는 실험 버퍼에서 펠릿을 다시 중단한다. 가벼운 현미경을 사용하여 세포 품질을 확인합니다.
심근세포의 30~50%는 막 결점 없이 도장 모양으로 매끄럽게 만들어야 합니다. 그리고 표시, 명확한 교차 줄무늬. 격리 효율을 확인하기 위해, 프로토콜은 쥐 심근에 적용되었다.
그리고 관상 동맥 관류 및 격리를 통해 격리와 비교하여 작은 조직 덩어리에서. 프로토콜을 사용할 때 막대 모양 의 세포의 낮은 비율이 관찰된 다음 관류에 의해 격리된 후 관찰되었다. 그러나 총 수는 여전히 높았다.
대조적으로, 조직 덩어리에서 격리, 적은 막대 모양의 세포를 산출. 유동 세포측정은, 결과를 정량적으로 비교하는 데 사용되었다. 조직 조각에서 심근세포의 분리는 관상 동맥 관류에 의해 얻어진 수율에 도달하지 않습니다.
그러나 조직 덩어리에서 심근 세포 격리보다 훨씬 높은 수율을 제공합니다. 다음으로, 프로토콜은 인간 심근에 적용되었다. 심근 조각에서 격리, 하이드 숫자와 막대 모양인간의 심근 세포의 큰 비율을 산출.
그리고 둥근 심근 세포의 단지 작은 비율. 심근 조각에서 격리, 조직 덩어리에서 격리 보다 막대 모양의 심근 세포의 눈에 띄게 높은 수 결과. 광정수화는 심근 슬라이스로부터 분리된 후 심근세포 생존가능성이 실질적으로 높다는 것을 확인했습니다.
기술된 프로토콜로 분리된 인간 세포는 구조 적 분석을 실시할 수 있다. 알파 액틴 염색, 조밀 한 일반 Z 라인 패턴과 1.92 마이크로 미터의 평균 sarcomere 길이를 공개, 휴식 심근 세포에. LTCC 및 RyR 염색, 명확한 클러스터가 세포막 과 T 튜블러 근처에서 공동 국화되는 것으로 나타났다.
고립 된 심근 세포는 흥분 하 고 세포 전기 생리학 또는 흥분 수축 커플링에 대 한 연구에 사용할 수 있습니다. 행동 잠재적인 모양과 지속 시간, 다른 사람에 의해 보고 된 범위에 있었다, 심실 심근 세포에 대 한, 실패 인간의 마음에서. 칸 보컬 라인 스캐닝에 의해 기록 된 칼슘 과도, 자극 후 명확한 업 스트로크를 보여 주었다.
그리고, 잡음 비율에 허용 신호. 수축에 의한 심근세포 단축은 하부 세포 경계의 편향으로부터 볼 수 있다. 이 프로토콜에 의해 얻어진 이졸개 심근세포의 수가 많기 때문에 세포 배양이 가능합니다.
이것은 인간 심근세포의 유전자 전달, 약리학 시험 및 조직 공학을 허용할 수 있습니다. 중요한 응용 프로그램은 인간 세포에 있는 동물 모형에서 사실 인정의 확인입니다. 심부전은 매우 제한된 치료 옵션을 가진 임상 증후군입니다.
향상된 심근세포 격리 기술은 진단과 미래 치료를 위한 세포 표적을 확인하는 것을 도울 것입니다.
