이 프로토콜은 랑거한스의 췌장 섬 내의 작은 하위 집단의 급속한 격리된 기능을 허용합니다. 이 기술의 장점은 실시간 특성과 높은 통계적 능력, 따라서 획득 된 데이터의 높은 재현성을 포함한다. 이미징을 위한 섬을 고정하려면 반전된 현미경을 위해 이미징 챔버를 조립하고 챔버 내부에 유리 커버 슬립을 놓습니다.
유리 챔버 인터페이스가 방수되어 있는지 확인하고 커버 슬립이 현미경 목표의 범위 내에 있는지 확인하십시오. 다음으로, 20mm의 미세하고 거친 메쉬를 20mm 로 자르고 45 ~ 50 마이크로 미터의 두꺼운 끈적 끈적한 테이프를 사용하여 미세 한 메쉬 조각에 두 개의 스페이서 벽을 만듭니다. 거친 메쉬와 무게를 35mm 페트리 의 이미징 용액에 담그고 미세 메쉬를 해부 현미경 아래에 놓습니다.
스페이서 벽을 거꾸로 놓고 스페이서가 위쪽으로 향하는 미세한 메시를 켭니다. 그리고 p20 파이펫을 사용하여 두 스페이서 사이에 여러 개의 섬을 전송합니다. 워치메이커의 집게를 사용하여, 반전된 현미경의 이미징 챔버 내부에 메쉬를 거꾸로 놓고 스페이서가 챔버 커버 슬립에 직접 앉도록 하여 커버 슬립의 중간에 있는 스페이서와 메쉬 사이의 섬을 트래핑합니다.
메쉬가 샘플의 측면 움직임을 유발하는 과도한 양의 용액을 포함하지 않고 잘 수화된다는 것을 주의하십시오. 그런 다음 거친 메쉬와 체밀을 챔버의 미세 메시 위에 놓고 이미징 솔루션을 챔버에 추가합니다. 섬이 고정되면 반전 된 현미경에서 이미징 모드와 목표를 선택하고 현미경의 온도 제어 단계에 섬이있는 챔버를 배치하십시오.
관류를 설정한 후, 챔버 내의 유출보다 유입흐름을 낮게 배치하고 유출 흐름이 유입 유동성보다 더 큰 것으로 설정한다. 유출이 솔루션과 최소한의 접촉을 가지고 있는지 확인하여 여러 순차적 작은 물방울로 솔루션을 제거하여 연속 솔루션 제거의 긴 간격을 피하십시오. 다음으로, 3개의 밀리몰라 포도당을 포함하는 화상 진찰 용액으로 관류를 시작하고, 화상 진찰 녹색 형광을 위한 광 경로 및 필터를 선택합니다.
그런 다음 라이브 이미징을 실행하여 이미징 매개 변수를 설정하고 뷰를 조정하여 관심 있는 섬을 캡처합니다. 이미지의 신호 대 잡음 비율을 최적화하려면 흥분 광 강도, 노출 시간 및 비닝을 조정하여 설정이 가능한 최소 광 강도 및 노출로 섬 내각 셀의 고유한 시각화를 허용하도록 합니다. 그런 다음 섬을 0.1에서 5 헤르츠로 이미지하여 캡처할 때 획득된 데이터의 품질을 확인합니다.
알파 셀 활성이 감지가능한 경우, 획득 소프트웨어 내에서 신호 역학의 온라인 차트를 사용하고 2~5분 동안 어드렌랄린 또는 글루타메이트를 목욕 용액에 추가한다. 칼슘의 급속한 점프는 알파 세포 진동의 둔화 또는 취소에 선행될 것입니다. 다음으로, 최근에 델타 세포를 선택적으로 활성화시키는 것으로 보고된 ghrelin을 추가합니다.
칼슘의 급속한 가역적 증가는 작은 아혈구 세포에서 관찰될 것이다. 그런 다음 10 밀리몰러 포도당을 추가합니다. 베타 세포 하위 집단에서 조정된 진동 반응이 관찰될 것이다.
또한 이전에 아드레날린이나 글루타민산염 및 그렐린에 의해 활성화된 세포의 반응에 유의하십시오. 이미지를 저장한 후 데이터를 적절한 데이터 분석 소프트웨어 프로그램으로 가져오고 원시 형광 강도 데이터를 형광의 초기 값으로 정규화합니다. 셀에서 세포형광 강도 데이터 세트가 여전히 상당한 경우 제어 솔루션이 적용된 시간 범위에 대한 제어 영역을 정의합니다.
제어 영역에 명확한 비 진동 신호가 있는 경우, 제어 솔루션의 각 적용 후 형광 강도가 기준선으로 반환된다고 가정한다. 각 셀의 시간 경과 데이터를 수정하려면 제어 솔루션이 추가된 점으로 분리된 세그먼트로 데이터를 분할하고 각 세그먼트에 선형 보정을 적용합니다. 제어 범위에 명확한 진동이 있거나 추가 요인이 있는 경우 스파이크 감지 알고리즘을 사용합니다.
칼슘 스파이크의 빈도와 작용제 및 길항제의 첨가에 대한 반응을 측정하기 위해, 기록을 동일한 시간 간격으로 나누고, 간격 내에서 스파이크를 계산하고, 간격 으로 정규화하여 부분 주파수의 시간 과정을 계산합니다. 또는 임계값을 설정하고 각 간격에 대해 고원 분획을 계산합니다. 분획은 셀이 흥분된 상태에서 소비한 간격 내의 시간 백분율을 나타냅니다.
또는 각 간격에 대해 곡선 아래의 부분 영역을 계산합니다. 멤브레인의 지질 조성이 영향을받지 않는 한, 섬은 열대 염료와 상당히 잘 로드됩니다. 인간 아데노바이러스 형 5 벡터는 또한 성공적으로 섬 세포를 대상으로합니다.
알파 세포에서 칼슘 스파이크는 낮은 포도당 수준에서 쉽게 검출될 수 있고, 낮은 포도당에서 활동과 아드레날린과 글루타민에 대한 반응 사이에 높은 세포별 상관관계가 있다. Ghrelin은 낮은 포도당에서 몇몇 아드레날린 반응성 세포를 활성화합니다 그러나 낮은 포도당에 의해 활성화되는 세포의 대부분에 있는 칼슘 역학에 영향을 미치지 않습니다. 부분 주파수의 관점에서 분석할 때, 아드레날린 또는 그렐린 자극 세포는 기저 스파이크와 아드레날린 효과 사이의 전반적인 변화가 미묘하지만, 전부 또는 전혀 조건하에서 상당한 증가를 표시합니다.
대조적으로, 곡선 아래의 부분 영역은 기저 활동이 높은 경우에도 모든 세포에서 아드레날린에 의해 도입된 변화에 민감하다. 모든 메쉬가 이미징 솔루션과 접촉하고 기포를 피하기 위해 조직을 합리적으로 조밀하게 배치하도록 주의하십시오. 상기 방법은 세포 유형 간의 분화를 위한 인공 지능을 포함하도록 확장될 수 있다.
약리학적 마커는 패턴 인식 기술로 대체되어 기록 시간을 줄일 수 있다.
