이것은 세포 간 칼슘 신호의 연구를 위한 1 차적인 두뇌 pericytes를 격리하고 배양하기 위한 간단하고 효과적인 방법입니다. 얻은 세포 배양은 pericytes의 거의 균질한 인구이고, 칼슘 화상 진찰을 위한 pericytes를 로드하는 것은 간단합니다. 여기에 설명된 방법은 pericyte 생물학을 공부하기 위한 강한 공구를 필드에 있는 그밖 연구원을 제공해야 합니다, 그리고 체외에 있는 pericytes에 있는 세포내 신호.
37도 의 수조에서 모세 혈관 의 유리병을 해동하여 시작합니다. 모세혈관이 해동되면 DMEM 콤프 30밀리리터가 있는 원심분리기로 옮기고, 500회 G.Then에서 5분간 원심분리하고, 튜브에서 배지를 제거하고, 신선한 DMEM 컴포지션10밀리리터에서 팔레트를 다시 일시 중단합니다. 서스펜션을 코팅된 T-75 플라스크로 옮기고, 모세혈관이 10%의 이산화탄소를 공급하는 섭씨 37도에서 4~6시간 동안 바닥에 부착할 수 있도록 한다.
인큐베이션 후, 가벼운 현미경으로 플라스크를 검사합니다. 모세혈관의 분수는 이제 플라스크 의 바닥에 부착되어야 합니다. 모세 혈관을 시드 한 후 4 일째에 현미경으로 검사하여 약 60 ~ 70 %의 컨할 수 있는지 확인하십시오.
매체를 흡인하고 PBS로 셀을 부드럽게 씻으십시오. 해동 트립신-EDTA의 2 밀리리터를 추가하고, 1~ 3분 동안 인큐베이터에 플라스크를 두고 플라스크를 자주 꺼내 현미경으로 세포 분리를 관찰합니다. 내피 세포가 반올림하기 시작하면 플라스크를 부드럽게 눌러 분리합니다.
세포가 분리되면 플라스크에 DMEM 컴프 10 밀리리터를 추가하여 트립시화를 중지하십시오. 플라스크를 배지로 몇 번 플러시하고, 현재 다른 목적을 위해 사용될 수 있는 내피 세포 현탁액을 흡인한다. 플라스크에 DMEM 컴포지션 10밀리리터를 추가하고, 백혈구가 여전히 존재하고 바닥에 부착되어 있는지 확인하기 위해 가벼운 현미경으로 확인하십시오.
그런 다음 플라스크를 인큐베이터에 다시 넣어 백혈구가 풍부한 문화가 성장할 수 있도록 합니다. 옷자위가 코팅된 96웰 플레이트에 씨앗을 뿌리려면 텍스트 원고에 설명된 대로 분리합니다. 매체를 흡인시키고, 세포 펠릿을 방해하지 않도록 주의하고, 신선한 DMEM 컴포지션의 1 밀리리터로 펠릿을 다시 중단한다.
카운팅 챔버를 사용하여 세포를 계산한 다음 각 웰에 잘 첨가해야 하는 현탁액의 부피를 잘 10, 000 세포에 계산합니다. 셀 서스펜션을 추가한 다음 세포에 충분한 DMEM 콤프를 추가하여 우물당 200 마이크로리터의 총 부피를 달성합니다. 후라-2 AM 칼슘 표시기 염료로 pericytes를 로드할 준비가 되면, 인큐베이터에서 세포를 사용하여 96웰 플레이트를 꺼내 우물에서 배지를 흡인하십시오.
분석 버퍼로 셀을 두 번 세척하고 각 웰에 100 마이크로 리터의 적재 용액을 추가합니다. 사진 표백을 피하기 위해 tinfoil로 접시를 감싸고 실온에서 30 RPM이 흔들리면서 45 분 동안 배양하십시오. 인큐베이션 후, 적재 버퍼를 흡인하고, 분석 버퍼로 셀을 두 번 세척한다.
분석 버퍼에 신선한 100 마이크로 리터를 추가하고 30 분 동안 배양하기 위해 세포를 둡니다. 인큐베이션 후 플레이트 판독기의 온도를 섭씨 37도로 설정하고, 세포와 함께 96웰 플레이트를 샘플 플레이트 위치로 옮춘 다음 시약 판 위치에 고약성으로 시약 플레이트를 배치합니다. 모든 우물에서 Fura-2 AM의 동등한 하중을 보장하기 위해 세포의 하중을 측정한 다음 340 ~380 나노미터의 발산 형광 파장 및 510 나노미터에서 방출 파장을 사용하여 측정을 수행하십시오.
시약 플레이트에서 세포와 잘 각 잘에 초당 150 마이크로 리터의 속도로, 고뇌의 50 마이크로 리터를 추가합니다. 커버를 셀 챔버에 넣고 누수를 피하기 위해 덮을 수 있습니다. DMEM 컴포지션과 계산된 셀 현탁액을 각 챔버에 추가하여 500 마이크로리터의 최종 부피를 위해 추가합니다.
세포실을 섭씨 37도, 이산화탄소 10%에서 6일 간 또는 컨할 때까지 배양합니다. 세포가 컨실루션되면 세포 챔버를 인큐베이터에서 꺼내 배지를 흡인하십시오. 분석 버퍼로 셀을 두 번 세척하고 각 챔버에 500 마이크로 리터의 적재 버퍼를 추가 한 다음 실온에서 45 분 동안 배양하십시오.
인큐베이션 후, 적재 버퍼를 흡습하고, 분석 버퍼로 세포를 두 번 세척한 다음, 각 챔버에 500 마이크로리터의 신선한 분석 버퍼를 추가하고 AM 에스테르의 분열을 허용하기 위해 실온에서 또 다른 30 분 동안 배양합니다. 버퍼를 500 마이크로리터의 신선한 분석 버퍼로 대체하고 공초점 현미경으로 라이브 이미징을 진행합니다. 세포의 교란을 피하기 위해 현미경의 단계에 세포 챔버를 가능한 한 부드럽게 마운트하십시오.
488 나노미터에서 발산 파장을 설정하고, 515 나노미터에서 방출하고, 5초 간격으로 2분 순차적 이미지 수집, x, y 이미지 크기 512 x 512 픽셀을 설정합니다. 셀 챔버에 100 밀리머 ATP의 300 마이크로 리터를 추가하고 이미지 수집을 시작합니다. 이 프로토콜은 소 뇌 모세 혈관에서 pericytes를 정화하는 데 사용되었다.
종자 모세 혈관에서 세포 밖으로 성장 9 일 동안 이미지되었다. 모세혈관은 첫날 플라스크에 완전히 부착되었고, 둘째 날부터 내피 발아가 보였다. 4 일 후, 세포 아웃 성장 특유의, 그리고 내 피 세포를 트립시화를 통해 제거 되었다.
모세혈관의 잔해는 트립시화 후 존재했지만, 다음 날 플라스크에서 사라졌다. 내피층을 제거한 후, 회칙은 수렴성까지 자랄 수 있었다. 9일째에는 약 80%의 수렴률을 기록하며 섬을 형성했다.
후라-2 하중 pericytes에 ATP를 첨가하면 세포칼슘 수치가 증가했습니다. 응답은 PERICYtes에 ATP를 첨가한 직후 발생했으며 측정된 기간 동안 천천히 감소했습니다. 칼슘 반응은 또한 실시간 공초점 화상 진찰로 측정되었습니다.
기준형 형광을 측정한 다음 ATP가 64초에 추가되었고, 세포내 칼슘 반응이 뚜렷하게 나타났다. 얼마 지나지 않아 세포에서 구획화된 세포균칼슘이 보였고, 세포 영역의 감소가 보였다. 300초까지 세포 영역이 크게 감소했고 형광은 기준선 수준으로 거의 감소했습니다.
이 방법은 1 차뇌 모세관 pericytes에서 첫 번째 세포 내 칼슘 측정을 얻기 위해 사용되어, pericytes가 ATP를 통해 자극되고, 체외에서 계약할 수 있다는 것을 보여줍니다.
