This research was supported in part by the University of Georgia, and a grant (HD071330) from the National Institutes of Health to MMV.

이 프로토콜은 조지아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 1. 준비 <ol><li> 갓 난자 문화, 구매 또는를 들어 최소 필수 중간 (MEM)를 준비하고 표 1에 설명 된대로 3 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민 (BSA)과 보완. (제로 용기)로드 밸런스에 폴리스티렌 병을 놓습니다. 위해, BSA를 제외한 모든 시약을 추가하고 250g의 총 중량 MQ-물에 최종 볼륨을 가지고. 그런 다음, BSA를 추가 용해 및 필터 소독 할 수 있습니다. 주 : 설명 MEM 배지, 5 % CO 2, 5 % O 2, N 2 90 %의 의료 ​​가스 혼합물로 평형화 세포 배양을 필요로한다. 그러나, 다른 미디어 (예 CZB)은 대기압 조건에서 5 % CO 2에서 세포 배양을 허용하는 사용될 수있다. </li><li> 난자의 미세 주입의 경우, 구매 또는 M2 매체를 준비합니다. </li><li> P 준비5 IU / 100 μL의 농도로 우세한 암말의 혈청 성선 자극 호르몬 (PMSG). </li><li> 구입 및 1 μM의 작업 농도의 siRNA 주식을 재구성. </li></ol> 2. 마우스 난자 컬렉션 <ol><li> 1 일 : 난소의 난포 발달을 자극하고 배란 전 난포의 수를 증가, 복강 난자 컬렉션에 48 시간 이전에 여성 생쥐에 PMSG 5 IU를 관리 할 수 있습니다. </li><li> 주 3 : 난자 수집 및 문화에 대한 1 μg의 / ㎖ 밀리 논 보충 MEM / BSA의 3 ㎖로 35mm 배양 접시를 설정합니다. 이 포스 포 디에스 억제제의 난자를 유지 의향 - 내가 체포 새싹 소포 고장 (GVBD)을 방지 할 수 있습니다. 적어도 15 분 동안 의료 가스 혼합물에서 배양 접시 평형. 참고 : 밀리 논 보충 미디어는 난자 수집뿐만 아니라 난자의 미세 주입하고 24 시간 배양 유지 기간 이후의 siRNA에 걸쳐 필요합니다. </li><li> (15)을 실천 설립 실험실을 사용하여 암컷 마우스에서 난소를 검색하고 미리 예열과 함께 새로운 배양 접시에 전송하고 MEM / BSA / 밀리 논을 평형. </li><li> 난자 수집을위한 실체 현미경의 무대에서 배양 접시를 놓습니다. 릴리스 운 - 난자 - 단지 (COC의) 수동으로 27 G 바늘 난포을 천공하여. 1 ML의 주사기에 부착 된 27 G 바늘, 배양 접시의 바닥에 하나의 난소를 수정하고, 모든 큰 모공에 구멍을하는 두 번째 바늘을 사용합니다. 각각의 난소에 대해 반복합니다. </li><li> 소형 적운 세포의 2 층 이상에 둘러싸여 모든 난자를 수집, 표준 입 피펫 절차 나 난자 흡인의 다른 수단을 사용하여. 새로운 요리에 COC의 이동과 1 시간 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> 조심스럽게 750 μL의 열망 볼륨 설정 1 ML의 피펫을 반복 부드러운 피펫 팅에 의해 주변 적운 세포를 제거합니다. 피펫 팅 단계를 약 12​​ 회 반복와 난자가 5 분 동안 복구 할 수 있습니다. 전부 또는 난구 세포의 대부분이 제거 될 때까지 이러한 방식으로 계속합니다. 다른 배양 접시에 무 결함 난자를 전송하고 15 분 동안 37 ℃에서 평형을 허용한다. </li><li> 를 고려하여 관심의 대상에 대해 특정 된 siRNA의 (ⅰ) 마이크로 인젝션, 불특정 (제어) 된 siRNA의 (ⅱ) 마이크로 인젝션, 및 (iii) 비 - 주입 된 대조군 : 세 개의 실험 그룹으로 무 결함 난자를 할당을 위해 사용될 배양 조건. </li></ol> 3. 난자 미세 주입 <ol><li> 난자에 미세 주입을위한 밀리 논 (1 μg의 / ml)로 보충 3 ㎖ M2 매체와 문화 요리를 설정합니다. 세척 및 주입 된 난자의 후속 문화 MEM / BSA / 밀리 논을 포함하는 배양 접시를 준비합니다. 주 : M2 배지 HEPES 완충액 함유하고 대기 조건 하에서 15 분 동안 37 ℃에서 미리 가온 요구한다. MEM은 설명 의료 가스를 사용하여 사전 온난화와 평형을 필요로위 거라고. </li><li> 미세 주사 시스템을 준비합니다. 1 μm의 특정 siRNA의 솔루션의 5 μL와 주사 바늘을로드합니다. 미세 주사 시스템의 미세 조작기에 유지 피펫과 주사 바늘을 고정 및 교정 볼륨과 압력으로 주입 장치를 설정합니다. </li><li> 3cm 배양 접시의 뚜껑의 안쪽 M2 매체의 200 μL 마이크로 - 드롭을 배치하고 설정 및 마이크로 인젝션 시스템의 정렬에 난자를 추가한다. </li><li> 참조 난자를 이용, 유지 및 주사 바늘의 위치를​​ 조정한다. 부드럽게 난자를 확보하고 셀의 넓은 직경에 주사 바늘의 위치를​​ 조정하는지지 피펫에 부압을 적용한다. 아무 곳이나 난자 세포질로의 siRNA 솔루션의 약 10 PL의 미세 주입 할 수 있도록 설정을 조정합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53586/53586fig1.jpg" /> 그림 1. 난자의 미세 주입을 설정합니다. ( <stroNG&gt; 각각 좌우에 위치하는 홀딩 피펫 및 주사 바늘 3cm 배양 접시에서 뚜껑에 배치 M2 매체의 200 μL 마이크로 드롭의) 대표 화상. (B) 그룹의 의향 - 나는 미세 주입하기 전에 난자 (GV-단계)를 체포했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53586/53586fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> </li><li> 실체 현미경 단계로 뚜껑을 돌려 신선한 M2 미디어의 200 μL 마이크로 드롭을 추가합니다. 입 피펫, 또는 다른 방법으로 마이크로 하락 난자의 그룹 (~ 10)를 추가 한 다음 미세 주입 단계에 마이크로 드롭으로 뚜껑을 돌려줍니다. <ol><li> 각각의 난자를 microinject로 이동합니다. 천천히 세포질 내로 주사 바늘의 선단을 삽입 한 채 피펫 난자 확보 및 siRNA를 용액의 주입량을 추방. 조심스럽게 주사 바늘과 미주리 철회미세 방울의 하단 위치까지 주입 된 난자를했습니다. 마이크로 드롭의 상단에 위치에 실패 주입 난자를 이동합니다. </li><li> 각각의 난자에 미세 주입의 절차를 반복합니다. 시간에 최적의 난자 생존, 난자 microinject 소수만을 유지한다. 이 과정은 마이크로 드롭 온도와 pH가 변화를 방지하기 위해 몇 분 이상하지 않도록하십시오. </li></ol></li><li> 대기음이 성공적으로 난자를 주입 또는주의 실체에 주입 된 난자의 마이크로 드롭 뚜껑을 이동합니다. 세척하고 37 ℃에서 평형 / BSA / 밀리 논 매체를 MEM하는, 입 피펫 또는 다른 방법에 의해 주입 가능한 난자를​​ 전송합니다. </li><li> 난자들의 또 다른 그룹을 사용하여, 대조군에 대한 비 특정 된 siRNA 로케이션 새로운 주사 바늘로 마이크로 인젝션 프로세스를 반복한다. 별도의 배양 접시에 MEM / BSA / 밀리 논 및 전송에 난자를 씻으십시오. </li><li> 문화 모든 그룹의료 가스의 분위기 하에서 37 ℃에서 MEM / BSA / 밀리 논에서 24 시간 동안 난자. 주 : &quot;밀리 논 블록 &#39;배양 기간이 효율적인 표적 mRNA의 / 단백질 고갈 필요하다. </li></ol> 감수 성숙 4. 난자 문화 <ol><li> 주 4 : 난자의 각 실험군의 경우 3 ㎖ MEM / BSA와 설정 (4) 배양 접시 (35mm). 난모 세포의 성숙에 사용하는 10 % (고화질) 소 태아 혈청 (FBS)과 그룹 당 하나의 미디어 접시 보완. 모든 문화 요리 의료 가스 혼합물을 37 ℃에서 평형을 허용합니다. </li><li> 순차적으로, &#39;밀리 논 블록&#39;에서 난자를 방출 MEM / BSA를 포함하는 요리 난자 세 번 세척 후 10 % FBS와 미디어를 포함하는 성숙 접시에 난자를 전송합니다. 문화 37 ° C에서 17 시간 동안 모든 난자 그룹은 재개과 감수 분열의 진행을 활성화합니다. </li><li> 하루 5 : 난자 fixa 준비 솔루션기, 포함 : (ⅰ) PEM 완충액에서 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) (100 밀리미터 PIPES [pH를 6.9, 1 mM의의 MgCl 2, 1mM의 EGTA), 0.5 % 트리톤 X 100, 및 (ii) PBS 5 보충과 씻고 난 모세포를 차단하는 데 사용할 % FBS. 참고 :이 솔루션은 이전에 난자 고정 37 ° C의 온난화가 미리 필요합니다. </li><li> (17 시간 배양 후) 난자 고정의 경우, 신속하게 750 ㎕를 포함하는 입 피펫 또는 (4 잘 접시의) 개별 우물에 다른 방법으로 난자의 각 실험군을 전송할 4 % PFA 솔루션을 미리 예열 37 부화 1 시간 동안 C를 °. 그 후 5 % FBS를 포함하는 미리 예열 PBS 750 μL에 3 회 (15 분마다)을 난자의 각 그룹을 씻는다. </li><li> 4 ° C에서 200 μL PBS / 5 % FBS O / N에서 블록 난자가 결합 불특정 항체를 최소화합니다. </li></ol> 5. 면역 형광 분석 <ol><li> 6 일 : 주 : 면역 염색은 멀티 웰 플레이트에서 수행된다 OOCytes 직렬 각각의 항체 및 세척 솔루션을 포함, 연속 우물로 전송됩니다. 어느 48 또는 96 웰 플레이트를 사용할 수 있고, 단순히 잘 크기에 따라 용액의 양을 조정한다. 96 웰 플레이트에 잘 당 200 μL를 사용합니다. - 3 웰 워시 - 이차 항체 용액 - 3 워시 웰 차 항체 용액 : 난자는 다음과 같은 순서로 다른 솔루션에 전송된다. 판 호일로 커버 할 수 빛 노출을 제한합니다. 신선한 PBS / 5 % FBS를 준비하고 항체 희석을 준비하기 위해이 솔루션을 사용 (예를 들어, 토끼 반 pericentrin (1 / 1,000), 마우스 항 - 튜 불린 (1 / 1,000)). </li><li> 차 항체 용액 (부피가 덜 요구된다면, 100 μL) 200 μl를 각각의 웰에 포함 된 각 실험군의 고정 된 난 모세포를 옮기고 잘 파라 필름으로 커버. 최적의 항체 특정 조건에 따라 품어 (예를 들어, 1 시간 또는 4 ° CO / N 37 ° C를). 참고 : 1 차 항체 dilutio을N뿐만 아니라 특정 배양 시간과 온도는 사용 된 다른 항체에 대한 최적의 조건을 결정하기 위해 테스트를 필요로한다. </li><li> 차 항체와 부화 후, PBS / 5 % FBS (10 ~ 15 분마다)에 난자를 세 번 씻는다. </li><li> 형광 접합 된 이차 항체를 포함하는 용액에 난자를 전송 (예를 들어, 서로 다른 파장의 형광 색소와 접합 된 항 - 토끼 항 마우스 항체의 1 / 1000 희석). 37 ℃에서 1 시간 동안 품어. </li><li> (- 15 분 각 10) PBS / 5 % FBS에서 난자 세 번 씻으십시오. </li><li> 최종 세척 단계 후, 깨끗한 유리 슬라이드에 난자를 전송하고 부드럽게 초과 세척 솔루션을 대기음. 이것은 유리 표면에 난자를 고정한다. 미디어 (DAPI를 포함)를 장착 8 μl를 추가 조심스럽게 22mm X 22mm 커버 슬립에 장착 매체를 오버레이. 난자를 공기 방울을 트래핑 및 / 또는 손상을 방지하기 위해 천천히 커버 슬립을 낮 춥니 다. 참고 : 또는, 공 초점 현미경 분석 난자의 3 dimentional 속성을 유지 종래 슬라이드 마운팅로 커버 슬립의 모서리에 100 μm의 유리 비드 (바셀린 혼합)의 작은 부피를 추가. </li><li> 4 ℃에서 보관 슬라이드 또는 감수 진행의 평가뿐만 아니라 사용 된 이차 항체에 맞게 필요한 필터가 장착 된 형광 현미경을 이용하여 발현 수준과 세포 내 단백질 위치 파악의 분석을 진행. </li></ol>

<ol>
	<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aneuploidy:+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem.">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).</li><li>Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+Centrioles+in+the+First+and+Second+Meiotic+Spindles+of+Mouse+Oocytes.">Absence of Centrioles in the First and Second Meiotic Spindles of Mouse Oocytes.</a> J Cell Sci. 11 (2), 521-541 (1972).</li><li>Manandhar, G., Schatten, H., Sutovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+Reduction+During+Gametogenesis+and+Its+Significance.">Centrosome Reduction During Gametogenesis and Its Significance.</a> Biol Reprod. 72 (1), 2-13 (2005).</li><li>Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis-specific+anchoring+of+gamma+tubulin+complexes+by+pericentrin+controls+spindle+organization+and+mitotic+entry.">Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry.</a> Mol Biol Cell. 15 (8), 3642-3647 (2004).</li><li>Ma, W., Baumann, C., Viveiros, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NEDD1+is+crucial+for+meiotic+spindle+stabilty+and+accurate+chromosome+segregation+in+mammalian+oocytes.">NEDD1 is crucial for meiotic spindle stabilty and accurate chromosome segregation in mammalian oocytes.</a> Dev Biol. 339 (439-450), (2010).</li><li>Ma, W., Viveiros, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+pericentrin+in+mouse+oocytes+disrupts+microtubule+organizing+center+function+and+meiotic+spindle+organization.">Depletion of pericentrin in mouse oocytes disrupts microtubule organizing center function and meiotic spindle organization.</a> Mol Reprod Dev. 81 (11), 1019-1029 (2014).</li><li>Bouniol-Baly, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Transcriptional+Activity+Associated+with+Chromatin+Configuration+in+Fully+Grown+Mouse+Germinal+Vesicle+Oocytes.">Differential Transcriptional Activity Associated with Chromatin Configuration in Fully Grown Mouse Germinal Vesicle Oocytes.</a> Biol Reprod. 60 (3), 580-587 (1999).</li><li>De La Fuente, R., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Activity+of+the+Mouse+Oocyte+Genome:+Companion+Granulosa+Cells+Modulate+Transcription+and+Chromatin+Remodeling.">Transcriptional Activity of the Mouse Oocyte Genome: Companion Granulosa Cells Modulate Transcription and Chromatin Remodeling.</a> Dev Biol. 229 (1), 224-236 (2001).</li><li>Hodgman, R., Tay, J., Mendez, R., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CPEB+phosphorylation+and+cytoplasmic+polyadenylation+are+catalyzed+by+the+kinase+IAK1/Eg2+in+maturing+mouse+oocytes.">CPEB phosphorylation and cytoplasmic polyadenylation are catalyzed by the kinase IAK1/Eg2 in maturing mouse oocytes.</a> Development. 128 (14), 2815-2822 (2001).</li><li>De La Fuente, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+in+the+germinal+vesicle+(GV)+of+mammalian+oocytes.">Chromatin modifications in the germinal vesicle (GV) of mammalian oocytes.</a> Dev Biol. 292 (1), 1-12 (2006).</li><li>Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interference+with+gene+function+by+double-stranded+RNA+in+early+mouse+development.">Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development.</a> Nat Cell Biol. , 270-275 (2000).</li><li>Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+reduction+of+dormant+maternal+mRNAs+in+mouse+oocytes+by+RNA+interference.">Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference.</a> Development. 127 (19), 4147-4156 (2000).</li><li>Svoboda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renaissance+of+mammalian+endogenous+RNAi.">Renaissance of mammalian endogenous RNAi.</a> FEBS Letters. 588 (15), 2550-2556 (1016).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

이러한 전기 천공과 같은 형질 체세포로 외인성 핵산 전달을위한 여러 가지 방법이 있지만, 마이크로 인젝션은 전사적으로 정지 된 난 모세포에 마우스 RNA 분자의 전달을위한 최적의 방법이다. 현재의 프로토콜은 서로 다른 스핀들 및 / 또는 난자에 MTOC 관련 요인의 기능 테스트를 가능하게 특정의 mRNA의 체외 고갈에 대한 효과적인 접근 방법을 제공합니다. 이러한 접근 방식은 효율적인 성...

감수 분열은 생식 세포 (난자와 정자)에서 발생하고 감수 분열-I 및 감수 분열-II, 각각 1시 상동 염색체와 자매 염색 분체를 분리하는 DNA 합성을 개입하지 않고 두 개의 연속 부문을 포함하는 고유의 분할 과정이다. 난자의 감수 분열시 염색체 분리의 오류 수정시 배아 상속 이수성,이 발생할 수 있습니다. 특히, 개발 배아의 염색체의 발생률은 산모의 나이 발전과 함께 증가하고 여성 1,2 임신 손실뿐만 아니라 선천성 기형아 출산의 주요 원인이며, 따라서, 감수 분열시 염색체의 분자 기초를 이해하는 중요한 필요성을 강조 . 세포 분열시 염색체 분리 반대 스핀들에 올바른 부착에 대한 미세 소관 스핀들 장치 및 안정적인 염색체 미세 소관의 상호 작용의 설립의 조립에 결정적으로 의존극. 중요한 것은, 포유 동물 난자의 감수 스핀들 형성은 체세포에서 유사 분열과 다른, 독특한 미세 소관 조직 센터 중심 소체 3,4 부족 (MTOCs)에 의해 조절된다. 미세 소관의 핵 및 조직에 필요한 필수 단백질은 미세 소관의 조립을 촉매 γ-tubulin에 포함 난자 MTOCs에 지역화. 또한,도 5에 결합 MTOCs 필수적인 비계 단백질로서 기능하고 앵커 γ-tubulin에뿐만 아니라 다른 요인 pericentrin. 특히, 우리의 연구는 키 MTOC 관련 단백질의 고갈이 감수 스핀들 조직을 방해 완전히 스핀들 조립 검사 점 (SAC) 6,7에 의해 해결되지 않은 난자의 염색체 분리의 오류에 이르게 것을 보여줍니다. 따라서, 감수 체포를 유발하지 않는 스핀들 안정성 결함은 염색체 이수성에 기여에 상당한 위험을 초래할. 스핀들 조립 및 조직, 난자 MTOC의 제자에서의 중요한 역할에도 불구하고EIN 구성과 기능을 제대로 이해 남아 있습니다. 곧 세포의 감수 분열 8,9 재개하기 전에 정지 될 전사적으로 포유류 난자 특정 표적 단백질의 기능을 시험하는 것은 도전적이다. 따라서, 사전 배란 된 난자는 감수 분열을 재개 모성 mRNA의 저장에 의존 감수 분열뿐만 아니라, 시비 10, 11 후 첫 번째 분열 부문을 지원합니다. 포유류의 난자에서 mRNA의 성적 증명서의 RNA 간섭 (RNAi의) 중재 저하의 효능은 잘 확립되어 감수 성숙하는 동안 번역 모집 산모의 RNA는 siRNA를가 12-14을 목표로, 특히 의무가 있습니다. 따라서, 난 모세포에 짧은 간섭 RNA를의 미세 주입 (siRNA를)은 기능 테스트를위한 대상의 mRNA를 고갈 가치있는 접근 방법을 제공합니다. 여기, 우리는 마우스 난자 특정 transcri의 siRNA를 매개 고갈의 분리를위한 방법을 설명PTS는 pericentrin, 필수 MTOC 관련 단백질의 기능을 테스트합니다. 또, 난자의 감수 스핀들 형성을 평가하기 위해 면역 분석 조건을 설명한다.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant Mare&#39;s Serum Gonadotropin (PMSG)</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>367222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal Essential Medium (MEM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>*Recipe outlined in Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Earle&#39;s Balanced Salt Solution (10x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-7510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid, sodium salt&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G, potassium salt&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-7794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin Sulfate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, disodium salt dihydrate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential Amino Acids (50x)</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>11130-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamin Mixture (100x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-6895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milrinone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmbryoMax M2 Media with Hepes</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>MR-015-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNAs targeting Pericentrin</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>GS18541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative control siRNAs&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>SI03650318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16% solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Pericentrin (rabbit)</td>
			<td>Covance</td>
			<td>PRB-432C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetylated a-tubulin (mouse)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-6793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti -mouse Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Major Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope (SMZ 800)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Fluorescent Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet Micro-injections System</td>
			<td>Eppenforf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro manipulators</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-injection needles (femtotips)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930000035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding pipettes (VacuTip)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm culture dishes</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 mm CA Filter System</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>430768</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

meiotic spindle assessment in mouse oocytes by sirna-mediated silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

된 siRNA의 미세 주입은 시험관 내에서 상이한 타겟 요인 효율적이고 고도로 특정 기능을 테스트 할 수 난자의 mRNA의 분해 및 후속 단백질 고갈을위한 효과적인 방법을 제공한다. 이어서, 특정 면역 표현형 분석에 사용 된 siRNA뿐만 아니라 주입 난 모세포에 단백질 고갈을 검증. 현재 예에서, 안티 - 튜 불린 및 안티 pericentrin 항체와 함께 DAPI 개별 난자의 형광 표지를 사용할 수 :뿐만 아니라 per...

Watch this Scientific Journal Video about Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing at JoVE.com

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

여기서는 마우스 난자 감수 스핀들 어셈블리 및 조직을 평가하기 위해 면역 분석 하였다 특정 된 siRNA 매개 mRNA의 파괴를위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 성적 증명서의 체외 고갈과 다른 스핀들 및 / 또는 난자에 MTOC 관련 요인의 기능 평가에 적합합니다.

siRNA를 매개 음소거로 마우스 난 모세포의 감수 스핀들 평가

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

meiotic-spindle-assessment-mouse-oocytes-sirna-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K 조회수.  College of Veterinary Medicine, University of Georgia.  여기서는 마우스 난자 감수 스핀들 어셈블리 및 조직을 평가하기 위해 면역 분석 하였다 특정 된 siRNA 매개 mRNA의 파괴를위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 성적 증명서의 체외 고갈과 다른 스핀들 및 / 또는 난자에 MTOC 관련 요인의 기능 평가에 적합합니다. 

비디오: Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying development, differentiation and aging are epigenetic rather than genetic processes. The reversibility of these processes opens exciting perspectives in basic research, and in the more distant future, in regenerative medicine. In the mouse, embryonic stem cells can be derived from cloned preimplantation stage embryos. Such embryonic stem cells have the ability to give rise to all cell types of the adult organism. Importantly, these cells are genetically identical to the donor. If applicable to human, this would allow the derivation of stem cells from a patient. These cells could then be differentiated into the affected cell type of the patient and studied in vitro, or used to replace the damaged or missing cells. The study of nuclear transfer in the mouse remains important as it can inform us about the principles of nuclear reprogramming. This movie and the accompanying protocol are intended to help learning nuclear transfer in the mouse, a method initially developed in the group of Prof. Yanagimachi (WAKAYAMA et al. 1998).

This movie and the protocol are intended to help learning nuclear transfer.

마우스 Oocytes에 핵 전송

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

연구

생물학

Retrieval of Mouse Oocytes

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus Genetic Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu), we are characterizing the salient differences needed to develop this system.  A primary goal has been to optimize oocyte/early embryo retrieval.

This protocol illustrates the technique for extracting oocytes or early-stage fertilized embryos from the oviduct of mice. The ability to identify the infindibulum and insert a blunt end needle into it is essential to correctly performing the procedure.

마우스 Oocytes의 검색

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus ...

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse embryos could be frozen and stored at -196 &deg;C and, a few years later, Parkening et al. 3 reported the birth of live offspring resulting from in vitro fertilization (IVF) of cryopreserved oocytes. Since then, the use of cryopreservation techniques has rapidly spread to become an essential component in the practice of human and animal assisted reproduction and in the conservation of animal genetic resources. Currently, there are two main methods used to cryopreserve oocytes and embryos: slow freezing and vitrification. A wide variety of approaches have been used to try to improve both techniques and millions of animals and thousands of children have been born from cryopreserved embryos. However, important shortcomings associated to cryopreservation still have to be overcome, since ice-crystal formation, solution effects and osmotic shock seem to cause several cryoinjuries in post-thawed oocytes and embryos. Slow freezing with programmable freezers has the advantage of using low concentrations of cryoprotectants, which are usually associated with chemical toxicity and osmotic shock, but their ability to avoid ice-crystal formation at low concentrations is limited. Slow freezing also induces supercooling effects that must be avoided using manual or automatic seeding 4. In the vitrification process, high concentrations of cryoprotectants inhibit the formation of ice-crystals and lead to the formation of a glasslike vitrified state in which water is solidified, but not expanded. However, due to the toxicity of cyroprotectants at the concentrations used, oocytes/embryos can only be exposed to the cryoprotectant solution for a very short period of time and in a minimum volume solution, before submerging the samples directly in liquid nitrogen 5. In the last decade, vitrification has become more popular because it is a very quick method in which no expensive equipment (programmable freezer) is required. However, slow freezing continues to be the most widely used method for oocyte/embryo cryopreservation. In this video-article we show, step-by-step, how to collect and slowly freeze hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

In this video-article we present a step-by-step demonstration on how to collect and cryopreserve hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

수집 및 햄스터 Oocytes 및 마우스 태아의 Cryopreservation

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

생체내 이미징 및 난소암의 Orthotopic 마우스 모델에서 치료 트리 트먼트

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

이온 채널 유학을위한 패치 클램프 및 재관류 기법으로 표현 Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

마우스 Meiotic 셀 유동세포계측법의 정제

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 complex in the ER membrane provides an aqueous path for newly-synthesized polypeptides into the lumen of the ER. Recent work from various laboratories suggested that this heterotrimeric complex may also form transient Ca2+ leak channels2-8. The key observation for this notion was that release of nascent polypeptides from the ribosome and Sec61 complex by puromycin leads to transient release of Ca2+ from the ER. Furthermore, it had been observed in vitro that the ER luminal protein BiP is involved in preventing ion permeability at the level of the Sec61 complex9,10. We have established an experimental system that allows us to directly address the role of the Sec61 complex as potential Ca2+ leak channel and to characterize its putative regulatory mechanisms11-13. This system combines siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging13. Cells are treated with siRNAs that are directed against the coding and untranslated region (UTR), respectively, of the SEC61A1 gene or a negative control siRNA. In complementation analysis, the cells are co-transfected with an IRES-GFP vector that allows the siRNA-resistant expression of the wildtype SEC61A1 gene. Then the cells are loaded with the ratiometric Ca2+-indicator FURA-2 to monitor simultaneously changes in the cytosolic Ca2+ concentration in a number of cells via a fluorescence microscope. The continuous measurement of cytosolic Ca2+ also allows the evaluation of the impact of various agents, such as puromycin, small molecule inhibitors, and thapsigargin on Ca2+ leakage. This experimental system gives us the unique opportunities to i) evaluate the contribution of different ER membrane proteins to passive Ca2+ efflux from the ER in various cell types, ii) characterize the proteins and mechanisms that limit this passive Ca2+ efflux, and iii) study the effects of disease linked mutations in the relevant components.

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

The endoplasmic reticulum plays a key role in protein biogenesis and in calcium homeostasis. We have established an experimental system that allows us to address the role of Ca2+ leak channels and to characterize their putative regulatory mechanisms. This system involves siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging.

siRNA의 중재 진 입을와 결합 라이브 세포 칼슘 영상은 CA를 나타냅니다 2 + ER 막의 누출 채널과 규제 메커니즘

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

커튼에서 Agrobacterium - 중재 바이러스 유발 유전자 입을 분석

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Previous studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells (ECs) survival, induced apoptotic cell death, a major obstacle in developing a cell culture system with prolonged ITSN-1s inhibition1. Using cationic liposomes as carriers, we explored the silencing of ITSN-1s gene in mouse lungs by systemic administration of siRNA targeting ITSN-1 gene (siRNAITSN). Cationic liposomes offer several advantages for siRNA delivery: safe with repeated dosing, nonimmunogenic, nontoxic, and easy to produce2. Liposomes performance and biological activity depend on their size, charge, lipid composition, stability, dose and route of administration3Here, efficient and specific KDITSN in mouse lungs has been obtained using a cholesterol and dimethyl dioctadecyl ammonium bromide combination. Intravenous delivery of siRNAITSN/cationic liposome complexes transiently knocked down ITSN-1s protein and mRNA in mouse lungs at day 3, which recovered after additional 3 days. Taking advantage of the cationic liposomes as a repeatable safe carrier, the study extended for 24 days. Thus, retro-orbital treatment with freshly generated complexes was administered every 3rd day, inducing sustained KDITSN throughout the study4. Mouse tissues collected at several time points post-siRNAITSN were subjected to electron microscopy (EM) analyses to evaluate the effects of chronic KDITSN, in lung endothelium. High-resolution EM imaging allowed us to evaluate the morphological changes caused by KDITSN in the lung vascular bed (i.e. disruption of the endothelial barrier, decreased number of caveolae and upregulation of alternative transport pathways), characteristics non-detectable by light microscopy. Overall these findings established an important role of ITSN-1s in the ECs function and lung homeostasis, while illustrating the effectiveness of siRNA-liposomes delivery in vivo.

Repeated retro-orbital injections of cationic liposomes/siRNA/ITSN-1s complexes in mice, every 72 hours for 24 days, efficiently deliver the siRNA duplex to the mouse lung microvasculature reducing ITSN-1s mRNA and protein expression by 75%. This technique is highly reproducible in an animal model, has no adverse effects and avoids fatalities.

양이온 성 리포좀을 통해 특정의 siRNA 반복 전달하여 마우스 폐 Intersectin-1의 장기 침묵. 전자 현미경에 의한 넉다운 효과의 평가

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...