우리는 HL-1 세포 및 세부 유지 보수 프로토콜을 제공하기 위해 박사 Claycomb에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 우리의 듀얼 채널 광학 매핑 시스템에 대한 몇 가지 액세서리를 만드는 그의 도움을 셀 영화 씨와 피트 카론를 생성하는 그들의 도움 씨 엘레나 카리 박사 세스 Robia에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 (XA에 10GRNT3770030 &amp; 12GRNT12050478) 미국 심장 협회 (American Heart Association), 국립 보건원 (XA에 HL113640) 및 (XA에) 로욜라 대학 연​​구 개발 기금에 의해 지원되었다.

1. 솔루션 준비 <ol><li> 노르 에피네프린 (NP) 솔루션 <ol><li> . 정제 밀리-Q (MQ) 물 25 ㎖에 30 mM의 아스코르브 산 (0.1475 g의 아스코르브 산 25 ml의에 순이익 40 mg을 녹이고 노르 에피네프린 (NP)은 민감한 빛 때문에이 솔루션을 준비하는 동안 직사광선에 노출을 피하십시오. </li><li> 0.22 μm의 주사기 필터 NP 용액 필터. -20 ° C에서 1 ml의 멸균 마이크로 튜브에 솔루션 및 저장 나누어지는. 냉동 후에, NP는 한 달 동안 안정하다. </li></ol></li><li> 보충 세척 및 최종 Claycomb 미디어 <ol><li> Claycomb 매체 43.5 ㎖로 시작하여 소 태아 혈청 (FBS) 5 ㎖, 페니실린 / 스트렙토 마이신을 0.5 ㎖, NP 0.5 ㎖의 1로 보충 : 최종 보충 Claycomb 배지 50 mL로 L 글루타민 희석 100. Claycomb 매체가 빛에 민감하기 때문에이 솔루션을 준비하는 동안 직사광선에 노출을 피하십시오. </li><li> 한모금과 동일한 조리법을 사용하여 세척 Claycomb 매체를 준비제외 대상으로 실시 Claycomb 매체는 5 % FBS를 추가하고 NP 및 L 글루타민 요소를 생략. 참고 : 직사광선에 노출하지 않고 4 ℃에서 저장 될 때 보충 최종 워시 Claycomb 미디어는 2 주 동안 좋다. </li></ol></li><li> 콩 트립신 억제 솔루션 <ol><li> 칼슘 - 무료 및 마그네슘이없는 둘 베코의 인산염 완충 생리 식염수 100 ㎖ (PBS)로 대두 트립신 억제제의 25 mg을 녹인다. </li><li> 0.22 μm의 주사기 필터를 사용하여 용액을 필터. 참고 : 4 ° C에서 저장 될 때 멸균 솔루션은 1 개월 안정적이다. </li></ol></li><li> 젤라틴 / 피브로넥틴 요리 코팅 용액 <ol><li> 0.02 % 젤라틴 있도록 MQ 물 500 ㎖ 중에 젤라틴 0.1 g을 녹이고. </li><li> 오토 클레이브 후, 0.02 % 젤라틴 199 ㎖ 중에 1 ml의 피브로넥틴을 희석하고 부드럽게 혼합한다. </li><li> 나누어지는 -20 ° C에서 젤라틴 별도의 튜브에 솔루션 및 저장의 6 ml의. </li></ol></li><li> 행크스 &#39;소금 솔루션 <ol><li> 파문을 사용하여판은, 염화나트륨 (136.9)의 KCl (5.366), KH 2 PO 4 (0.4409)의 NaH 2 PO 4 (0.4000), 황산 (0.8142), D-Glc를을 MQ 물 (밀리몰 / L)에 다음과 같은 염을 용해 (5.051)의 NaHCO3 (4.162), HEPES (5.042), 염화칼슘 2 (1.261). </li></ol></li><li> 칼슘에 민감한 염료 (Rhod2) 솔루션 <ol><li> Rhod2는 -20 ° C에서 원액 저장을 염색 할 DMSO 20 % 플루로 닉 F-127의 400 μL에 Rhod2 건조 분말 1 mg을 희석. </li><li> 실험을 시작하기 전에 최종 작업 솔루션을 만들기 위해 1000 행크스 &#39;소금 용액이 원액 1을 희석. </li></ol></li><li> 전압에 민감한 염료 (Rh237) 솔루션 <ol><li> -20 ° C에서 원액 및 저장을 할 DMSO 2 ㎖로 Rh237 5 ㎎을 희석. 실험을 시작하기 전에 최종 작업 용액을 만들기 위해 1000 행크스 식염수 : 원액 1 희석. </li></ol></li></ol> &amp; #(160); 참고 : 1-4 솔루션은 약간의 수정과 Claycomb HL-1 세포 배양 프로토콜을 기반으로합니다. 2.과 Passaging 및 배양 HL-1 심방 근육 세포 Coverslips는 상 참고 : HL-1 세포 박사 Claycomb (루이지애나 주립 대학)에서 얻을 수 있습니다. <ol><li> T25 플라스크에 HL-1 세포 성장과 매일 보충 Claycomb 중간의 5 ml로 공급. 통로는 T25에서 세포 Claycomb HL-1 세포 배양 프로토콜 (후술) (10)에있어서 5 일마다 형틀. </li><li> 24 시간 T25 플라스크에서 세포 전에 12-well 배양 판에 장소 라운드 된 커버 (20mm 직경) 계대 배양 한 다음 37 ℃에서 하룻밤 젤라틴 / 피브로넥틴로 된 커버를 커버 할 완전히 합류와 준비가되어 있습니다. </li><li> 다음 날, 기음과 문화 판에서 젤라틴 / 피브로넥틴을 취소하고 잘 각각 보충 최종 Claycomb 매체의 1.5 ml로 교체합니다. </li><li> T25의이 배양에서 분할 세포대기음이 합류 문화를 포함하는 T25 플라스크 매체는 37 ° C에서 PBS 짧게 문화를 씻어 하루 5에서 전체 합류에 도달 한 후 전자 플라스크. </li><li> PBS 및 기음 셀과 직접 접촉을 피하기 위해 T25 플라스크의 바닥에 트립신 / EDTA를 피펫 팅하여 37 ° C에서 3 ml의 0.05 % 트립신 / EDTA를 추가한다. 1 분 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> 흡인에 의해 트립신 / EDTA를 제거하고 T25 플라스크 당 다른 트립신의 1.3 ㎖ / EDTA를 추가합니다. 1 분 동안 실온에서 배양한다. 현미경으로 검사하고 세포가 여전히 플라스크에 부착하는 경우, 완전히 남아있는 세포를 이동시키다 누릅니다. </li><li> 15 ㎖의 원심 분리 관으로 플라스크에서 세포와 세포를 전송에 대두 트립신 억제제의 1.3 ML을 추가합니다. 워시 Claycomb 매체의 5 mL를 빈 플라스크를 씻어. 15 ㎖의 원심 분리기 튜브에 세포에 린스를 추가합니다. 5 분 동안 500 XG에 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 뜨는을 기음과 원심 분리 한 후 세포 펠렛을 다시 중단보충 최종 Claycomb 배지 6 ㎖ 중의. </li><li> 세포 계대의 세포 현탁액 0.5 ml로 12- 웰 플레이트의 각 웰을 시드. 매일 신선한 보충 최종 Claycomb 매체와 세포를 공급. 주 : 밀접 세포의 성장을 모니터링 전형적 세포 단층을 4 일째에 합류 상태에 도달하고 자발적인 활동이 계속 표시. 이후, 배양 된 단층은 하루 4-5 광학 매핑을위한 준비가 될 것입니다. </li></ol> 셀 3.로드 칼슘 및 전압에 민감한 염료 <ol><li> 광학적 맵핑 연구 부드럽게 12 웰 세포 배양 플레이트로부터 커버 슬립을 제거하고 행크스 식염수로 세정. </li><li> 칼슘 민감성 염료 Rhod2으로 세포를 염색하기 위해, 3 ㎖와 커버 슬립에서 세포 단층을 부화 산소를 30 분 동안 수욕에서 37 ° C에서 Rhod2 작업 용액 (5 % CO 2 / 95 % O 2 가스로 버블 링) . </li><li> V m에 민감한 염료와 세포를 얼룩Rh237는 또 다른 15 분 동안 수조에서 37 ° C에서 산소화 Rh237 작업 용액 3 ㎖에 Rhod2로드 셀 단층 몰입. </li></ol> 4. 듀얼 채널 광학 매핑 <ol><li> 거꾸로 형광 현미경에 순환 챔버로, V의 m과 칼슘 염료로 두 번 스테인드 세포 단층을 놓습니다. 35 ± 1 ℃에서 셀 챔버의 온도를 유지하기 위해 가열 된 순환 시스템을 사용한다. 챔버에 걸쳐 조심스럽게 0.3 ° C의 구배를 방지하기 위해 상기 챔버를 통해 순환하는 흐름의 속도를 조절하여 관류 액의 온도를 제어한다. <ol><li> V의 m / CA 신호를 기록하기 전에, 이전의 염색 공정에서 잔존 염료를 제거하기 위해 약 5 분 동안 신선한 행크스 용액으로 세포 단층을 세척한다. </li></ol></li><li> 행크스 염 용액과 SILV 가득 유리 피펫으로 이루어지는 쌍극 전극을 이용하여 페이스 건강한 세포 단층어 이전으로 피펫 팁 주위 코일 와이어 12,17 설명했다. </li><li> 약 1 MV를 서성 거려 임계 값을 기대 2 밀리의 200 ~ 500 밀리 초 펄스 폭의 사이클 길이의 페이스 건강한 세포 단일 층. 주 : 단층 배양의 각 배치에 대해 적어도 2 개의 비 처리 된 단층은 셀 배치의 조건을 검사하는 데 사용되어야한다. 건강한 제어 단일 층은 200 ~ 500 밀리의주기 길이에 전기 페이싱에 의해 포착 할 수 있어야합니다. 제어 단층 전기적으로 진행되어야하지 않으면,이 셀 전체 일괄 광학적 맵핑 실험에 적합하지 않을 수 있다는 것을 시사한다. </li><li> V의 m 및 CA 민감한 염료 모두를 여기 시키는데, 여기 필터 (파장 510 ㎚ / 40) 및 다이크로 익 미러 (561 ㎚)과 결합 된 LED 광원 (520 nm 파장)를 사용한다. <ol><li> V m을 구성 요소로 다이크로 익 미러 (594 ㎚)과 칼슘 성분과 40X 목표 및 분할을 통해 세포에 의해 방출되는 형광 신호를 수집합니다.대역 통과 필터와 칼슘 채널에서 긴 통과 필터 (700 ㎚) 및 출사 광 V의 m 채널에서 방출 된 광을 필터 (40분의 585 ㎚). </li><li> 두 개의 CCD 카메라 (; RedShirt 이미지 80 X 80 픽셀, 1000 FPS)를 사용하여 필터링 된 형광 빛을 수집합니다. </li><li> 염료 광표백을 방지하기 위해, 노광 시간을 제한하기 위해 각 시야마다에 2 초 미만에 대한 기록을 만든다. 여기에, 일반적으로 이미지를 각각의 단층에 대 한 4 개의 서로 다른 영역. </li></ol></li></ol> V m 또는 칼슘 녹음 5. 데이터 처리 <ol><li> 모두 V의 m 및 CA 신호 (80 X 80 픽셀)의 경우, 배경 잡음을 줄이기 위해 다른 기록 시점에서 1 휘도 값으로 강도 스물 다섯 (5 × 5)의 값이 인접한 화소의 평균. 주 : 데이터를 평균화 한 후, 개별 활동 전위 또는 CA 과도의 각 기록 시점 평균화 × 16 16 강도 값들을 평균화 포함하는 데이터 매트릭스 (수득50 ㎛의 공간 해상도와 데이터 채널). </li><li> V m의 기록 또는 CA 신호의 활성화 시간 (AT)를 정의. <ol><li> 전술 한 바와 같이 개별 활동 전위 또는 CA 과도의 활성화 시간 (AT)를 정의하기 위해, V의 m 또는 주문품 MATLAB 기반 알고리즘을 사용하여 칼슘 신호의 피크 진폭의 50 %의 시간을 결정한다. (12) </li><li> 수동으로 프로그램 분석 중 발생할 수있는 오류를 제거하기 위해 분석의 AT를 교정. </li><li> 행렬에서 정의 저장소 사용되는 소프트웨어에 각각 기록 된 활동 전위 칼슘 과도의 (16 × 16 데이터 채널 평균). </li></ol></li><li> 이전에 약간의 수정과 함께 설명 된 바와 같이 12, 18, ​​20, 22 필드 벡터 분석 방법을 사용하여 AT 행렬에 활동 전위 또는 칼슘 과도 전도 속도 (CV) 벡터를 계산한다. <ol><li> (5 × 데이터를 그 지점에서 주변에 데이터 채널의 상대적인 CV 벡터를 계산; 도 5는 이웃 MATLAB 프로그램 (12, 18) 내에서 최소 제곱 알고리즘을 이용하여) 표면 AT 활성화 시간 (다항식의 매끄러운 표면을 시뮬레이션하기 위해) 데이터 채널을 평균화. </li><li> 아래의 수식을 사용하여 전도 벡터를 계산 포뮬러 1 : <img alt="식 (1)" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52542/52542eq1.jpg" /> 화학식 2 : θ θ를 (DY / dT를) / (DX / dT를)] 주 : Ve로는 X 축 및 Y 축에 투영 CV 벡터이고; DX / dT를는 X 축에 CV 벡터의 투영이고; DY / dT를는 Y 축에 CV 벡터의 투영이다. T는 AT면이고; X, Y 좌표의 2-D 참조; X = T ∂T / ∂x는 X에 대해 T의 편미분이고; T의 Y = ∂T / ∂y는 Y에 대하여 T의 편미분이고; CV θ는 벡터의 최종 방향이다. </li><li> 나침반에 10도 섹터를 커버 각각 36 경로,에 AT 행렬의 그룹 모든 벡터. &lt;/ 리&gt; <li> (36) 전도 경로 중 CV 벡터의 최대의 인구를 포함하는 경로를 선택합니다. 단일 층의 CV를 나타 내기 위해이 경로의 평균 CV를 계산합니다. </li></ol></li></ol> 웨이브 프론트 전파 6. 시각화 <ol><li> MATLAB 소프트웨어를 사용하여 피크 값에 대해 상이한 기록 된 시점에서 각각의 활동 전위 또는 CA 과도의 신호 강도를 정규화한다. </li><li> 일시적 사용 MATLAB 소프트웨어의 16 × 16 매트릭스의 강도에 기록 된 모든 시점의 정규화 된 강도 데이터를 저장한다. </li><li> surf.m 기능을 사용하여 각 기록 시점의 저장 강도 매트릭스에서 색상 코딩 된 강도 맵을 구축합니다. 참고 : 강도지도에서 빨간색 V m 또는 칼슘 신호의 높은 강도를 나타내며, 파란색 형광 신호의 낮은 강도를 반영한다. </li><li> avifile.m 기능을 사용하여 .avi 파일을 만듭니다. </li><li> 모든 I 절감addframe.m 함수를 사용하여 활동 전위 또는 CA 과도 상이한 기록 시점에서지도 ntensity. 주 :이 시점에서, V의 m 및 CA 전파 개의 분리 AVI 파일이 생성 될 것이다. </li></ol>

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No conflicts of interest declared.

이 문서에서는 칼슘 및 전압에 민감한 형광 염료로 염색 배양 HL-1 심방의 심근 세포 단일 층에 광학 매핑의 주요 측면에 대해 설명합니다. 또한, 최적의 HL-1 세포 단층, 매핑 장치의 설정을 배양하는 배양 된 단층을 매핑 및 데이터 분석을 포함한다. 성공적으로 배양 된 세포를 매핑, 키는 균일하게 분포 된 세포 단층을 제조하는 공정이다. 커버 슬립에의 세포를 파종 할 때, 균...

고유 칼슘 (Ca) 및 전압 (V의 m) 듀얼 채널 광학 매핑 기술 1-5 동시에 그대로 마음과 배양 세포 단일 층에 모두 V의 m과 칼슘 신호를 기록 할 수있는 효율적인 도구로 부상하고있다. 이 기술은 가능한 더 부정맥의 전기 생리 기본 메커니즘을 이해하기 위해 칼슘 과도 활동 전위와의 관계에 관한 강력한 정보를 얻을 수있다. 배양 세포 단일 층은 심장 전기 생리학 및 부정맥의 기본 메커니즘을 연구하는 유용한 셀룰러 모델로 입증했다. 4,6-8 HL-1 세포가 잘 특성화 심방 근육 세포 배양 라인입니다. HL-1 세포는 형태 학적, 전기 생리 및 성인 심방 근육 세포의 약리학 적 특성을 포함하는 차별화 된 유전자형과 표현형을 유지한다. 이 세포들은 importa을 포함한 심장 유전자와 단백질을 표현NT 심장 이온 채널 (즉, L- 및 T 형 칼슘 채널) 9 sarcomeric 수축성 단백질의 성숙 이성체가 정상적으로 등의 성인 심방 근육 세포에서 발견 우리는 이전에보고했다. (10-13) 또한, HL-1 세포가 될 수 2 차원 (2-D) 심근 세포의 단층을 형성하기 위해 배양 하였다. 따라서, 배양 된 HL-1 단층을 사용할 때의 장점은 1) 상대적으로 낮은 비용과 더 쉽게 분리 및 일차 배양 신생아 심근 세포보다 심근 세포 배양 라인을 유지하기; 2) 세포가 단층은 심장의 3-D 구조로 인한 구조의 복잡성을 감소시킨다; 3) 세포 단층은 그대로 심장에서 발생하는 간질 섬유화의 간섭을 제거 할 수 있습니다. 이것은 간질 섬유 아세포 행렬의 간섭없이 근세포의 특정 그룹의 전기 생리 학적 기능을 절개하는데 사용될 수있다; 막 다른 골목에서 약리학 또는 유전자 조작에서 기능적 결과 4) 평가여 체계적인 세포 단층을 효과적으로 달성 할 수있다. 따라서, HL-1 세포는 심근 세포 생리학의 다양한 측면뿐만 아니라 페이싱에 의한 비정상적인 전기적 활동을 연구하는데 널리 사용되는 셀룰러 모델이되고있다. 외부에 응답 13-16 그러나, 특별한 취급 및 관리 문화에 필요한 건강한 세포 단일 층 광학 매핑 연구를위한 전기 서성 거려. 또한, 이중 형광 염료 염색 과정은 쉽게 세포 배양 합류 단층의 무결성을 손상시킬 수있다. 따라서, 배양 HL-1 단일 층에서 수행 V의 m / CA 듀얼 채널 광학 매핑은 큰 도전이었다. 이 방법의 목적은 성공적으로 배양 HL-1 단층 듀얼 채널 광 맵핑을 수행하기위한 주요 단계를 제공하는 것이다. 여기에서 우리는 HL-1 세포 단층 준비, 배양 세포 단층의 듀얼 채널 광학 매핑 및 매핑 데이터 처리에 최적화 된 프로토콜에 대한 광범위한 정보를 제공하고 있습니다.

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	<tbody>
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		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhod2 dry powder</td>
			<td style="width:103px;">&#160;AAT Bioquest</td>
			<td style="width:119px;">21062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pluronic</td>
			<td style="width:103px;">AAT Bioquest</td>
			<td style="width:119px;">20050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">DMSO</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rh237</td>
			<td style="width:103px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">&#160;S-1109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KH2PO4&#160;</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4&#160;</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPEs</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

voltage and calcium dual channel optical mapping of cultured hl-1 atrial myocyte monolayer

광학 매핑은 하트 생체 EX 모두 그대로에 배양 심근 세포 단층에서 심장의 전기 활동을 검출하는 유용한 기술로 입증되었다. HL-1 세포는 심장 생리학 널리 다양한 양상을 연구하기위한 2 차원 모델 세포로서 사용되어왔다. 그러나, 배양 HL-1 심방 세포 단층의 한 시야에서 동시에 광학적지도 칼슘 (Ca) 과도 및 활동 전위에 큰 도전이었다. 특별한 처리 및 관리에 전기적 및 광학적 캡처 매핑 될 수 건강한 세포를 준비 할 필요가 있기 때문이다. 따라서, 우리는 듀얼 채널 광학 매핑을위한 최적의 작업 프로토콜을 개발했습니다. 이 논문에서는 듀얼 채널 광 매핑 실험을 수행하는 방법을 상세히 설명 하였다. 이 프로토콜은 부정맥 개발 활동 전위의 전파 및 CA 역학의 이해를 향상시키는 유용한 도구이다.

영화 1에서 입증 된 바와 같이 배양 합류 단층는 일반 고유 리듬을 나타낸다. 우리는 다음 완전히 합류 HL-1 단층에서 V의 m / CA 듀얼 채널 광학 매핑을 수행 하였다. 그림 1a는 기록 하나에서 V의 m과 칼슘 신호의 예 흔적을 보여줍니다 이길. 균일하게 전파 V의 m 및 듀얼 채널 광 매핑 시스템을 이용하여 칼슘 신호의 대표적인 등시성지도는도 1b ...

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Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

배양 된 HL-1 심방 근육 세포 단층의 전압 및 칼슘 듀얼 채널 광학 매핑

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

voltage-calcium-dual-channel-optical-mapping-cultured-hl-1-atrial

Research

JoVE Journal

Biology

10.1K 조회수.  Loyola University Chicago. This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

비디오: Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

현미경의 올바른 관리 및 청소

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

연구

생물학

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

단계 대비 및 차등 간섭 대비 (DIC) 현미경

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Langendorff - perfused 랫 하트의 광학 매핑

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Optical Recording of Electrical Activity in Guinea-pig Enteric Networks using Voltage-sensitive Dyes

The enteric nervous system (ENS) is a self-contained network with identified functions, capable of performing complex behaviors in isolation. Its neurons (10 to 25 &mu;m in diameter) are arranged in plexuses that are confined to distinct planes of the gut wall 1; the myenteric plexus can be found between the longitudinal and circular muscle layers, and the submucous plexus between the circular muscle layer and the mucosa. Since the effector systems for these plexuses (transporting epithelium, endocrine cells, immune elements, blood vessels and smooth muscle) are also contained within the gut wall, semi-intact preparations can be dissected that preserve individual components of different reflex pathways. The behavior of the effector systems is controlled by the submucous and myenteric plexuses acting in concert. Therefore, detailed knowledge of synaptic interactions within and between ganglia, and of communication between the plexuses, is essential for understanding normal gastrointestinal function. The ENS, as an intact nervous system, is a unique experimental model in which one can correlate molecular and cellular events with the electrical behavior of the neuronal network and its physiological outputs. Because of the quasi-two-dimensional organization of its plexuses, the ENS is particularly well suited for the study of neural networks using multiple site optical recording techniques that employ voltage-sensitive dyes 2,7,8,9. We will illustrate here the use of a relatively new naphthylstyryl-pyridinium dye (di-4-ANEPPDHQ) 3 that offers multiple advantages over its predecessors, including very low phototoxicity, slow rate of internalization, and remarkable chemical stability. When used in conjunction with a camera that permits sub-millisecond time resolution, this dye allows us to monitor the electrical activity of all the neurons in the field of view with a maximal spatial resolution of ~ 2.5 &mu;m at 100X magnification. At lower magnification (10X or 20X), the sacrifice of single-cell resolution is compensated by a gain in perspective, revealing the intricacies of the inter-ganglionic circuitry.

This protocol illustrates how voltage-sensitive dyes enable optical recording of electrical activity from intact neural networks such as the plexuses of the guinea-pig enteric nervous system, with an adjustable resolution that ranges from single-cells to multi-ganglionic circuitry.

전압에 민감한 염료를 사용하여 기니 돼지 장용 네트워크에서 전기 활동의 광학 녹음

The enteric nervous system (ENS) is a self-contained network with identified functions, capable of performing complex behaviors in isolation. Its neurons ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of fluorescence can be changed by exposure to light of a specific wavelength. Optical highlighting allows noninvasive marking of a subpopulation of fluorescent molecules, and is therefore ideal for tracking single cells or organelles.
Critical parameters for efficient photoconversion are the intensity and the exposure time of the photoconversion light. If the intensity is too low, photoconversion will be slow or not occur at all. On the other hand, too much intensity or too long exposure can photobleach the protein and thereby reduce the efficiency of photoconversion.
This protocol describes a general approach how to set up a confocal laser scanning microscope for pc-FP photoconversion applications. First, we describe a procedure for preparing purified protein droplet samples. This sample format is very convenient for studying the photophysical behavior of fluorescent proteins under the microscope. Second, we will use the protein droplet sample to show how to configure the microscope for photoconversion. And finally, we will show how to perform optical highlighting in live cells, including dual-probe optical highlighting with mOrange2 and Dronpa.

This protocol describes a general approach to perform photoconversion of fluorescent proteins on a confocal laser scanning microscope. We describe procedures for the photoconversion of puried protein samples, as well as for dual-probe optical highlighting in live cells with mOrange2 and Dronpa.

라이브 세포에 형광 단백질과 듀얼 프로브 광학 하이라이트 기능을 정화의 Photoconversion

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

손쥐 심방과 심실 Cardiomyocytes의 절연 및 KV 채널 레코딩

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

횡단 단백질의 재구성, 현미경 및 패치 클램프 연구 거대한 단일 층 소포에 전압 게이트 이온 채널, KvAP,

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells in the pathogenesis of various renal diseases has been established since podocyte injury leads to proteinuria and foot process effacement. It was previously reported that various endogenous agents may cause a dramatic overload in intracellular Ca2+ concentration in podocytes, presumably leading to albuminuria, and this likely occurs via calcium-conducting ion channels. Therefore, it appeared important to study calcium handling in the podocytes both under normal conditions and in various pathological states. However, available experimental approaches have remained somewhat limited to cultured and transfected cells. Although they represent a good basic model for such studies, they are essentially extracted from the native environment of the glomerulus. Here we describe the methodology of studying podocytes as a part of the freshly isolated whole glomerulus. This preparation retains the functional potential of the podocytes, which are still attached to the capillaries; therefore, podocytes remain in the environment that conserves the major parts of the glomeruli filtration apparatus. The present manuscript elaborates on two experimental approaches that allow 1) real-time detection of calcium concentration changes with the help of ratiometric confocal fluorescence microscopy, and 2) the recording of the single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. These methodologies utilize the advantages of the native environment of the glomerulus that enable researchers to resolve acute changes in the intracellular calcium handling in response to applications of various agents, measure basal concentration of calcium within the cells (for instance, to evaluate disease progression), and assess and manipulate calcium conductance at the level of single ion channels.

Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli.

갓 격리 된 사구체 족 세포의 단일 채널 분석 및 칼슘 이미징

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

인트라 근질 그물 자리 칼슘의 광학 매핑<sup&gt; 2 +</sup&gt;와 랑겐 돌프 - 관류 토끼 심장에 막 횡단 잠재력

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...