웨슬리 왕 박사에게 이 프로토콜과 그의 소중한 멘토링에 대한 기초를 마련해 주신 것에 감사드립니다. 이 작품은 부분적으로 건강의 국가 학회에 의해 지원되었다 (보조금 R01GM127575 및 R01GM121584) 및 웰치 재단 (그랜트 A-1715).

1. 플라스미드 건설
<ol><li>어떤 히스톤 단백질이 아세틸화되고 어떤 리신 부위를 결정할지 결정하십시오. 사이트 지시 돌연변이 발생을 사용하여 황색 정지 코돈 (TAG)에 사이트를 돌연변이. 참고: 히스톤 단백질의 발현에 활용된 4개의 이전에 디자인된 플라스미드가 있습니다. 4개의 히스톤 단백질은 모두 N-단말 히스티딘 태그로 pETDuet-1 벡터로 복제하였다. Histone H4에는 또한 SUMO 태그, 약 40의 카피 번호가 있는 복제 colE1의 기원, 암피실린 내성 및 T7 프로모터가 포함되어 있습니다.<ol>
<li>4개의 히스톤 단백질 플라스미드 중 하나에서 원하는 부위(기존 리신 코동을 호박스톱 코돈으로 교체)에서 TAG 돌연변이를 포함하는 전방 및 역프라이머를 설계한다.</li>
		<li>플라스미드가 포함된 태그를 증폭시키기 위해 전체 플라스미드 PCR을 사용합니다. 프라이머에 적합한 어닐링 온도를 결정합니다. 일반적으로, 프라이머의 용융온도(Tm)는5°C를 뺀 값으로 충분할 것이다. 어려움이 PCR 생성물을 얻는 데 어려움이 있는 경우, Tm-5°C 주위의 온도 그라데이션을 사용하여 증폭을 위한 어닐링 온도를 최적화할 수 있습니다. 참고:본 실험에서 사내 발현PFU 폴리머라제는 30초(데니션레이션), 30초동안 의 온도 34°C, 6분 동안 72°C(또는 킬로베이스 쌍당 1분)를 사용하여 30사이클에 사용되었다. PCR 방법의이 유형에 대한 자세한 내용은 리우와 나이 스미스7을참조하십시오.</li>
		<li>제조업체의 프로토콜을 따라 PCR 정리 키트로 PCR 제품을 정리합니다. 아가로즈 젤 전기포진및 후속 에디튬 브로마이드 염색에 의해 PCR 제품을 분석한다.</li>
		<li>16°C에서 하룻밤 사이에 T4 리게아제로 배양하여 플라스미드를 리게이트합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>먼저 플라스미드(AmpR)를함유한 태그를 화학적으로 유능한 대장균으로 변환한다. 변환에서 최소 4 개의 식민지를 선택하고 플라스미드를 정화합니다. 표준 방법을 사용하여 글리세롤을 사용하여 각각의 세포 주식을 만들고 -80 °C에 보관하십시오. 원하는 TAG 돌연변이를 확인하기 위해 시퀀싱을 위해 보냅니다.</li>
	<li>시퀀스가 확인되면, PEVOL-AckRS(ChlR)를사용하여 태그 함유 플라스미드(AmpR)를화학적으로 유능한 CobB로 공동 변환합니다(대장균에 알려진 유일한 히스톤 리신 deacetylase)을 열 쇼크 방법을 사용하여 BL21 세포를 삭제한다. pEVOL은 낮은 복사 번호 p15A 원점으로 중간 복사 번호가 있는 플라스미드입니다. 참고: 플라스미드의 pEVOL 시리즈는 정형간 aaRS/tRNA티르 쌍의 증가발현을 보여 준 이전 연구를 기반으로 생성되었으며 단백질 잘림을 감소시키고 돌연변이단백질8의 전반적인 수율을 증가시키는 데 효과적이었다. CobB 삭제 세포가 접근할 수 없는 경우 화학적으로 유능한 BL21 세포를 진행하십시오. CobB는 시르투인과 같은 히스톤 리신 데아실라제와 니코티닌아미드를 5mM 최종 농도로 첨가하여 CobB를 대체접근법9로억제할 수 있다.</li>
	<li>셀 스톡을 만들고 -80 °C에 보관하십시오.</li>
</ol>2. 아세틸화 히스톤 단백질 발현
<ol><li>문화 플라스크에서 오토클레이브 2YT 미디어(또는 선택량)의 L 1L을 준비합니다.</li>
	<li>태그 함유 플라스미드(AmpR)및 pEVOL-AckRS(ChlR)를가지는 공동 변형된 세포 육수와 적절한 항생제를 함유하고 있으며, 37°C에서 OD=0.6(4-6h)으로 성장시키는 2YT 매체의 20mL을 접종한다.</li>
	<li>20mL 스타터 배양으로 1L의 오토클레이브 2YT 배지에 적절한 항생제를 추가하고 접종한다. 37°C에서 OD = 0.6-0.8(2-3h)으로 성장한다.</li>
	<li>IPTG 1 mM, 0.2% 아라비노스 및 AcK 5 mMM의 최종 농도에 유도 제및 아세틸리신(AcK)을 첨가합니다.</li>
	<li>6-8 h에 대한 37 °C에서 배양 성장.</li>
	<li>펠릿 셀은 15 분 동안 2,700 x g에서. </li>
	<li>셀 펠릿을 하룻밤 -80°C에 보관합니다.</li>
	<li>이 단계에서부터 는 항상 얼음에 샘플을 유지합니다. 세포의 1L당 히스톤 용해 버퍼의 50mL에 셀 펠릿을 용해시키십시오.</li>
	<li>다음 주기에 따라 초음파 처리: 1 에, 1 s off, 정시에 총: 3 분 에 60% 진폭.</li>
	<li>펠릿 포함 바디 41,600 x g 45 분 동안.</li>
	<li>상체를 버리고 포함 바디를 히스톤 리시스 버퍼의 30mL로 재일시 중단합니다. 펠릿 포함 몸통은 41,600 x g에서 30 분 동안.</li>
	<li>상체를 버리고 펠릿 세척 버퍼의 30 mL에 포함 시체를 다시 중단합니다. 펠릿 포함 바디는 41,600 x g에서 30 분 동안.</li>
	<li>6M 구아니딘 염산염(GuHCl) 버퍼의 25mL에 초상체를 폐기하고 포함 체체를 용해한다. 1 h에 대 한 37°C에서 교반으로 배양. 참고: 필요한 경우 포함 바디는 4°C에서 하룻밤 사이에 교반으로 배양될 수 있습니다.</li>
	<li>펠릿 포함 몸통 41,600 x g 45 분. 2h에 대한 6 M GuHCl 버퍼와 함께 평형 Ni-NTA 수지의 1 mL와 상류층을 배양.</li>
	<li>변성 조건하에서 Ni-NTA 정화를 진행합니다. 열 세척 버퍼의 3 열 볼륨으로 열을 세척합니다. 엘루테 아세틸리히스톤 단백질10mL용출버퍼. 참고 : 여기에 단백질을 집중하려고 시도하는 것은 옵션이지만 아세틸화 된 히스톤은 매우 예측할 수 없으며 쉽게 침전 할 수 있습니다. 총 부피 2mL를 지나서 집중하지 않는 것이 좋습니다.</li>
	<li>염을 제거하기 위해 5 % 아세트산 버퍼에 대한 아세틸화 히스톤 단백질을 광범위하게 투석합니다. 4°C에서 한 번에 3시간 동안 투석하여 최소 6회 신선한 버퍼로 교환합니다. 참고: 단백질 순도향상을 위해 순수한 물과 투석을 할 수 있는 옵션이 있습니다. 그러나, 이것은 낮은 항복 아세틸화 히스톤 단백질에 대 한 바람직하지 않을 수 있습니다 수율에 상당한 강수량 및 감소를 일으키는 원인이.</li>
	<li>알리쿼트와 리오필화 단백질을 - 80°C에서 무기한 보관하십시오. 야생 형 히스톤 단백질은 일반적으로 10-50 mg /L을 산출하는 반면 아세틸화 히스톤 단백질은 특정 lysine 부위에 따라 10 mg / L 미만을 산출합니다. 예를 들어, H3K79Ac 평균 5 mg/L.</li>
</ol>3. 와일드 타입 히스톤 단백질 발현
<ol><li>전체 뉴클레오좀을 조립하려면 4개의 히스톤 단백질을 모두 표현하십시오. 야생 형 히스톤을 표현하고 정화 할 때 프로토콜은 다음을 제외하고 아세틸화 된 히스톤과 동일합니다.<ol>
<li>공동 변환을 수행하지 마십시오. 야생 형 히스톤 표현에 pEVOL-AcKRS를 사용하지 마십시오. 그에 따라 항생제를 조정합니다.</li>
		<li>세포 발현을 유도하는 동안 CobB 삭제 세포주를 사용하거나 니코티나미드, AcK 또는 아라비노스를 추가하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 601 DNA 준비
참고: 이전에 설계된 최적화된 DNA 서열이 핵분포지셔닝을 지시하여 히스톤 옥타머로 조립되어 고효율의 단핵구를 생성합니다. 이 서열은 601 DNA 또는 Widom 서열이라고 합니다. 이 서열은 크로마티닌 리모델링 소세포에서 단일 분자측정(10)에이르는 뉴클레오좀의 체외 연구를 위한 표준 DNA 서열이 되었다.
<ol><li>뉴클레오소성 어셈블리를 위한 601 DNA의 상당량을 준비하려면 pGEM-3z/601을 상위 10개 세포로 변환하고 플라스미드 증폭 및 추출을 위한 10mL의 배양을 성장시킨다. 플라스미드 추출 키트를 사용하고 제조업체의 권장 사항을 따르십시오.</li>
	<li>이 증폭 프로토콜에 대해 사내 발현 PFU 폴리머라제(보다 효율적)를 사용하십시오. PCR 반응 설정: 250 μL 반응의 경우 207.5 μL 오토클레이브 MQ H2O, 25 μL 10x PFU 버퍼, 5 μL 포워드 프라이머: ctggagaatcccggtgccg, 5 μL 역 프라이머: 아카게타타트타트ctgacacg, 5μL dNTP 믹스, 2.5 μL PFU를 사용하십시오. 우리는 일반적으로 조립하기에 충분한 DNA를 얻기 위하여 한 번에 60의 반응을 실행합니다.</li>
	<li>PFU 폴리머라아제사용시 30s의 연장 시간 동안 52°C의 어닐링 온도를 사용하고 30s의 연장 시간을 사용한다. 그렇지 않으면 제조업체권장 조건을 따릅니다.</li>
	<li>PCR이 완료되면 PCR 제품을 정화하기 위해 선택한 PCR 정리 키트를 사용합니다.</li>
</ol>5. 히스톤 옥타머 의 조립
<ol><li>히스톤 단백질 펠릿 H2A, H2B, H3 및 H4의 알리쿼트를 용해하여 GuHCl 버퍼에 각 히스톤 단백질의 별도의 재고가 100 μL의 총 부피를 가지게 된다.</li>
	<li>A280 흡광도를 측정하여 각 히스톤 단백질의 농도를 계산합니다.</li>
	<li>흡수율이 단백질에 대해 1보다 크면 GuHCl 버퍼로 희석하여 보다 정확한 농도를 얻습니다.</li>
	<li>H2A와 H2B 단백질을 1:1 어어 비율로 결합하고 총 단백질 농도4 μg/μL로 희석합니다.</li>
	<li>하룻밤 동안 2M TE 버퍼에 대해 4 °C에서 순차적으로 투석하고, 2 h용 1 M TE 버퍼, 5 h용 0.5 M TE 버퍼. 참고: 투석의 두 번째 및 세 번째 단계는 단백질의 불안정한 적합성을 유발하여 밖으로 침전시합니다. 이 단계에서 무거운 강수량을 볼 것으로 예상된다.</li>
	<li>4°C에서 16,800 x g에서 원심분리로 침전을 제거합니다.</li>
	<li>다시, A280 흡광도를 측정하는 히스톤 디머(H2A/H2B 혼합물) 및 테트라머(H3/H4 혼합물)의 농도를 계산한다.</li>
	<li>1:1 어어 비율로 디머와 테트라머를 혼합하고 솔리드 NaCl을 추가하여 NaCl에서 2M로 조정합니다.</li>
	<li>히스톤 옥타머는 4°C에서 보관할 수 있으며 디머와 테트라머보다 더 안정적입니다. 이 분해를 일으킬 수 있으므로 히스톤 옥타머를 동결하지 마십시오.</li>
	<li>아세틸화 히스톤으로 조립하는 경우 야생 단백질을 절차에서 아세틸화 단백질로 교체하기만 하면 됩니다.</li>
</ol>6. 뉴클레오소이스 어셈블리
<ol><li>100x TE 버퍼와 솔리드 NaCl을 사용하여 601 DNA를 2M TE 버퍼로 조정합니다. 0.85:1 ~0.90:1의 어금니 비율로 히스톤 옥타머에 2M TE 버퍼로 601 DNA를 추가합니다. 무료 DNA가 젤 시프트 분석에 존재하는 경우 DNA의 낮은 비율이 추가될 수 있다.</li>
	<li>DNA-히스톤 혼합물을 투석 봉투를 옮기고 약 200mL의 2M TE 버퍼(또는 여러 샘플을 조립하는 경우) 4°C에서 매우 부드럽게 저어줍니다.</li>
	<li>연동 펌프를 설정하여 소금 TE 버퍼없이 천천히 떨어 뜨립니다. 볼륨이 약 두 배가되면 볼륨의 절반을 부어 넣습니다. 총 4회 이상 이 작업을 수행합니다. 펌프를 사용하면 시작 볼륨에 따라 4-8 h가 걸릴 수 있습니다. 핵소는 염분 농도가 150mMM로 감소될 때 형성됩니다(염도 계측기로 측정).</li>
	<li>염 농도가 150mM로 감소한 후 밤새 20mM TE 버퍼에 대해 투석한다.</li>
	<li>원심분리에 의한 침전을 제거하고 플레이트 판독기를 사용하여 A260 을 판독하여 뉴클레오좀의 농도를 측정한다.</li>
	<li>그의-TEV 프로테아제 (TEV를 추가 : 뉴클레오소1:30, w :w) 모든 히스티딘 태그를 제거하기 위해 4 ° C에서 하룻밤 배양. Ni-NTA 수지풀다운에 의한 뉴클레오소성 용액으로부터 히스티딘 태그 불순물을 제거합니다.</li>
	<li>뉴클레오좀을 배치하고 시료를 균질화하기 위해, 1 h에 대해 60°C에서 배양한다. 참고: 특히 불안정한 아세틸화된 사이트의 경우 이 단계를 권장하지 않을 수 있습니다.</li>
	<li>4°C에서 단기(몇 주)에 뉴클레오좀을 저장한다.</li>
	<li>장기 저장을 위해, 저장 버퍼에 대한 뉴클레오좀을 투석하고 -80 °C에 저장합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrrolysine+encoded+by+UAG+in+Archaea:+Charging+of+a+UAG-Decoding+specialized+tRNA.">Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding specialized tRNA.</a> Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).</li><li>Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. 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저자중 누구도 선언할 경쟁적인 재정적 이해관계는 없습니다.

실험 중에 이 프로토콜을 모든 세부 사항으로 따르는 것이 필수적입니다. 뉴클레오좀은 매우 안정적이지 않으며 많은 시행착오가 이 프로토콜을 결정하는 데 들어갔습니다. 미립자가 조립 공정을 쉽게 방해할 수 있기 때문에 모든 단계(또는 관찰 될 때마다)에서 침전을 제거하는 것이 중요합니다. 항상 얼음에 히스톤 샘플을 유지합니다. 뉴클레오좀이 너무 오래 4°C로 저장되면 자발적으로 분해?...

우리는 PylRS와 tRNAPyl을 사용하여 사이트 특정 아세틸화 히스톤으로 재구성된 단핵구를 합성하고 조립했습니다. PylRS는 포스트 번역 변형 (PTM)을 가진 단백질을 생성하는 유전 코드 확장 도구로 귀중한 입증하고 약 200 다른 ncAA를 통합하기 위해 유전적으로 진화되었습니다. PylRS는 호박색 정지 코돈에 통합되어 번역 중에 다른 아미노산에서 경쟁을 제거합니다. PylRS는 메탄원성 고고학에서 처음 발견되었으며, 이후 화학 생물학에서 새로운 반응성 화학 그룹을 단백질1,2에통합하는 데 활용되었습니다.
MmAcKRS1은 메타노사르키나 미제이 PylRS로부터 진화하고 아세틸화된 단백질3,4,5,6의합성을 위해 실험실에서 자주 사용되었다. MmAcKRS1은 대장균에서 번역하는 동안 선택되는 mRNA에 있는 호박색 돌연변이 부위에서 AcK를 전달한다. 이 기술은 이전에 K4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64, K79 히스톤 H3 리신 부위에 AcK를 통합하여 1, 2, 6, 7의 아세트 모노뉴클레오솜4,5,6의AcK를 통합하는 데 사용되었습니다. 여기서 우리는 아세틸화 된 히스톤을 발현하고 아세틸화 뉴클레오좀을 재구성하는이 방법을 자세히 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>0.5 M TE Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td></tr><tr><td>1 M TE Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td></tr><tr><td>100x TE Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>2 M TE Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td></tr><tr><td>20 mM TE Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td></tr><tr><td>6 M GuHCl</td><td></td><td></td><td>6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0</td></tr><tr><td>Acetyllysine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Column Wash Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8</td></tr><tr><td>Elution Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;Variable-Flow Chemical Transfer Pump</td><td>Fischer Scientific</td><td>15-077-67</td><td></td></tr><tr><td>His-TEV protease</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histone Lysis Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0</td></tr><tr><td>Ni-NTA Resin</td><td></td><td></td><td>6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8</td></tr><tr><td>PCR Clean-Up Kit</td><td>Epoch Life Sicences</td><td>2360050</td><td></td></tr><tr><td>Pellet Wash Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0</td></tr><tr><td>petDUET-His-SUMO-TEV-H4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H2A</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H2B</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pEVOL-AckRS</td><td>Addgene</td><td>137976</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-3z/601</td><td>Addgene</td><td>26656</td><td></td></tr><tr><td>Storage Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

site specific lysine acetylation of histones for nucleosome reconstitution using genetic code expansion in escherichia coli

아세틸화 히스톤 단백질은 돌연변이, N ε-아세틸-리신(AcK)-특이적 메타노사르시나 마지 피롤리신 tRNA-synthetase(MmAcKRS1) 및 그 코그네이트 tRNA(tRNAPyl)를결합하여 재구성한 단핵형 특이적 군수로 재구성할 수 있는 에셀리치아 대장균에서 용이하게 발현될 수 있다. MmAcKRS1 및 tRNAPyl은 대장균에서 번역하는 동안 선택되는 mRNA에 있는 황색 돌연변이 부위에서 AcK를 전달한다. 이 기술은 H3 lysine 사이트에 AcK를 통합하는 데 광범위하게 사용되었습니다. Pyrrolysyl-tRNA synthetase (PylRS)는 또한 사이트 특정 단백질 수정 또는 기능화를 위한 다른 비카노마이컬 아미노산(ncAA)을 통합하도록 쉽게 진화될 수 있다. 여기서 우리는 MmAcKRS1 시스템을 사용하여 AcK를 히스톤 H3에 통합하고 아세틸화 된 H3 단백질을 재구성 된 단핵구로 통합하는 방법을 자세히 설명합니다. 아세틸화 재구성 된 단핵구는 생화학 적 및 결합 적 반응, 구조 결정 등에 사용될 수 있습니다. 수정된 단핵구를 얻는 것은 새로운 상호 작용을 발견하고 후성 유전학을 이해하는 관련있는 실험을 디자인하기 위해 중요합니다.

디머, 테트라머 및 옥타머는 12% SDS PAGE젤(그림 1 및 도 2)을실행하여 평가할 수 있다. 여기서 당신은 아세틸화 테트라머중 일부가 다른 테트라머보다 낮은 수율을 가지고 있음을 알 수 있습니다(그림 1). 사실, 코어 영역에 가까울수록 수율이 낮아집니다. 이것은 가장 가능성이 있기 때문에 테트라머의 조립?...

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Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

여기서 우리는 유전 코드 확장을 사용하여 아세틸화 히스톤 단백질을 발현하고 체외에서 재구성된 뉴클레오좀을 조립하는 방법을 제시한다.

에체리치아 대장균의 유전코드 확장을 이용한 뉴클레오소성 재구성을 위한 히스톤의 특정 리신 아세틸화

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...

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Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Unit 1

Structure and Organization of DNA

SCIENTISTS IN ACTION

3.9K 조회수.  Texas A&M University. 여기서 우리는 유전 코드 확장을 사용하여 아세틸화 히스톤 단백질을 발현하고 체외에서 재구성된 뉴클레오좀을 조립하는 방법을 제시한다.

비디오: Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications (PTMs). They are newly identified species with unknown means of establishment and functional implications. Current analytical methods are inadequate to detect the copy-specific occurrence of PTMs on the nucleosomal sister histones. This protocol presents a biochemical method for the in vitro reconstitution of nucleosomes containing differentially isotope-labeled sister histones. The generated complex can be also asymmetrically modified, after including a premodified histone pool during refolding of histone subcomplexes. These asymmetric nucleosome preparations can be readily reacted with histone-modifying enzymes to study modification cross-talk mechanisms imposed by the asymmetrically pre-incorporated PTM using nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Particularly, the modification reactions in real-time can be mapped independently on the two sister histones by performing different types of NMR correlation experiments, tailored for the respective isotope type. This methodology provides the means to study crosstalk mechanisms that contribute to the formation and propagation of asymmetric PTM patterns on nucleosomal complexes.

This protocol describes the reconstitution of nucleosomes containing differentially isotope-labeled sister histones. At the same time, asymmetrically post-translationally modified nucleosomes can be generated after using a premodified histone copy. These preparations can be readily used to study modification crosstalk mechanisms, simultaneously on both sister histones, by using high-resolution NMR spectroscopy.

된 유의 동위 원소 표지 자매 히스톤과 뉴 클레오의 재구성

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

연구

생화학

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The mass production and distribution of antibodies specific to histone PTMs has greatly facilitated research on these marks. As histone PTM antibodies are key reagents for many chromatin biochemistry applications, rigorous analysis of antibody specificity is necessary for accurate data interpretation and continued progress in the field. This protocol describes an integrated pipeline for the design, fabrication and use of peptide microarrays for profiling the specificity of histone antibodies. The design and analysis aspects of this procedure are facilitated by ArrayNinja, an open-source and interactive software package we recently developed to streamline the customization of microarray print formats. This pipeline has been used to screen a large number of commercially available and widely used histone PTM antibodies, and data generated from these experiments are freely available through an online and expanding Histone Antibody Specificity Database. Beyond histones, the general methodology described herein can be applied broadly to the analysis of PTM-specific antibodies.

This manuscript describes methods for applying peptide microarray technology to specificity profiling of antibodies that recognize histones and their post-translational modifications.

펩티드 Microarrays를 가진 Histone 항체 특이성의 분석

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and reactive moieties onto proteins directly in the live cell. Each ncAA is incorporated by a dedicated orthogonal suppressor-tRNA/amino-acyl-tRNA-synthetase (AARS) pair that is imported into the host organism. The incorporation efficiency of different ncAAs can greatly differ, and be unsatisfactory in some cases. Orthogonal pairs can be improved by manipulating either the AARS or the tRNA. However, directed evolution of tRNA or AARS using large libraries and dead/alive selection methods are not feasible in mammalian cells. Here, a facile and robust fluorescence-based assay to evaluate the efficiency of orthogonal pairs in mammalian cells is presented. The assay allows screening tens to hundreds of AARS/tRNA variants with a moderate effort and within a reasonable time. Use of this assay to generate new tRNAs that significantly improve the efficiency of the pyrrolysine orthogonal system is described, along with the application of ncAAs to the study of G-protein coupled receptors (GPCRs), which are challenging objects for ncAA mutagenesis. First, by systematically incorporating a photo-crosslinking ncAA throughout the extracellular surface of a receptor, binding sites of different ligands on the intact receptor are mapped directly in the live cell. Second, by incorporating last-generation ncAAs into a GPCR, ultrafast catalyst-free receptor labeling with a fluorescent dye is demonstrated, which exploits bioorthogonal strain-promoted inverse Diels Alder cycloaddition (SPIEDAC) on the live cell. As ncAAs can be generally applied to any protein independently on its size, the method is of general interest for a number of applications. In addition, ncAA incorporation does not require any special equipment and is easily performed in standard biochemistry labs.

A facile fluorescence assay is presented to evaluate the efficiency of amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA pairs incorporating non-canonical amino-acids (ncAAs) into proteins expressed in mammalian cells. The application of ncAAs to study G-protein coupled receptors (GPCRs) is described, including photo-crosslinking mapping of binding sites and bioorthogonal GPCR labeling on live cells.

사진-가교 매핑 및 라이브 포유류 세포에서 Bioorthogonal 화학 GPCRs에 프로브 화학의 유전 결합을 최적화

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and ...

화학

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

엘리사에 의해 네이티브 손상 Nucleosomes에 포스트 translational 수정의 감지

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

생물학

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

세포질 기계 화학 Epigenetic 한정자를 리디렉션하여 억압 유전자 전사

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

생체공학

<meta charset="utf8"></head><body>단일 분자 연구를 위한 현장 뉴클레오솜 재구성

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding their biophysical properties and interactions with chromatin-binding proteins. Nucleosome reconstitution on DNA for these studies typically involves a salt dialysis procedure that provides precise control over the placement and number of nucleosomes formed along a DNA tether. However, this protocol is time-consuming and requires a substantial amount of DNA and histone octamers as inputs. To offer an alternative strategy, an in situ nucleosome reconstitution method for single-molecule force and fluorescence microscopy that utilizes the histone chaperone Nap1 is described. This method enables users to assemble nucleosomes on any DNA template without the need for strong nucleosome positioning sequences, adjust nucleosome density on demand, and use fewer reagents. In situ nucleosome formation occurs within seconds, offering a simpler experimental workflow and a convenient transition into single-molecule measurements. Examples of two downstream assays for probing nucleosome mechanics and visualizing the behavior of individual proteins on chromatin are further described.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Efficient Nucleosome Reconstitution for Single-Molecule Techniques

This article presents a detailed experimental procedure for reconstituting nucleosome-containing DNA tethers for single-molecule correlative force and fluorescence microscopy. It further describes several downstream experiments that can be conducted to visualize the binding behavior of chromatin-interacting proteins and analyze changes in the physical properties of nucleosomes.

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. Among them, reversible lysine acetylation is one of the most widely distributed in all domains of life. Although numerous mass spectrometry-based acetylome studies have been performed, further characterization of these putative acetylation targets has been limited. One possible reason is that it is difficult to generate purely acetylated proteins at desired positions by most classic biochemical approaches. To overcome this challenge, the genetic code expansion technique has been applied to use the pair of an engineered pyrrolysyl-tRNA synthetase variant, and its cognate tRNA from Methanosarcinaceae species, to direct the cotranslational incorporation of acetyllysine at the specific site in the protein of interest. After first application in the study of histone acetylation, this approach has facilitated acetylation studies on a variety of proteins. In this work, we demonstrated a facile protocol to produce site-specifically acetylated proteins by using the model bacterium Escherichia coli as the host. Malate dehydrogenase was used as a demonstration example in this work.

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Genetic code expansion serves as a powerful tool to study a wide range of biological processes, including protein acetylation. Here we demonstrate a facile protocol to exploit this technique for generating homogeneously acetylated proteins at specific sites in Escherichia coli cells.

Site-Specifically 생성 하는 손쉬운 프로토콜 Acetylated 대장균 에서 단백질

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

면역학 및 감염병학

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small molecule studies and drug development 4. Many epigenetic regulators have only recently been discovered and are still in the process of being classified. Among these enzymes are lysine demethylases which remove methyl groups from lysines on histones and other proteins. Due to the novel nature of this class of enzymes, few assays have been developed to study their activity. This has been a road block to both the classification and high throughput study of histone demethylases. Currently, very few demethylase assays exist. Those that do exist tend to be qualitative in nature and cannot simultaneously discern between the different lysine methylation states (un-, mono-, di- and tri-). Mass spectrometry is commonly used to determine demethylase activity but current mass spectrometric assays do not address whether differentially methylated peptides ionize differently. Differential ionization of methylated peptides makes comparing methylation states difficult and certainly not quantitative (Figure 1A). Thus available assays are not optimized for the comprehensive analysis of demethylase activity.
Here we describe a method called MassSQUIRM (mass spectrometric quantitation using isotopic reductive methylation) that is based on reductive methylation of amine groups with deuterated formaldehyde to force all lysines to be di-methylated, thus making them essentially the same chemical species and therefore ionize the same (Figure 1B). The only chemical difference following the reductive methylation is hydrogen and deuterium, which does not affect MALDI ionization efficiencies. The MassSQUIRM assay is specific for demethylase reaction products with un-, mono- or di-methylated lysines. The assay is also applicable to lysine methyltransferases giving the same reaction products. Here, we use a combination of reductive methylation chemistry and MALDI mass spectrometry to measure the activity of LSD1, a lysine demethylase capable of removing di- and mono-methyl groups, on a synthetic peptide substrate 5. This assay is simple and easily amenable to any lab with access to a MALDI mass spectrometer in lab or through a proteomics facility. The assay has ~8-fold dynamic range and is readily scalable to plate format 5.

We present a method for using MALDI mass spectrometry and reductive methylation chemistry to quantify changes in lysine methylation.

라이신 Demethylase 활동의 양적 측정을위한 MassSQUIRM의 응용

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

에체리치아 대장균의 유전코드 확장을 이용한 뉴클레오소성 재구성을 위한 히스톤의 특정 리신 아세틸화

요약

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된 유의 동위 원소 표지 자매 히스톤과 뉴 클레오의 재구성

펩티드 Microarrays를 가진 Histone 항체 특이성의 분석

사진-가교 매핑 및 라이브 포유류 세포에서 Bioorthogonal 화학 GPCRs에 프로브 화학의 유전 결합을 최적화

엘리사에 의해 네이티브 손상 Nucleosomes에 포스트 translational 수정의 감지

세포질 기계 화학 Epigenetic 한정자를 리디렉션하여 억압 유전자 전사

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

Site-Specifically 생성 하는 손쉬운 프로토콜 Acetylated 대장균 에서 단백질

라이신 Demethylase 활동의 양적 측정을위한 MassSQUIRM의 응용