이 작품은 SP에 건강 보조금 R01HL089462의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

1. 양이온 성 리포좀 준비 <ol><li> lipososmes 준비에 사용되는 깨끗한 둥근 바닥 플라스크를 압력솥. </li><li> 주식 솔루션을 준비 : <ol class="lalpha"><li> - 작은 유리 병을 사용하여 10 ㎖의 클로로포름에 디메틸 dioctadecyl 암모늄 브로마이드 (DOAB)의 200 밀리그램을 녹인다. </li><li> - 작은 유리 병을 사용하여 10 ㎖의 클로로포름 콜레스테롤 200 mg의 녹인다. </li><li> - 준비 및 100 RNA의 ML / DNA-ASE 무료 증류수에 5 % 포도당을 살균하는 압력솥. </li></ol></li><li> 클로로포름과 둥근 바닥 플라스크를 씻어. 플라스크, 소용돌이 5-10 ML을 추가하고 몇 분 동안 앉아 보자. 항상 알루미늄 호일로 덮여 플라스크를 유지합니다. 플라스크에서 클로로포름을 비 웁니다. </li><li> 리포좀의 제조 : <ol class="lalpha"><li> - 둥근 바닥 플라스크에 DOAB 원액 315 μL를 추가합니다. </li><li> - 플라스크 콜레스테롤 원액 200 μL를 추가합니다. </li><li> - 플라스크에 클로로포름 9.5 ML을 추가합니다ND는 소용돌이로 섞는다. </li></ol></li><li> 37 rotavapor을 설정 ° C 100 분당 회전 수 (rpm) 이상 (100 ~ 120 RPM). rotavapor가 제대로 연결되어 흡입 튜브 물 펌프 진공 제어에 연결해야합니다. </li><li> 아르곤 가스 탱크와 rotavapor를 연결합니다. </li><li> rotavapor에 플라스크를 부착하고 수욕을 낮추는 전에 최적의 설정을 조정합니다. 반 시계 방향으로 돌려 완전히 아르곤의 첫 번째 밸브를 엽니 다. 항상 먼저이 밸브를 열고 닫습니다. 두 번째 밸브는 플라스크에 부는 아르곤 압력을 제어합니다. 압력은 항상 부드럽게해야한다. </li><li> 완전히 침수되지 않고 물을 터치 속도를 설정하는 플라스크에 충분한, 물 목욕 rotavapor을 낮 춥니 다. </li><li> 약 10 분, 모든 클로로포름이 증발 될 때까지 기다립니다. 그런 다음 컴퓨터를 중지합니다. </li><li> rotavapor 속도와 아르곤 탱크 밸브를 끕니다. 이제 플라스크 제거해야합니다. </li><li> 일에 5 % 포도당 2 ML을 추가합니다전자 플라스크 지질을 용해합니다. </li><li> 철저하게 모든 지질을 분해하는 1 ML의 피펫 팁을 사용하여 플라스크의 바닥을 긁어. 필요한 경우 긁힘 후, 두 번째 팁, 1 ML의 끝에서 플라스크에 남아있는 지질을 제거합니다. </li><li> 천천히 (15 회전) 플라스크를 소용돌이로 동안 42 ° C의 물을 욕조에 얻은 솔루션을 품어. </li><li> 냉수 sonicator 부가 가치세 (VAT)를 입력합니다. 겨우 물을 만지는 개최 플라스크 바닥 적어도 20 ~ 30 분 동안 용액을 초음파 처리. </li><li> 물에 잠겨 둥근 바닥이 시간 제로 속도에서 42시 20 분 ° C에 대한 rotavapor의 물을 욕조에 플라스크를 가열한다. </li><li> 0.47 미크론 이후, 0.22 마이크론 주사기 필터를 통해 리포좀을 필터링합니다. </li><li> 작은 압출기 사용 unilamellar 리포좀 소포의 동질적인 인구를 생성하는 50 nm의 세포막을 통해 리포좀을 필터링합니다. </li><li> 에펜 도르프 튜브에 리포좀을 전송하고 얼음에 놓으십시오. </li></ol><html> 2. 리포좀을 준비 siRNA를 - ITSN-1 단지 <ol><li> 2 ㎍ / μL의 최종 농도 20 mM의 HEPES 및 150 염화 나트륨, 산도 7.4를 포함하는 siRNA를 버퍼에 표적 마우스의 siRNA ITSN을 resuspend을. 혼합 전에 얼음에 보관하십시오. </li><li> 2 μg의 RNA (또는 400 nmol의 리포좀 : 100 μg의의 siRNA ITSN) 8 nmol의 리포좀의 비율의 siRNA ITSN 단지 : 리포좀을 준비합니다. 본 연구에서는 RNA / DNA-ASE 무료 에펜 도르프 튜브를 사용하여 갓 준비 리포좀 100 μL에 원액 (50 μM)에서의 siRNA ITSN의 50 μl를 추가했습니다. 혼합물 150 μL의 최대 한 번에 마우스 양자와 복고풍 궤도 주입 할 수 있기 때문에의 siRNA ITSN의 농도가 매우 중요합니다. </li><li> 쥐를 주입 기다리는 동안 얼음에 혼합물을 유지합니다. </li></ol> 3. 마우스 레트로 궤도 정맥 주입 (눈 소켓의 내부 각도) jove_content &quot;&gt; 모든 마우스 실험은 러쉬 대학 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 지침에 따라 승인 하였다. <ol><li> 50 ㎎ / ㎏ 체중 케타민 5 ㎎ / ㎏ 체중 xylazine (시판 혼합물)의 복강 주사로 마우스를 마취. 동물의 체중과 나이에 따라, 마취 볼륨과 농도를 조정합니다. 연구 결과 마우스에 사용되는 생쥐 6-8 주 이전 CD1 수컷 생쥐이며, 25g의 주위에 무게. 주사기 바늘이 부착 된 투베르쿨린 1 ML의 유형입니다. </li><li> 한 손으로 마우스의 귀를 잡고 눈의 내부 각도를 노출면에 마우스를 낮추십시오. 습벽 semilunaris에 중간 목표, 눈을 만지지 마십시오. </li><li> 세 축에 45도 각도로 혼합물을 포함 주사기를 들고 눈의 눈물 볏 접근. </li><li> 천천히 혼합물을 주입하고 주입 사이드와 복구 마우스를하자. 만약 큰 액체바늘 삽입 장소에서 물방울 형태의 주사기에 다시 바늘, 흡입 액을 철회하고 다시 시도하십시오. 반복 주사가 가장 완벽하게 복구 할 수 있도록, 눈을 교대로 수행됩니다. 모르는 경우,이 기술은 청색 염료 (50 μL, 메탄올 0.5 % 크리스탈 바이올렛) 주입과 푸른 혈관을 관찰하기 위해 마우스 폐를 노출하여 확인할 수 있습니다. </li><li> 이 연구에서 쥐가 사망하거나 부작용없이 3 주 동안 매일 3 회 하루 주입 하였다. </li></ol> 4. 생화학 연구를위한 마우스 폐 관류 및 조직 컬렉션 <ol start="0"><li> 1.5 ML / 분에 실행되도록 연동 펌프를 설정합니다. </li><li> 인공 호흡기, 수술대, 악기, 멸균 면봉, 면봉, 문자열, 비커, 증류수, 행크의 균형 소금, 추적 : 설정을 준비합니다. </li><li> 마취 혼합물 (100 ㎎ / ㎏ 체중 케타민을 10 ㎎ / ㎏ 체중 xylazine)를 복강 내 주사로 마우스를 마취. </lI&gt; <li> 목 수준에서 침샘을 제거하고기도를 노출합니다. </li><li> 개복술, 소비세 격막과 함께 시작하고, 폐와 심장을 노출, 개흉술에 따릅니다. </li><li> 흉선을 제거합니다. </li><li> 더 나은 정확도를 위해 광학 현미경을 사용하여 폐 동맥 카테 테르를 꽂다. </li><li> 기관 절개술을하고 tracheostoma를 사용하여 마우스를 삽관. 150 스트로크 / 분, 150 μL의 박출량의 비율로 인공 호흡기를 설정합니다. </li><li> 출구로, 왼쪽 심방을 엽니 다. </li><li> 연동 펌프와 행크의 솔루션을 사용하여 5 분 동안 혈액의 무료 마우스 폐 혈관을 붓는다 37 예열 ° C. </li><li> 동일한 유량에서 추가로 10 분 동안 추적 (8 nm의 금 알부민 16) 붓는다. </li><li> 행크의 솔루션 5 분 폐 관류하여 언 바운드 추적을 세척하십시오. </li><li> 0.1 파이프의 10 분의 4 %의 관류 (중량 / 부피) 포름 알데히드, 2.5 % 글루 타르 알데하이드, 1 % 탄닌산에 의해 폐의 현장 정착에에 따라버퍼, 산도 7.2. </li><li> 폐를 수집, 과도한 조직을 제거 작은 블록 (3분의 3 밀리미터) 잘라 고정액 혼합물의 2 ㎖를 포함하는 레이블 섬광 유리 병에 배치합니다. </li></ol> 마우스 절차를 수행하는 동안 완전히 마취 만료됩니다. 5. EM에 대한 마우스 폐 조직 처리 <ol><li> 주식 솔루션을 준비 : 1 % Palade 오소 4 veronal 아세테이트, 및 켈렌 버거 버퍼입니다. <ol class="lalpha"><li> - 1 % Palade-OSO 4 버퍼는 포함한다 : 1 ML 초산 veronal 주식, 1.25 ML 4 % 오소 4 일까지 최종 볼륨 5 ㎖에 0.1 ㎖의 N 염산과 증류수. </li><li> - 아세테이트 veronal 원액은 1.15 g 나트륨 아세테이트 andydrous 증류수 100 mL에 바르 비탈 2.94 g을 용해하여 얻을 수 있습니다. </li><li> - 켈렌 버거 솔루션은 아세테이트 veronal 주식의 2 ㎖, 0.1 N 염산 0.05 g의 우라 닐 아세테이트 2.8 mL를 5.1 mL를 포함증류수, pH가 6. </li></ol></li><li> 간단히 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼, 산도 = 7.4, 3 번 폐 블록을 씻으십시오. </li><li> 실온에서 1 시간 동안 0.1 파이프 버퍼, 산도 7.2의 4 % (중량 / 부피) 포름 알데히드에 시험편을 고정, 2.5 % 글루 타르 알데히드. </li><li> 어둠 속에서, 얼음, 후드에 1 시간 동안 1 % Palade-오스뮴과 후 고정합니다. </li><li> 켈렌 버거 버퍼를 한 번 씻어. </li><li> 실온에서 하룻밤에 2 시간 동안 켈렌 버거 버퍼의 표본을 품어. </li><li> 50 % 에탄올에 한 번 씻어. </li><li> 70 %, 95 %, 다음 2 개 15 분 100 % 에탄올 : 에탄올의 등급 시리즈, 5 분 / 각각 탈수. </li><li> 100 % 프로필렌 옥사이드, 2 개 15 분으로 전환합니다. </li><li> 프로필렌 옥사이드를 제거하고 실온에서, 바퀴 회전, 밤새 품어, 50 %의 프로필렌 옥사이드 및 50 %의 EPON 812의 혼합물을 추가합니다. </li><li> 다음날 아침, 혼합물을 제거하고 적어도 바퀴에 4-5 시간 동안 신선한 EPON 812를 추가합니다. </li><li> 채워진 두 배 테이퍼 형을 사용하여신선한 100 % EPON 812 절반 방법은 선택된 표본을 추가하고 가장자리에 배치합니다. </li><li> 60 ° C에서 인큐베이터 세트에 금형을 이동하고 그들을 48-72 시간 동안 치료하자. </li><li> 중합 할 때, 단면 (두께 60 ~ 70 nm의) 얇게 블록을 보낼 수 있습니다. </li></ol>

<ol>
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Chem. 282 (282), 17166-17178 (2007).</li><li>Uddin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipids+used+in+non-viral+gene+delivery+systems.">Cationic lipids used in non-viral gene delivery systems.</a> Biotechnology and Molecular Biology Review. 2 (2), 58-67 (2007).</li><li>Barenholz, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+lipid+composition+on+the+thermotropic+behavior+and+size+distribution+of+mixed+cationic+liposomes.">Influence of lipid composition on the thermotropic behavior and size distribution of mixed cationic liposomes.</a> J. Colloid Interface Sci. (356), 46-53 (2011).</li><li>Predescu, D. N., Neamu, R., Bardita, C., Wang, M., Predescu, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+caveolae+function+and+upregulation+of+alternative+endocytic+pathways+induced+by+experimental+modulation+of+intersectin-1s+expression+in+mouse+lung+endothelium.">Impaired caveolae function and upregulation of alternative endocytic pathways induced by experimental modulation of intersectin-1s expression in mouse lung endothelium.</a> Biochem. Res. Int.. (2012), 672705 (2012).</li><li>Higuchi, Y., Kawakami, S., Hashida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+in+vivo+delivery+of+siRNAs:+recent+progress.">Strategies for in vivo delivery of siRNAs: recent progress.</a> BioDrugs. 24 (24), 195-205 (2010).</li><li>Caracciolo, G., Amenitsch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+liposome/DNA+complexes:+from+structure+to+interactions+with+cellular+membranes.">Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes.</a> Eur. Biophys. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+endothelial+cell+uptake+of+cationic+liposome-DNA+complexes+in+mice.">Organ-specific endothelial cell uptake of cationic liposome-DNA complexes in mice.</a> Am. J. Physiol. (273), H387-H404 (1997).</li><li>Soutschek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+silencing+of+an+endogenous+gene+by+systemic+administration+of+modified+siRNAs.">Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs.</a> Nature. (432), 173-178 (2004).</li><li>Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+enhance+bioremediation+of+oil-contaminated+soil.">Liposomes enhance bioremediation of oil-contaminated soil.</a> J. Liposome Res. (13), 1-8 (2003).</li><li>Zamboni, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal,+nanoparticle,+and+conjugated+formulations+of+anticancer+agents.">Liposomal, nanoparticle, and conjugated formulations of anticancer agents.</a> Clin. Cancer Res. (11), 8230-8234 (2005).</li><li>Newman, M. S., Colbern, G. T., Working, P. K., Engbers, C., Amantea, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pharmacokinetics,+tissue+distribution,+and+therapeutic+effectiveness+of+cisplatin+encapsulated+in+long-circulating,+pegylated+liposomes+(SPI-077)+in+tumor-bearing+mice.">Comparative pharmacokinetics, tissue distribution, and therapeutic effectiveness of cisplatin encapsulated in long-circulating, pegylated liposomes (SPI-077) in tumor-bearing mice.</a> Cancer Chemother Pharmacol. (43), 1-7 (1999).</li><li>Martino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+siRNA+delivery+by+the+cationic+liposome+DOTAP+in+human+hematopoietic+stem+cells+differentiating+into+dendritic+cells.">Efficient siRNA delivery by the cationic liposome DOTAP in human hematopoietic stem cells differentiating into dendritic cells.</a> J. Biomed. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dap160/intersectin+acts+as+a+stabilizing+scaffold+required+for+synaptic+development+and+vesicle+endocytosis.">Dap160/intersectin acts as a stabilizing scaffold required for synaptic development and vesicle endocytosis.</a> Neuron. (43), 193-205 (2004).</li><li>Miyawaki-Shimizu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lung Cell Mol. Physiol. (290), L405-L413 (2006).</li></ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

우리가 장기적으로 특정 siRNA의 / 리포좀 복합체의 반복 정맥 주사 (연속 24 일 동안 매일 72 시간)에 의해 생체 내에서 ITSN-1의 노크에 대해이 방법을 개발 한 사람 9 우리 1, 18에 의해 출판 이전의 연구에 기초를 두는. 이 실험 방법은 효율적이며 안전하고 반복적으로 사용할 수 있으며, 그것은 쉽게 폐 내피 세포 및 폐 항상성에 대한 관심의 단백질을 코딩하는 유전자의 참여?...

알몸의 siRNA는 세포막을 통과 할 수없는 부정 청구되고, 그것은 혈액에있는 효소, 조직, 세포로 쉽게 저하됩니다. 심지어 안정성을 향상시키기 위해 최근 구조 변경과 함께 투여 후 대상 사이트에서 siRNA의 축적은 매우 낮고 효율적으로 세포 내 자동차는 5 필요합니다. 양이온 성 리포좀 캡슐화 및 효소 분해 6에서 핵산을 보호하여 세포에 DNA / RNA의 큰 조각을 전송하는 잠재적 인 안전 핵산 항공사로 나타났다. 또한, 양이온 성 리포좀은 저절로 따라서 세포 2 유전자 전달을 촉진, DNA / RNA와 상호 작용합니다. 더 최근 리포솜 백신과 저 분자량 약 7을 제공하기 위해 적용되었습니다. 플라스미드 마이크로 RNA-7-표현의 리포좀 전달 폐암 세포 8 표피 성장 인자 수용체 티로신 키나제 억제제 저항을 극복한다. 을 대상으로 할 때단지는 내피 장벽을 통과하고 간질 9에 extravasate 할 가능성이 있기 때문에 혈관 내피 세포는 정맥 배달이 필수적이다. 다른 기관과 비교하여 폐의 미세 혈관에서 ECS 가장 큰 이해를 가지고 탐욕스럽게 림프절과 Peyer의 패치를 9 다음에 양이온 성 리포좀과 DNA / RNA 복합체를 내면화. 복고풍 궤도 또는 꼬리 정맥 주사를 통해 siRNA의의 설치류 모델에서 정맥 배송은 심지어 50 ㎎ / ㎏ 10 높은 농도에 무해 입증되었습니다. 게시 된 문헌에서 양이온 성 리포솜의 구성은 지질 정립과 같은 몰 비율이 11, 12에 따라 다릅니다. 백신이나 항 종양 치료 13-15의 전달 단백질의 down-regulation/over-expression을 대상으로하는지, 생체 내 유전자 전달을위한 양이온 리포좀을 사용하여 잠재적 인 응용 프로그램의 광범위한 배열이 있습니다. 기억하는 것이 중요합니다DNA / RNA-세포막 상호 작용의 효율성이 생성 단지와 막 지질 사이의 결합 형태에 의해 규제되는 것입니다. 이 대상 세포막의 프로필에 지질 성분을 맞게하는 특정 세포 유형 6 형질의 높은 속도에 유익하고 결과가 될 수 있다는 것을 제안합니다.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D2779</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LiposoFast stabilizer (mini-extruder)</td>
 <td>Avestin Inc.</td>
 <td>LF-STB</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore</td>
 <td>Avestin Inc.</td>
 <td>LFM-50</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cholesterol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C-8667</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloroform</td>
 <td>Mallinckrodt Chemicals</td>
 <td>4432-04</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hank's balanced salts</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H1387</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Round-bottom flask</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>FHB-275-030X</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse siRNAITSN - on target </td>
 <td>Dharmacon/ThermoScientific</td>
 <td>J-046912-11</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peristaltic pump</td>
 <td>Ismatec</td>
 <td>REGLO-CDF digital with RHOO pump head</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ventilator</td>
 <td>Hugo Sachs Electronik</td>
 <td>NA</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Barbital</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>B-0500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Uranyl acetate</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>22400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Epon812</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>Discontinued by the manufacturer</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Propylene oxide</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>20400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Embedding molds</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>69923-05</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tannic acid</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>21710</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>8 nm gold-albumin tracer</td>
 <td></td>
 <td>Prepared in the laboratory as in16</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Pyrex, 100 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Modified siRNA, in vivo</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Part of IDEX corp.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>D-79232 March, Germany</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Replaced with Embed812, cat. # 14120</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

long-term silencing of intersectin-1s in mouse lungs by repeated delivery of a specific sirna via cationic liposomes. evaluation of knockdown effects by electron microscopy

이전 연구는 ITSN - 초 (KD ITSN), 폐 혈관 투과성과 내피 세포 (내피) 생존에 의한 세포 사멸 세포 죽음, ITSN - 초 장기와 세포 배양 시스템 개발의 주요 장애물을 조절에 관여 endocytic 단백질의 최저를 보였다 억제 1. 사업자로서 양이온 성 리포좀을 사용하여, 우리는 ITSN-1 유전자 (의 siRNA ITSN) 대상의 siRNA의 전신 투여가 마우스 폐에 ITSN - 초 유전자의 침묵을 탐구. 2 생산, 반복 투여에 안전 nonimmunogenic, 비 독성, 쉬운 : 양이온 리포좀의 siRNA 전달을위한 몇 가지 장점을 제공합니다. 리포솜의 성능 및 생물 학적 활동은 콜레스테롤과 디메틸 dioctadecyl 암모늄 브로마이드 조합을 사용하여 크기, 전하, 지질 구성, 안정성, 용량 및 투여 3의 경로를 여기에, 효율적으로 획득 한 마우스의 폐에서 특정 KD ITSN에 따라 달라집니다. 정맥 배달의 siRNA ITSN의 / 양이온 성 리포좀과의 복합체는 일시적으로 추가 3 일 후에 회수 3 일에서 마우스 폐 ITSN - 초 단백질 발현을 무너 뜨렸다. 반복 안전한 항공사로서 양이온 성 리포좀의 활용, 연구는 24 일 연장했다. 따라서, 갓 생성 된 단지 레트로 궤도 치료 연구 4에 걸쳐 지속적인 KD ITSN을 유도마다 3 일 투여 하였다. 여러 시점 이후의 siRNA ITSN에서 수집 마우스 조직은 폐 내피에서, 만성 KD ITSN의 효과를 평가하기 위해 전자 현미경 (EM) 분석을 실시 하였다. 고해상도 EM 영상은 우리가 폐 혈관 침대에 KDITSN에 의한 형태 학적 변화를 평가 할 수 광학 현미경으로 특성을 비 감지 (내피 장벽 즉, 중단, caveolae의 수 및 대체 수송 경로의 upregulation를 감소). 전반적으로 이러한 연구 결과는 impor에 설립ECS의 기능과 폐 항상성 ITSN-1의 TANT 역할, 생체 내에서의 siRNA - 리포좀 전달의 효과를 설명하면서.

ITSN - 초 단백질과 mRNA의 수준은 서양 얼룩과 4에서와 같이 기존의 정량 PCR로의 siRNA ITSN 배달 후 몇 시간 지점에서 관찰되었다. siRNA를 ITSN 처리 쥐의 폐에있는 ITSN - 초 단백질과 mRNA의 수준 21 일 ITSN-1의 연속 최저 동안 컨트롤을 참조하여 약 75 % 감소했다. ITSN - 초없이, dynamin를-2, 세포막에서 caveolae의 박리 ITSN-1과 핵심 선수의 주요 상호 작용 파트너를 효율적으로 endocytic 사?...

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Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

생쥐의 양이온 liposomes/siRNA/ITSN-1s 단지 24 일 동안 72 시간마다 반복적으로 복고풍 궤도 주사 효율적으로 75 %에 ITSN - 초 발현 및 단백질 발현을 감소 마우스 폐 미세 혈관에 siRNA의 양면을 제공합니다. 이 기술은 동물 모델에서 높은 재현성, 부작용이없고 사망을 방지합니다.

양이온 성 리포좀을 통해 특정의 siRNA 반복 전달하여 마우스 폐 Intersectin-1의 장기 침묵. 전자 현미경에 의한 넉다운 효과의 평가

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.6K 조회수.  Rush University. 생쥐의 양이온 liposomes/siRNA/ITSN-1s 단지 24 일 동안 72 시간마다 반복적으로 복고풍 궤도 주사 효율적으로 75 %에 ITSN - 초 발현 및 단백질 발현을 감소 마우스 폐 미세 혈관에 siRNA의 양면을 제공합니다. 이 기술은 동물 모델에서 높은 재현성, 부작용이없고 사망을 방지합니다.

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Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

와이드 필드 현미경을 사용하여 장기 이미징 포유 동물 세포

연구

생물학

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is particularly suited for long-term time-lapse imaging over many hours up to several days. However, an appropriate sample mounting strategy is needed that offers both confinement and normal development of the sample. Multilayer mounting, a new embedding technique using low-concentration agarose in optically clear tubes, now overcomes this limitation and unleashes the full potential of light sheet microscopy for real-time developmental biology.

The development of zebrafish can be followed over days with light sheet microscopy when embryos are embedded in optically clear polymer tubes with low-concentration agarose.

다층 제브라 피쉬의 장기 라이트 시트 현미경에 장착

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

전자 곳을 알아내는-단층 촬영에 의한 미토콘드리아에서 ATP 합성 효소 이량 체의 시각화

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

마우스의 빠른 비 침습 요추 경 막내 주사를 통해 생체 siRNA의 형질과 척수에있는 유전자 넉다운에

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms or solutions. We make use of a custom built cryo-transfer station and a modified cryo-SEM preparation chamber2. The spores are taken from a culture, plunge-frozen in a liquid nitrogen slush and observed in the cryo-SEM to select a region of interest. A thin lamella is then extracted using the FIB, attached to a TEM grid and subsequently thinned to electron transparency. The grid is transferred to a cryo-TEM holder and into a TEM for high resolution studies. Thanks to the introduction of a cooled nanomanipulator tip and a cryo-transfer station, this protocol is a straightforward adaptation to cryogenic temperature of the routinely used FIB preparation of TEM samples. As such it has the advantages of requiring a small amount of modifications to existing instruments, setups and procedures; it is easy to implement; it has a broad range of applications, in principle the same as for cryo-TEM sample preparation. One limitation is that it requires skillful handling of the specimens at critical steps to avoid or minimize contaminations.

Cryo Electron Microscopes, either Scanning (SEM) or Transmission (TEM), are widely used for characterization of biological samples or other materials with a high water content1. A SEM/Focused Ion Beam (FIB) is used to identify features of interest in samples and extract a thin, electron-transparent lamella for transfer to a cryo-TEM.

집중 이온 빔의 극저온 전자 현미경 표본 준비하여 의미

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused throughout tissues made of diverse cell types, such as enteroendocrine cells of the intestinal epithelium. These gastrointestinal sensors of food and bacteria have been difficult to study because they are dispersed among other epithelial cells at a ratio of 1:1,000. Recently, transgenic reporter mice have been generated to identify enteroendocrine cells by means of fluorescence. One of those is the peptide YY-GFP mouse. Using this mouse, we developed a method to correlate confocal and serial block-face scanning electron microscopy. We named the method cocem3D and applied it to identify a specific enteroendocrine cell in tissue and unveil the cell&#8217;s ultrastructure in 3D. The resolution of cocem3D is sufficient to identify organelles as small as secretory vesicles and to distinguish cell membranes for volume rendering. Cocem3D can be easily adapted to study the 3D ultrastructure of other specific cell types in their native tissue.

Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.

특정 감각 세포의 상호 공 초점 및 3D 전자 현미경

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

대변​​ 글루코 코르티코이드 분석 : equids는 비 침습적 부신 모니터링

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

siRNA를 매개 음소거로 마우스 난 모세포의 감수 스핀들 평가

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

샘플 준비 및 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 Exosomes의 영상

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...