LHB는 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 동적 셀 박사 프로그램에 의해 투자되었다; KAR은 MRC 프로젝트 교부금에 의해 투자되었다 MR / L002566 / 1 (EJR과 CLH에게 수여) 및 CLH는 우리는 또한 이미징 조언 울프슨의 Bioimaging 시설을 감사드립니다 ARUK 부여 19479.에 의해 투자되었다.

프로토콜 내의 모든 단계는 대학 브리스톨의 동물 보호 및 복지 가이드 라인과 영국 홈 오피스의 사람들의하십시오. 근골격계 해부학 1. 시각화 참고 : 근육을 정량화하고 근육 첨부 파일의 정확한 위치를 식별하기 위해, 골격 요소의 모양을 시각화하기 위해, 발현 사이 (섹션 1.1) (근육을 계시) 골격 미오신에 해당하는 나이에 물고기와 유형 II 콜라겐 (시각화 연골). 대안 적으로, 콜라겐 A1 기자 col2a1로 형질 전환 형광 기자 라인을 사용하여 근골격계 해부학을 시각화 : mCherry (13, 14)을 연골과 느린 마이 오신 중쇄 기자 smyhc를 시각화 : GFP (15)는 근육 첨부 (1.2 절)의 위치를 시각화 할 수 있습니다. 연골과 근육을 표시 대체 라인은 동일하게 작동 할 수 있습니다. <ol><li> 형광 Immunostaining <ol><li> 1 시간 동안 인산염 - 완충 염수 (PBS)에 과량의 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에서 유충을 수정. 0.1 % 트윈 20 (PBT)를 PBS로 세척하고 각각 5 분 동안 PBT 50 % 메탄올 (MeOH 중), 100 % 메탄올 탈수. 주의 : PFA는 독성 및 물질 안전 시트에 따라 처리해야합니다. 주 : 필요한 유충까지 100 % 메탄올에 저장 될 수있다. </li><li> 5 분 동안 PBT 50 % MeOH 중 유충 재수. 5 분 동안 PBT에 씻으십시오. </li><li> 5-6 분 동안 얼음에 PBT에서 0.25 % 트립신의 유충을 Permeabilize 하시려면. 5 분마다 4 배 PBT에 씻으십시오. </li><li> PBT에서 5 %의 혈청에서 2 ~ 3 시간 동안 차단합니다. </li><li> 실온에서 1 시간 또는 밤새 4 ° C에 대한 PBT에서 5 % 혈청 토끼 항 제 2 형 콜라겐과 마우스 항 - 미오신 항체의 권장 희석 애벌레를 품어. 주 : 권장 희석 범위는 항체의 데이터 시트에 일반적이다. 서로 다른 종에 대해 제기하고 또한 diffe되어 있습니다 항체를 선택조직에 임대. </li><li> PBT에서 15 분 동안 유충의 6 배를 씻으십시오. </li><li> PBT에서 5 %의 혈청에서 1-2 시간 동안 차단합니다. </li><li> 어둠 속에서 이차 항체에 품어. 특정 항체에 대한 5 %의 혈청 및 PBT에서 적절한 희석에 형광 표지 된 항 마우스 (550) 및 항 - 토끼 (488) 차 항체를 사용합니다. </li><li> 가능한 한 빨리 10 배의 공 초점 현미경에 PBT 및 이미지 10 분씩 세척 6X. </li></ol></li><li> 영상 근골격계 형상 <ol><li> Danieau의 솔루션 (16)에 미지근한 0.3 % 저 융점 (LMP) 아가로 오스의 커버 슬립에 복부 애벌레를 탑재합니다. 참고 : 형질 전환 물고기는 장착하기 전에 및 이미징 동안 0.02 %의 MS222 (Tricaine의 메탄, pH가 7)에 진정해야합니다. </li><li> 10 배 대물 렌즈와 약 2.5 배 디지털 줌을 사용하여 관심 영역의 공 초점 이미지 스택을 가져 가라. 488 nm의 561 N을 사용하여 녹색과 적색 채널의 이미지를 준비합니다m은 각각 레이저. 1.3 μm의 3 라인 평균의 Z 평면 사이의 간격을 512 X 512 픽셀 해상도에서 이미지. 얻어진 스택은 약 100 Z 슬라이스로 포함 할 것이다. </li><li> 티파니 시리즈로 데이터를 보냅니다. 5dpf 제브라 피쉬 유충의 근육과 연골 요소의 최대 예측은 그림 1에 나타내었다. </li></ol></li></ol> 2. 3D 표면을 생성 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 3, 4, 5 DPF에서 각 시점에 대한 대표적인 데이터 집합을 선택 (복수 샘플의 시각화 후 선택). </li><li> 3 차원 티파니 스택을 열고 분석 소프트웨어의 모든 채널을 선택합니다. 오른쪽 연골 채널을 클릭하고 이미지 필터와 평활 선택 가우스 (그림 2B)를. </li><li> 프로젝트보기에서 바로 &#39;새 레이블을 편집&#39;을 여과 이미지를 클릭하고 &#39;이미지 분할&#39;을 선택합니다. 각각의 재료, 즉, 연골와 j에 대한 새 레이블 만들기OINT. 마법 지팡이 도구를 사용하여 이미지의 연골 영역 (그림 2C, 흰색 신호, 보라색 개요)을 선택합니다. 윤곽 노이즈를 제거하기 위해 브러시 도구를 사용합니다. 참고 : 마법의 지팡이 도구를 사용하는 경우, &#39;모든 조각&#39;을 클릭합니다. </li><li> 브러시 도구를 사용하여 공동 지역을 선택하고 공동 구성 요소에 할당 (그림 2C, 블루 개요) </li><li> 상단 메뉴와 부드러운 라벨에 분할을 선택하여 한 번에 부드럽게 여러 조각. 오른쪽 3 차원 표면이 성분 (그림 2D)의 렌더링 생산하기 위해 표면을 생성하는 이미지를 클릭하여 선택합니다. </li><li> 표면을 클릭하고 메쉬 소프트웨어로 가져 오기위한 hmascii 파일로 데이터를 저장합니다. </li></ol> 3. FE 모델에 사용되는 근육의 힘을 계산 <ol style="margin-left: 40px;"><li> smyhc의 공 초점 이미지에서 근육 섬유의 수를 계산 : GFP 형질 전환 제브라 피쉬 (그림 1A, 화살촉, 1C)과 DIAM을 측정섬유 라 미터는 그 단면적을 계산 (πr 2). </li><li> 문헌에서 근육의 단위 면적당 적절한 힘을 확인합니다. 유생 제브라 골격근 (40 윈 / μm의 2)에 대한 단위 면적당 발생하는 최대 근력 17을 사용 하였다. </li><li> 단위 면적당의 힘에 의해 섬유의 수와 면적을 곱하여 각 해부학 근육 그룹의 힘을 계산한다. 표 1을 참조하십시오. </li></ol> 4. 메쉬 생성 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 유한 요소 메쉬를 생성 할 수있는 소프트웨어 패키지에 부 (2) (위)에서 생성 된 3 차원 모형을 가져. </li><li> 2 차원 메뉴의 수축 포장 도구를 사용하여 연골과 관절면의 A2D 메쉬를 생성합니다. 적절한 요소 크기를 선택합니다. 주 : 1.5 ~ 2.5 사이의 요소 크기를 사용합니다. 필요하다면, 상이한 크기의 2 차원면의 범위 차원 메쉬 최적화 (제 4 실시 메쉬를 생성한다.4). </li><li> &#39;&gt; 2D 도구&gt; 요소 확인&#39;을 아래에 메쉬 품질 검사를 수행 메쉬에서 중복 요소를 삽입하고 침투를 확인하기 위해 패널을. 모델 트리에서 유틸리티 탭을 사용하여 면각 각도를 수정합니다. </li><li> 3 차원&gt; Tetramesh 부속 패널을 사용하여 요소 크기를 서로 다른의 2 차원 표면 메쉬에서 3D 메쉬를 생성합니다. 주 : 다른 메쉬 크기의 결과를 비교 한 후 상기 시뮬레이션 수렴 및 기능의 정의를 손상하지 않는 최저 메쉬 크기의 FE 모델을 선택한다. 그림 3의 예는 아래턱의 연골에 대한 150 만 사면체 요소를 포함하고 2.0의 2D 요소 크기를 가지고 있었다. </li><li> 턱 모델은 형상&gt; 거리 부속 패널을 사용하여 공 초점 스택에 따라 확장 할 수 그래서 메쉬를 변환. 참고 : 연골을 확인하고 공동 구성 요소가 병합 된 모델을 수출하거나 관계를 사용하여 모델로 연결된다. </li></ol> 5. 유한 요소 모엘 건설 <ol><li> 상용 유한 요소 소프트웨어를 사용하여, FE 모델을 생성한다. 차원 근육 가이드로 부 (1)에서 생성 된 연골 표지 촛점 스택을 사용하여 근육의 어태치먼트 포인트에 대응하는 노드를 할당한다. 각 근육의 기원과 삽입을 나타내는 두 개의 노드 (그림 3) 사이의 벡터를 생성합니다. </li><li> 유형 &#39;역사&#39;의 부하 집 만들기 각 근육에 대한 &#39;C로드&#39;를 적용합니다. (단계 3.3에서 계산) 뉴턴의 크기를 지정하고 관련 벡터를 할당 할 수 있습니다. 3은 내전 mandibulae (AM), 각도기 hyoideus (PH) 및 intermandibularis (IM)에 대한 접속 지점을 보여줍니다. 주 :이 턱 근육 최대 수축력 각 부하의 50 %의 각 부위에 도포 될 수 있도록 삽입 원점 사이에 분배된다. </li><li> 문헌의 결정에 따라 적절한 탄성 등방성 재료의 특성을 할당합니다. 연골 영률이 모델의 영역 간은 각각 1.1 MPa의 0.25 MPa로했고, 푸 아송의 비율은 모두 18, 19 0.25이었다. </li><li> 모델에 초기 제약 조건을 적용하는 유형 &#39;경계&#39;의 부하 수집기를 만듭니다. 탭 분석&gt; 제약으로 이동하여 생성 서브 패널에, 당신은 제한하고자하는 모델의 노드를 선택합니다. 자유도 (DOF) 모션의 자연 범위의 가장 근사치에 모델의 한계 운동을 선택합니다. 참고 :도 3의 모델이 모션 모든 축에 구속되었다 모델의와의 중간 점에서 공간을 고정하기 ceratohyal에서 (DOF 1, 2, 3은 각각 X, Y 및 Z를 나타낸다) palatoquadrate는 제브라 피쉬 해골의 나머지 부분 (그림 3, 표 1)에 연결되는 지점에서 Y 및 Z 축. 이 모델은 적어도 하나의 노드에 세 DOF에 제한해야합니다. </li><li> 당신이 SIMUL하고자하는 운동의 각 유형에 대한 &#39;로드 단계를&#39;만들기분석 메뉴에서 (즉, 개방, 폐쇄)를 먹었고,이 운동을 시뮬레이션 (5.4 절 제)과 제약 (5.2 절에서 만든) 모든 관련 하중을 선택합니다. 이 나타나면 드롭 다운 메뉴에서 &#39;정적&#39;를 선택합니다. </li><li> 이 경우 &quot;.INP &#39;형식의 적절한 파일 형식으로 메시, 부하, 제약 및 재료 특성을 포함하여 수출 모델. </li><li> FE 분석 소프트웨어에로드 모델입니다. 만들기 및 작업 모듈을 사용하여 모델에 대한 작업을 실행합니다. </li><li> 결과 탭 및 시각화 메뉴에 등 응력, 변형, 변위에 대한 출력을 분석 (그림 4, 5). </li></ol> 턱 변형 / 변위 거리 6. 확인 <ol><li> 형질 전환 제브라 피쉬 : 3-6의 Tg (mcherry Col2a1aBAC)을 선택합니다. </li><li> 그들은 터치 그러나 그들의 마음은 여전히 ​​박동하는 응답이 중지 될 때까지 가볍게 0.02 %의 MS222와 애벌레를 마취시키다. </li><li> 산측면 미지근한 1 % LMP 아가로 오스의 커버 슬립에 (마취 상태에서) (Danieau의 솔루션에서 만든) 애벌레. </li><li> 머리 주위에서 아가로 오스를 제거하고 집게와 턱. </li><li> 정상 입의 움직임이 재개 될 때까지 파스퇴르 피펫을 사용하여 마취를 제거하는 유충의 머리 (아무 MS222)와 신선한 Danieau의 솔루션을 플래시합니다. </li><li> 입의 움직임의 밝은 필드 고속 비디오를 촬영하는 동영상 캡처 소프트웨어를 사용합니다. 높은 프레임 속도 미소 기간 주위의 동영상을 취하거나, 충분한 조 개구의 다수의 사이클을 기록. </li><li> 최대 변위에 열려 턱을 보여 프레임을 선택합니다. 멕켈의 연골의 앞쪽 끝과 μm의에서 위턱 (사골 판의 끝) 사이의 거리를 측정한다. </li><li> 여러 물고기 애벌레의 평균 변위를 계산합니다. </li><li> 모델에서 변위 데이터의 압축을 풉니 다. (모델 변위 동작을 확인하기 위해 6.8에서 계산 된 평균 변위를 사용하여 <strong&gt; 그림 4). 이 모델은 순차적으로 재료의 특성과 근육의 부하를 변경하여 예상 실행 민감도 분석에서 벗어나면. </li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어. 도 3-5의 일부 데이터가 J.Biomech, 48 (12), 브 런트 등.에서 재 인쇄 된, 유한 요소 모델링으로 인해 턱 개발, 3112-22에서 근육 긴장의 손실 관절 모양과 세포 행동의 변화를 예측하고있다. 2015 년, 엘스 비어 (15)의 허가와 함께.

유한 요소 모델은 그 뼈 형성을받은 10 균주하에 골격 요소의 영역을 연관시키는뿐 아니라 연골 내 골화 관절 형태 형성 중에 변형 8,12,21 아래 영역을 매핑하는 데 사용되어왔다. 다른 연구도 공동 개발 (11, 12) 중 변경 사항을 복제하는 이론적 인 성장 모델을 적용 할 수 있었다. 여기에서 우리는 비교적 간단한 시스템, 제브라 피쉬 턱 (20)에 대한 FE 모델을 구축하기위한 프로토콜을 보여줍니다. 여러 조직을 공부하는 등 CT 스캔 (22), 유전자 변형 라인의 공 촛점 이미징 또는 면역 염색 제브라 피쉬와 FE 모델, 원시 이미지를 수집하는 다른 방법을 달리 할 수 있습니다. 이 때문에, 연골 관련 근육 어태치먼트 포인트에 대한 직접적인 정보를 제공 할 수있다. 척추 동물 모델 중 제브라 피쉬는 유전 및 약리 조작에 특히 의무가 있습니다. 제브라 대한 FE 모델 생성두개 안면 연골 이제 공동 형태 형성에 생체 역학과 유전학 사이의 상호 작용의 추가 연구의 가능성을 열어. Fe 계 모델을 만드는 과정에 중요한 단계들이있다; 제 시스템의 정확한 삼차원 표현을 생성한다. 이 명확하게 경계를 정의하기 위해 충분히 높은 해상도의 영상을 필요로한다. 심지어 고해상도 이미지로 좋은면 하나가 일부 지역을 원활하게 할 수 있도록합니다. 다른 중요한 단계는 부하 올바른 제약의 정확한 위치를 정의한다. 불충분 구속 모델은 해결하기 위해 실패하고 부하의 잘못된 배치는 비정상적인 움직임의 원인이됩니다. 원시 데이터로부터 생성 된 표면 (그림 2B)를 메쉬하기 어려울 것 같은 원시 데이터의 일부 처리 (그림 2)이 필요하다. 우리는 가우시안 필터를 이용하여 데이터 (도 2c 필터링 </strong&gt;) 우리는 3 차원 표면으로 변환 될 수 깨끗한 윤곽선의 세트를 생성하기 위해서 곡선의 일부 수동 평활화를 수행 하였다. 너무 많은 스무딩는 많은 기능을 잃었다는 &quot;녹&quot;표면을 생성 할 수 있습니다. 올바른 요소 크기를 선택하면 요소 크기가 계산 집약적 너무 큰 메쉬를 만들어 너무 작은 선택하는 것과 반복적 인 과정이다. 그러나, 너무 큰 소자 크기를 선택하는 것은 구조체의 정확한 형상을 요점을 되풀이 실패 메쉬를 생성 할 것이다. 올바른 메쉬 턱의 정확한 형상을 포착하여 정확한 솔루션 수렴 최소 요소 크기를 가졌다 턱 변위를 이용하여 검증 하였다. 다른 연령과 종 실질적으로 다른 특성을 가질 것 같이 또한 더 정확한 변위를 모방하기 위해 재료의 특성 또는 부하 계산을 수정해야 할 수 있습니다. 항상 가상의 모델과에 제한이 있다는 것을 기억하는 것이 중요하다ssumptions는 FE 모델을 실행했다. 오직 하나의 샘플 수가 적은 모델링 때 개인 사이의 작은 변화 될 가능성이 있기 때문에 대표 샘플이 선택되도록하는 것이 중요하다. 단지 턱 요소 및 근육의 일부가 포함 된 바와 같이, 모델은 제브라 안면 근골격계 시스템의 간략화 된 버전이다. 따라서, 제약 모델링 턱 요소가 두개골의 나머지 부분과 연결하는 것 인 고려하여 배치 할 수 있었고, 모델은 인위적으로 &#39;공간&#39;에서 그것을 해결하기 위해 중앙에 제약을 받았습니다. 이 인공 제약은 자체 분석하지 않은 ceratohyal으로 모델에서 도출 해석에 영향을주지 않았다. 두개 안면 구조의 이상 포함은, 예를 들면 sternohyals와 연결된 연골 (23) 등 특히 다른 턱 개방 근육이 모델에 추가 할 수 있지만 제한은 유한 요소 소프트웨어에서 실행하는 데 더 큰 모델의 기능이 포함됩니다. S = &quot;jove_content는&quot;&gt; 또 다른 제한이 스프링 (8)의 삽입에 의해 달성 될 수 있지만, 우리는 인대 삽입을 모델화하지 않은 점이다. 이 경우 제 또 다른 가정은 모델이 선형으로 동작한다고 하였다. 모델에 균주의 크기는 게시 된 모델에 필적했고 균주가 3,500 이하 및 제약과 근육의 부착 점에서 떨어져 -5,000 μɛ 이상되는으로, 체외 세포 10, 24에 적용. 따라서, 모델의 해당 영역에서의 변형은 선형 모델에 대한 허용 가능한 범위 내에있는 것으로 간주 하였다. 연골 선형 재료로 완전히 동작하지 않고, 이전 모델 (25) 내의 유체의 거동 분석을 사용하도록 설정된 poroelastic 재료로 모델링되었다. 로컬 노드의 클러스터 사이에 근육 어태치먼트 포인트 확산하여 피크 힘을 분산하고보다 정확하게 특정 근육 대 근육 삽입을 나타내는 것이다. ENT는 &quot;&gt; FE의 사용은 구조에 작용하는 긴장과 스트레스의 평가를 할 수 있습니다.이 자주 정형 외과, 고생물학 및 최근 발생 생물학 등 많은 생명 과학 분야에서 사용되는 기법으로. 여기에 우리가 제브라 피쉬에 대한 FE에 구축하는 방법에 대해 설명합니다 아래턱. 향후이 모델은 미각을 포함, 전체 턱을보고하도록 확장 될 수있다. 유사 기술은 지금까지 대부분의 운동에 의해 연구되어왔다 물고기 척추 생체 역학을 모델링하는 데 사용할 수 있습니다.

유한 요소 모델링 계산 계산 구조 (1)에 작용하는 스트레인의 크기와 위치를 매핑 할 수 공학 기술이다. 모델은 &quot;유한 요소&quot;의 메쉬로 표시되는 3 차원 구조로 구성하고, 분석의 최종 결과는 메쉬, 기계의 크기와 위치의 소자의 구조와 개수를 포함한 다수의 인자에 의해 지배되고 하중과 재료 특성. 재료 특성은 부하의 특정 유형에 따라 재료의 행동의 특정 측면을 설명; 샘플 연신시 포아송 비는 길이 재료의 폭에 비례 한 감소를 설명하면서, 영률 (E)은 재료의 탄성을 설명한다. FE 모델링 &#39;구조에 대한 계정에 고유 한 입력 데이터를 고려하여 모델의 변위, 응력, 변형 및 압력 작용 등 다양한 변수를 계산하기 위해 사용될 수있다;의 모양, 위치 및 하중의 크기와 특정 재료의 특성. FE 모델링 널리 공학 2 점차 (3) 정형 외과 및 생물학적 응용 프로그램 (4)에 사용됩니다. 개발 역학적 힘 세포 반응 5-8를 활성화하는 많은 세포에서 자극의 역할을하는 것으로 알려져있다하고 기관계 개발 내의 상대 위치 및 기계적 자극의 크기를 모두 예측하기 위해 유용하지만, 현재 FE 모델링은 거의 사용되고 제브라 피쉬의 개발. 두 연골 및 뼈 mechanosensitive 물질로 밝혀졌다. 예를 들어, 시험 관내 압축 장력 9 골 형성에 필요한 것으로 밝혀졌다 반면 연골 경로를 활성화하는 것으로 밝혀졌다. FE 분석 (FEA)을 기용 뼈 동안 골격 요소에 작용을 포함하여, 생물학적 시료에 작용하는 균주를 모델로 활용하고있다rmation 10. 이 이론 생체 역학적 힘 (11, 12)에 노출 된 경우와 병아리 무릎 관절 형태 형성 8시 본 균주의 패턴을 표시 한 후 다른 개발 응용 프로그램은 관절의 모양을 예측하는 사용을 포함한다. 이 프로토콜은 조직 현상의 메커니즘을 이해하는 도면으로 공 촛점 이미지로부터 3 차원 표면 메시와 유한 요소 모델을 생성하는 경험을 공유 할 목적으로한다. 우리는 또한 생체 내에서 실제 공동 변위 정보를 캡처 불구하고 FE 모델의 유효성을 검사하는 방법을 보여줍니다. 우리는 모형으로 제브라 조를 사용하지만 동일한 기술 근골격계의 구조에 3D 정보가 촛점 또는 광자 영상화함으로써 얻어 질 수있는 어떤 작은 생물학적 시스템에서 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Coll2</td><td>Abcam</td><td>ab34712</td><td>Type II collagen antibody - stains all cartilage</td></tr><tr><td>A4.1025 / MF20</td><td>Developmental studies hybridoma bank</td><td>A4.1025</td><td>Skeletal mysoin antibody - marks all skeletal muscle&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Low melt agarose</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>A9414-5G</td><td>For mounting zebrafish</td></tr><tr><td>MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate )</td><td>Sigma</td><td>E10521-10G</td><td>To make anesthetic</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Fisher</td><td>T/3760/48</td><td>sample permeablilisation</td></tr><tr><td>Dylight 488 Mouse IgG</td><td>Thermofisher</td><td>35502</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>Dylight 550 Rabbit IgG</td><td>Thermofisher&amp;nbsp;</td><td>84541</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>SP8/SP5 or SPE confocal</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td></td><td>For imaging&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LAS Leica capture software</td><td>Leica</td><td></td><td>Imaging software</td></tr><tr><td>Aviso (version 7.0.0)</td><td>FEI Visualization Science Group</td><td></td><td>3D image analysis software (Section 2)</td></tr><tr><td>Hypermesh part of the Hyperworks package (version 10)</td><td>Altair Engineering</td><td></td><td>FE model generating software (Section 4-5)</td></tr><tr><td>Abaqus (version 6.14)</td><td>SIMULIA</td><td></td><td>FE analysis software (Section 5.7-5.8)</td></tr></tbody></table>

building finite element models to investigate zebrafish jaw biomechanics

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical strain. Skeletal joints are subjected to dynamic mechanical loading. Finite element analysis (FEA) is a computational method, frequently used in engineering that can predict how a material or structure will respond to mechanical input. By dividing a whole system (in this case the zebrafish jaw skeleton) into a mesh of smaller 'finite elements', FEA can be used to calculate the mechanical response of the structure to external loads. The results can be visualized in many ways including as a 'heat map' showing the position of maximum and minimum principal strains (a positive principal strain indicates tension while a negative indicates compression. The maximum and minimum refer the largest and smallest strain). These can be used to identify which regions of the jaw and therefore which cells are likely to be under particularly high tensional or compressional loads during jaw movement and can therefore be used to identify relationships between mechanical strain and cell behavior. This protocol describes the steps to generate Finite Element models from confocal image data on the musculoskeletal system, using the zebrafish lower jaw as a practical example. The protocol leads the reader through a series of steps: 1) staining of the musculoskeletal components, 2) imaging the musculoskeletal components, 3) building a 3 dimensional (3D) surface, 4) generating a mesh of Finite Elements, 5) solving the FEA and finally 6) validating the results by comparison to real displacements seen in movements of the fish jaw.

근육 (도 1a)과 연골 (도 1b) 또는 트랜스 제닉 리포터 촬상 면역 염색 (도 1C)는 관련된 근육과 함께 턱의 3 차원 구조를 시각화 할 수있다. 고해상도로 촬상하여 턱의 3 차원 형상 (도 2)의 위치 및 부하의 위치 (도 3) 모두를 캡처하는 모델을 구축 할 수 있었다. 고속 비디오 캡처를 통해 본 생체 변위 (도 4)에서 이용 우리 모델의 운동 범위는 실제 범위 내에있는 것을 확인 하였다. 런 번 FE 모델은 응력 (도 5a), 최소 및 최대 주 변형률 (- K도 5b)와 같은 데이터의 범위를 표시 할 수있다. 이러한 결과는 세 희미하다<html> 관련보기 (그림 5 층, 5 세대, 5J, 5K)와 디지털 (그림 5E 구분 &#39;, 5E&#39;를 &#39;5I&#39;, 5I을 얻기 위해 회전하므로 모델은 세부의 미세 패턴 (그림 5E, 5I)를 참조하기 위해 확대 될 수 ensional &#39;&#39;) 표시하는 방법을 모델 전반에 걸쳐 스트레스, 변형 또는 압력 변화의 패턴입니다. 이 모델에서 정량적 데이터를 추출하는 것도 가능하다 (도시하지 않음). 모델을 검증하고 형태를 가장 정확한 재료 특성, 부하를 사용하여 메쉬하여 FE 모델 개발의 기간 동안 세포에 의해 발생되는 기계적인 환경의 최선의 추정치를 탐색하는 데 사용할 수 있습니다. 모델의 결과를 직접 셀룰러 동작 및 유전자 발현 (20)의 변화에 비교 될 수있다. <html> 1 다시 &quot;SRC =&quot;/ 파일 / ftp_upload / 54811 / 54811fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1 :. 5 DPF의 제브라 피쉬 아래턱의 근골격계 요소의 대표 이미지 5dpf 유충의 아래턱의 대표 공 초점 스택은 모든 모든 골격 미오신 얼룩 A4.1025에 대한 면역 염색 상단으로 전방 (A) (B)로 표시 유전자 변형 기자의 col2a1을 표현하는 살아있는 유충에서 모든 연골 (C) 스택을 표시 타입 II 콜라겐에 대한 면역 염색 : GFP 느린 근육 (녹색) : mCherry은 연골 (적색)과 smyhc을 표시. IA : intermandibularis 전방, 수소 이온 지수 (pH) : 각도기 hyoideus, AM : 내전 mandibulae, HI : hyoideus 열등, HI : hyoideus 우수한, CH : sternohyoideus, MC : 멕켈의 연골, PQ : Palatoquadrate, CH :. ceratohyal <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig1large.jpg" target="_blank">보려면 여기를 클릭하십시오 더 큰 버전 이 그림의.</a> &quot;fo를하기 : 유지-together.within 페이지를 =&quot;1 &quot;&gt; <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig2.jpg" /> 그림 2 : 공 초점 데이터로부터 3D 표면의 세대 공동 영역의 높은 배율을 가진 제브라 피쉬 아래턱을위한 3D 표면에 공 초점 데이터의 전환을 보여주는 이미지.. (A) 원료 촛점 데이터; (B) 가우시안 필터 적용 후의 데이터 세트; (C) 필터링 개요; (D) 3D 표면. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig3.jpg" /> 그림 3 : 제약 조건과 힘의 벡터를 보여주는 대표적인 메시 (A) 입 폐쇄와에 대한 5 DPF의 애벌레에 대한 대표 메쉬.(B)의 입 구. 하얀 점은 모델에 대한 구속을 표시하고있는 치수 (예컨대, X 및 Y 또는 X, Y 및 Z). 백색 라인은 흰색 화살표로 표시된 근력의 벡터를 근육의 위치를 ​​나타낸다. 레드 연골을 보여주고 노란색 영역 간. 이 그림은 이전에 브 런트 등. 15 년에 출판 보충 자료에서 수정되었습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig4.jpg" /> 그림 4 :. 감도 테스트 다른 연골과 영역 간 영의 계수에 대한 5dpf 제브라 피쉬에 턱 변위를 시뮬레이션 FE-모델입니다. 턱에 표시됩니다 (μm의 폐쇄 개방) 변위를 턱; 컬러 키를 사용하여 기록했다. 각 모델 (A - L)은 연골의 다른 조합 (C = 1.1, 3.1, 6.1 MPa의) 또는 영역 간 (0.25 I = 0.5, 0.75, 또는 1 MPa의) 속성이 있습니다. 가로 검은 색 화살표 (수직 검은 색 화살표로 표시)를 멕켈의 연골의 끝에서 턱 변위의 가치를 강조한다. 남성과 N 애벌레를 보여주는 최소한의 DPF (5)의 동영상에서 스틸은, 즉, 턱 (M) 폐쇄 및 최대, 즉, 턱 겹쳐 두와 (N) 완전 개방은 (O) - O에 흰색 라인 (43 μm의의) 변위를 나타냅니다. 변위가 활어에서 본 0.25 (A) 최고의 경기의 영역 간 1.1이 경우 상대 연골 특성 (O). AL이 그림의 패널은 이전에 브 런트 등. 15 년에 출판되었다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig4large.jpg" target="_blank">더 큰 적이있는을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 이온. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig5.jpg" /> 그림 5 : FE 모델에서 대표적인 데이터 유충 DPF 5에 적용된 모든 근육의 FE 모델 시뮬레이션 (A - C).. (A) 폰 미제스 (EMaxmin) (B) 최소 주 변형률 (E 민. P, μɛ) (C) 최대 주 변형률 (E 최대. P., μɛ). 턱 개방시 최대 및 최소 주 균주의 FE 모델 시뮬레이션. (D - K) : 최대 주 변형률 (. E 최대 P., μɛ) (D) 복부 턱보기 및 (E) 복부 공동보기 (E)에서이 멕켈의 연골을 통해 근위 - 말단 부분의 위치를 보여줍니다 관절과 영역 간 (E &#39;) 및 (E&#39; &#39;)에서 각각. (F) : 가로보기를 턱. (G) : 측면 공동 볼 수 있습니다. (H - K) : 최소 주 변형률 (. E 최소 P, μɛ) (H) 복부 턱보기 (I) 복부 공동보기. (I)는 멕켈의 연골 관절을 통해 근위 - 말단 부분의 위치를 보여줍니다 (I &#39;) 및 (I&#39;)는 각각 (J)의 영역 간 : 측면 턱보기를. (K) : 측면 공동 볼 수 있습니다. 이 수치는 이전에 브 런트 등. 15 년에 출판되었다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> 근육 섬유의 개수 </td><td> 근육 섬유의 면적 (㎛의 2) </td><td> 근육 그룹의 면적 (㎛의2) </td><td> 힘 (N) </td></tr><tr><td> 5 DPF intermandibularis 전방 </td><td> (5) </td><td> 23.8 </td><td> 119 </td><td> 4.76e-6 </td></tr><tr><td> 5 DPF 끄는 hyoideus </td><td> 6 </td><td> 23.8 </td><td> 142.8 </td><td> 5.71e-6 </td></tr><tr><td> 5 DPF 내전근 mandibulae </td><td> 9 </td><td> 23.8 </td><td> 214.2 </td><td> 8.57e-6 </td></tr></tbody></table> 1 번 테이블: 근육 정량화. 40 윈 / μm의 2 (참조 17에서 찍은 단위 면적당 값)을 사용하여 DPF 5에서 Intermandibularis 전방, 내전근 Mandibulae와 각도기 Hyoideus 평균 근육의 힘을 계산. (Lorga 등., 2011) (N = 3).

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Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw.

Zebrafish의 턱 역학을 조사하기 위해 유한 요소 모델을 구축

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

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9.4K 조회수.  University of Bristol. Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw. 

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Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Zebrafish의 배아에 주입 마이크로 비드

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

연구

발생학

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many myopathies affecting skeletal muscle function can be quickly and easily assessed in zebrafish over the first few days of embryogenesis. By 24 hr post-fertilization (hpf), wildtype zebrafish spontaneously contract their tail muscles and by 48 hpf, zebrafish exhibit controlled swimming behaviors. Reduction in the frequency of, or other alterations in, these movements may indicate a skeletal muscle dysfunction. To analyze swimming behavior and assess muscle performance in early zebrafish development, we utilize both touch-evoked escape response and locomotion assays.
Touch-evoked escape response assays can be used to assess muscle performance during short burst movements resulting from contraction of fast-twitch muscle fibers. In response to an external stimulus, which in this case is a tap on the head, wildtype zebrafish at 2 days post-fertilization (dpf) typically exhibit a powerful burst swim, accompanied by sharp turns. Our method quantifies skeletal muscle function by measuring the maximum acceleration during a burst swimming motion, the acceleration being directly proportional to the force produced by muscle contraction.
In contrast, locomotion assays during early zebrafish larval development are used to assess muscle performance during sustained periods of muscle activity. Using a tracking system to monitor swimming behavior, we obtain an automated calculation of the frequency of activity and distance in 6-day old zebrafish, reflective of their skeletal muscle function. Measurements of swimming performance are valuable for phenotypic assessment of disease models and high-throughput screening of mutations or chemical treatments affecting skeletal muscle function.

Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function.

터치 유발 대응 및 로코 분석 실험을 사용하여 Zebrafish의 근육의 성능 및 기능을 평가하기 위해

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be difficult to study, and can lead to confounding results. The protocol described here is a straightforward breeding paradigm to increase and decrease penetrance in lethal zebrafish skeletal mutants. Because lethal mutants cannot be selectively bred directly, the classic selective breeding strategy of progeny testing is employed. This method also includes protocols for Kompetitive Allele Specific PCR (KASP) genotyping zebrafish and staining larval zebrafish cartilage and bone. Applying the husbandry strategy described here can increase the penetrance of an interesting skeletal phenotype enabling more reproducible results in downstream applications. In addition, decreasing the mutant penetrance through this selective breeding strategy can reveal the developmental processes that most crucially require the function of the mutated gene. While the skeleton is specifically considered here, we propose that this methodology will be useful for all zebrafish mutant lines.

The goal of this protocol is to alter the penetrance of lethal skeletal mutant phenotypes in zebrafish by selective breeding. Lethal mutants cannot be grown to adulthood and bred themselves, therefore this protocol describes a method for tracking and selecting penetrance through multiple generations by progeny testing.

Zebrafish 치명적인 골격 돌연변이 Penetrance 자손 테스트 하 여 이동

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

성인 Zebrafish 부상 모델 뼈 조직 재생에 Prednisolone의 효과 연구

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians. The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal pair and a longer maxillary pair. Barbel tissue contains cells of ectodermal, mesodermal and neural crest origin, including skin cells, glands, taste buds, melanocytes, circulatory vessels and sensory nerves. Unlike most adult tissue, the maxillary barbel is optically clear, allowing us to visualize the development and maintenance of these tissue types throughout the life cycle. 
This video shows early development of the maxillary barbel (beginning approximately one month post-fertilization) and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration in the adult appendage (&gt;3 months post-fertilization). Briefly, the left maxillary barbel of an anesthetized fish is elevated with sterile forceps just distal to the caudal edge of the maxilla. A fine, sterile spring scissors is positioned against the forceps to cut the barbel shaft at this level, establishing an anatomical landmark for the amputation plane. Regenerative growth can be measured with respect to this plane, and in comparison to the contralateral barbel. Barbel tissue regenerates rapidly, reaching maximal regrowth within 2 weeks of injury.
Techniques for analyzing the regenerated barbel include dissecting and embedding matched pairs of barbels (regenerate and control) in the wells of a standard DNA electrophoresis gel. Embedded specimens are conveniently photographed under a stereomicroscope for gross morphology and morphometry, and can be stored for weeks prior to downstream applications such as paraffin histology, cryosectioning, and/or whole mount immunohistochemistry. These methods establish the maxillary barbel as a novel in vivo tissue system for studying the regenerative capacity of multiple cell types within the genetic context of zebrafish.

The zebrafish maxillary barbel is an integumentary sense organ containing ectodermal, mesodermal and neural crest derivatives. Importantly, the adult barbel can regenerate after proximal amputation. This video introduces maxillary barbel development and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration, followed by collection, embedding and downstream imaging of barbel specimens.

Zebrafish 상악 바벌의 연구 방법

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians.  The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal ...

생물학

Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish with fluorescently-marked plasma membranes can be scanned in a confocal laser scanning microscope in order to determine the volume of muscle tissue and the number of muscle fibers present. Efficient approaches for the measurement of cell number and size in live animals over time are described and validated against more arduous segmentation methods. Methods are described that permit the control of muscle electrical, and thus contractile, activity. Loss of skeletal muscle contractile activity greatly reduced muscle growth. In larvae, a protocol is described that allows reintroduction of patterned electrical-evoked contractile activity. The described methods minimize the effect of inter-individual variability and will permit analysis of the effect of electrical, genetic, drug, or environmental stimuli on a variety of cellular and physiological growth parameters in the context of the living organism. Long-term follow-up of the measured effects of a defined early-life intervention on individuals can subsequently be performed.

Optical clarity is a major advantage for cell biological and physiological work in zebrafish. Robust methods for measurement of cell growth in individual animals are described that permit novel insights into how growth of skeletal muscle and neighboring tissues are integrated with whole body growth.

변경된 전기적 활동을 받은 개별 살아있는 제브라피쉬의 골격근 성장에 대한 실시간 및 반복 측정

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish ...

<meta charset="utf8"></head><body>배양 및 뼈 생물학 연구를 위한 제브라피시 비늘 제거

In Vitro Culturing Technique for Studying Cellular Dynamics in Zebrafish Scales

Zebrafish scales offer a variety of advantages for use in standard laboratories for teaching and research purposes. Scales are easily collected without the need for euthanasia, regenerate within a couple of weeks, and are translucent and small, allowing them to be viewed using a standard microscope. Zebrafish scales are especially useful in educational environments, as they provide a unique opportunity for students to engage in hands-on learning experiences, particularly in understanding cellular dynamics and in vitro culturing methods. The main objective of this protocol is to describe a method for collecting and maintaining zebrafish scales in culture for use in a variety of biological studies using basic laboratory equipment. Additionally, the protocol details their use in understanding bone homeostasis by examining the activity of bone cells involved in bone resorption and deposition. It also includes additional protocols for general techniques, such as the visualization of nuclei and apoptotic cells. The in vitro culturing protocol produces reliable results with minimal reagents and equipment. This article discusses the benefits of using in vitro cultures of zebrafish scales to foster scientific inquiry and outlines the resources needed to support their integration into educational settings.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 제브라피시 비늘을 사용한 골세포 활동 연구 발전

This protocol offers a method to study cellular dynamics using a simple in vitro culture technique. It provides an opportunity for zebrafish researchers and educators to study cellular processes, such as those related to bone homeostasis and basic cell biology, by visualizing fluorescent nuclei and apoptotic cells within the scales.

제브라피시 비늘의 세포 역학을 연구하기 위한 체외 배양 기법

Zebrafish scales offer a variety of advantages for use in standard laboratories for teaching and research purposes. Scales are easily collected without ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

4D 공 초점 현미경을 사용하여 제브라 피쉬의 두개 안면 형태 형성 분석

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Zebrafish의 턱 역학을 조사하기 위해 유한 요소 모델을 구축

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